卡拉膠寡糖對冷凍南美白對蝦的抗凍保水作用

吳海瀟，張 賓,*，史周榮，房傳棟，鄒俊杰，李海波

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022；2.浙江國際海運職業技術學院，浙江 舟山 316022）

卡拉膠寡糖對冷凍南美白對蝦的抗凍保水作用

吳海瀟1，張 賓1,*，史周榮1，房傳棟1，鄒俊杰1，李海波2

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022；2.浙江國際海運職業技術學院，浙江 舟山 316022）

目的：研發冷凍南美白對蝦蝦仁的抗凍保水劑并探索其應用效果。方法：以冷凍蝦仁解凍損失率、明度、pH值、肌原纖維蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、彈性和咀嚼性為評價指標，以焦磷酸鈉為陽性對照，研究卡拉膠寡糖對冷凍蝦仁的抗凍保水效果及微觀組織結構的影響情況。結果：卡拉膠寡糖和焦磷酸鈉浸泡處理能有效抑制冷凍蝦仁解凍損失率的增加，減少肌原纖維蛋白含量和Ca2+-ATPase活性的下降，對蝦仁pH值、明度和質構特性的保護效果顯著，且3 g/100 mL處理組的保護效果整體高于1 g/100 mL處理組；同時，3 g/100 mL卡拉膠寡糖處理對蝦仁肌原纖維蛋白的保護效果顯著高于3 g/100 mL焦磷酸鈉處理（P＜0.05）；微觀結構觀察發現，凍藏6 周后，3 g/100 mL卡拉膠寡糖處理組蝦仁肌纖維排列緊密，完整性較好，與新鮮冷凍蝦仁組織結構較為相近。結論：3 g/100 mL卡拉膠寡糖浸泡處理有利于冷凍蝦仁品質的保持。研究結果可為開發一種低甜味、低熱量的蝦仁抗凍劑提供參考。

南美白對蝦；抗凍；保水；焦磷酸鈉；卡拉膠寡糖

南美白對蝦（Litopenaeus vannamei），學名凡納濱對蝦，是世界對蝦養殖中產量較高的三大優良蝦種之一，同時也是目前養殖對蝦中單產量最高的蝦種。南美白對蝦肉質細嫩、鮮美，營養豐富，但其水分含量較高，在酶和微生物的作用下易發生劣變。冷凍保藏可最大限度地保持南美白對蝦的營養價值，但凍藏過程中產生的冰晶，易使肌肉細胞受損、蛋白質變性，增加解凍時的汁液損失，導致其風味和營養價值下降[1]。

抗凍劑的添加可有效抑制冷凍水產品中冰晶的生長、減少蛋白質的冷凍變性、降低凍藏對肌肉品質造成的影響[2]。糖類物質作為抗凍劑被廣泛應用于冷凍水產品中，其作用機理是糖類可改變包埋在蛋白質分子中結合水的狀態，取代蛋白質分子表面的結合水并與之結合，從而達到抑制蛋白質變性的效果[3]。水產品加工業中，常以山梨醇和蔗糖的混合物為抗凍劑，以抑制水產品蛋白質的冷凍變性，但其甜味和熱量相對較高，在一定程度上影響了產品的風味和營養價值[4]。目前，低甜味、低熱量的新型抗凍劑開發已成為國內外的研究熱點，如海藻糖、乳糖醇及低聚木糖等的應用已見報道[5-7]。

卡拉膠（carrageenan），是從紅藻中提取的一種天然硫酸多糖類化合物，由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-β-D-吡喃半乳糖作為基本骨架交替連接而成，其具有優良的成膜性、凝膠性及增稠性，已被廣泛應用于食品、醫藥及化工等各個領域[8]?？ɡz具有有較強的保水性，能與蛋白質聚集形成蛋白質膠束，以減少肉制品蒸煮損失，從而提高產品的穩定性，增加出品率[9]。于建行等[10]研究發現卡拉膠能有效減少PSE（發白、松軟、易析水，pale，soft，exudative）兔肉糜的蒸煮損失。汪星星等[11]發現卡拉膠作為抗凍劑，添加到面團中能有效減緩冰晶對面筋蛋白的破壞作用?？ɡz寡糖是卡拉膠的降解產物，其分子質量較小、溶解性好、穩定性和安全性有所改善，同時具有甜度低、熱量小等特點，在生物醫藥領域已表現出良好的應用前景[12-13]。Yamada等[14]研究發現，降解和硫酸酯化后得到的卡拉膠寡糖抗艾滋病病毒活性顯著增強。此外，卡拉膠寡糖在抗氧化、防輻射及抗腫瘤等方面也具有重要的生理活性[15-17]。目前，將卡拉膠寡糖作為抗凍保水劑應用于冷凍水產品的研究鮮見報道。

本實驗以冷凍南美白對蝦蝦仁為研究對象，評價卡拉膠寡糖對冷凍蝦仁的抗凍保水效果及影響機制，以期減少冷凍南美白對蝦的汁液損失，保障產品品質，從而為冷凍水產品新型抗凍保水劑的開發及應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活南美白對蝦（體長9～10 cm），購自浙江舟山老碶菜場，置于保溫箱內，30 min內運至實驗室?？ɡz寡糖（分子質量小于3 000 D，食品級）、焦磷酸鈉（含量大于99%，食品級） 青島博智匯力生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MDF-U53V型超低溫冰箱 日本Sanyo公司；CR-10型便攜式色差儀 日本柯尼卡美能達公司；TMS-Pro物性測試儀 美國FTC公司；751UVGD型紫外-可見分光光度計 上海第三分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗處理與分組

1.3.1.1 處理過程

在0～4 ℃條件下，將南美白對蝦進行清洗，去頭、尾及殼，選取大小均一的完整蝦仁個體，瀝干并用紗布拭干水分，在4 ℃溶液中浸泡2 h，每隔20 min攪拌1 次，再次瀝干并用紗布拭干水分，稱質量記為m1（精確至0.001 g，下同）。將蝦仁于-18 ℃條件下進行凍藏保存，每隔7 d取樣1次。取樣蝦仁在室溫條件下解凍2 h，紗布拭干水分，稱質量記為m2。按下式計算蝦仁解凍損失率。

1.3.1.2 實驗分組

1組：蒸餾水浸泡組（空白對照）；2組：1.0 g/100 mL和3.0 g/100 mL卡拉膠寡糖溶液浸泡組；3組：1.0 g/100 mL和3.0 g/100 mL焦磷酸鈉溶液浸泡組（陽性對照）。前期實驗發現，卡拉膠溶液處理對冷凍蝦仁未起到顯著的抗凍保水作用，因此本實驗中未設置卡拉膠對照處理組。

1.3.2 色差值測定

以蝦仁第2腹節為測試點，用CR-10型色差儀測定蝦仁的L*（明度）值。每個處理組測定5 個樣品，取平均值來反應樣品的色差值。

1.3.3 質構特性測定

采用TMS-PRO物性分析儀，測定蝦體背部第2節肌肉質構特性分析（texture profile analysis，TPA）。測定參數：P/0.5柱形探頭，測試速率1.0 mm/s，樣品壓縮形變量30%。每個處理組測定5 個樣品，取平均值來反映樣品的質構特性。

1.3.4 pH值測定

[18]，稱取蝦仁樣品5.0 g于燒杯中，加入45 mL的蒸餾水，高速均質1 min后，靜置30 min，過濾，PHS-25型酸度計測定濾液pH值。

1.3.5 肌原纖維蛋白含量測定

參考文獻[19]，稱取蝦仁樣品5.0 g，切碎后加入10 倍量的Tris-順丁烯二酸緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0，含0.05 mol/L KCl），20 000 r/min均質1 min，然后10 000 r/min低溫（4 ℃）離心15 min。沉淀加入10 倍量Tris-順丁烯二酸緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0，含0.6 mol/L KCl），勻漿1 min后4 ℃條件下提取l h，然后9 000 r/min低溫（4 ℃）離心10 min，上清液即為肌原纖維蛋白溶液。雙縮脲法測定其蛋白質含量。

1.3.6 肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性測定

Ca2+-ATPase 活性采用南京建成生物工程研究所提供的測試盒進行測定。

1.3.7 蘇木精-伊紅染色分析

參考文獻[20]，以新鮮蝦仁（0 周），凍藏6 周后的蒸餾水組、3.0 g/100 mL卡拉膠寡糖組、3.0 g/100 mL焦磷酸鈉組蝦仁為實驗對象，固定蝦仁背部第2節肌肉，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后觀察其肌肉組織微觀結構。

1.4 數據分析

首先，我國著作權法明確規定了不受著作權法保護的對象包括：思想、操作方法、技術方案和實用功能、事實及對事實無獨創性的匯編、官方文件和正式譯文等。? 王遷著：《著作權法》，中國人民大學出版社2015年版，第39-74頁。因此，只要未經許可演繹成果不屬于上述情形即可。

采用Origin 8.1、SPSS 13.0軟件進行作圖及數據分析，結果表示為s（采用SNK法分析測驗顯著性水平，P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同抗凍劑處理對冷凍蝦仁解凍損失率的影響

圖1 不同浸泡處理對冷凍蝦仁解凍損失率的影響Fig. 1 Effects of different soaking treatments on the thawing loss of frozen shrimps

由圖1可知，在0～1 周凍藏期內，不同處理組冷凍蝦仁解凍損失率變化顯著（P＜0.05）；隨凍藏時間的延長（3～6 周），解凍損失率呈上升趨勢，但變化幅度不大。凍藏6 周后，蒸餾水處理組蝦仁的汁液流失程度最大，解凍損失率達12.8%。而卡拉膠寡糖和焦磷酸鈉浸泡處理，顯著降低了冷凍蝦仁的解凍損失率（P＜0.05），且3.0 g/100 mL高質量濃度浸泡處理組效果均優于1 g/100 mL低質量濃度處理組；凍藏6 周后，卡拉膠寡糖和焦磷酸鈉處理組蝦仁的解凍損失率僅為7.6%～9.1%和4.4%～9.9%。研究表明，糖類提高冷凍蝦仁保水性的作用機理，可能為糖類的游離羥基可加強自由水轉化為束縛水的能力，降低“共晶點”溫度，減少冰晶體的形成量，形成一個不完全凍結區域，減緩蛋白質分子間的互相聚集，進而防止了肌肉蛋白質的凝聚變性[21]。

2.2 不同抗凍劑處理對冷凍蝦仁pH值的影響

圖2 不同浸泡處理對冷凍蝦仁pH值的影響Fig. 2 Effects of different soaking treatments on the pH of frozen shrimps

由圖2可知，新鮮蝦仁肌肉pH值為6.90。凍藏0～1 周，1 g/100 mL和3 g/100 mL焦磷酸鈉處理蝦仁肌肉pH值出現一定程度的上升（pH 0.12～0.19），其原因可能是由于焦磷酸鈉溶液呈堿性，致使浸泡后蝦仁肌肉pH值略有增加[22]。凍藏3～6 周，各處理組蝦仁pH值呈明顯上升趨勢，可能是由于凍藏蝦仁蛋白質及脂類發生氧化作用而生成產物所致；此外，部分嗜冷微生物的代謝作用，也致使少部分蛋白質及氨基酸發生降解產生少量堿性物質[23-24]。凍藏6 周后，蒸餾水處理組蝦仁肌肉pH值達7.52，顯著高于其他各處理組（P＜0.05），并接近Shamshad等[23]提出的可接受臨界值。

2.3 不同抗凍劑處理對冷凍蝦仁L*值的影響

*值的影響Fig. 3 Effects of different soaking treatments on the L* value of frozen shrimps圖3 不同浸泡處理對冷凍蝦仁L

色澤是評價蝦仁物理品質的重要指標，也是影響消費者購買力的重要因素。本實驗中，解凍后的南美白對蝦蝦仁發白、略紅，彩色色差較一致，所以選擇L*值作為蝦仁色澤的評價指標[25]。由圖3可知，新鮮蝦仁L*值為44.3；凍藏6 周后，各處理組L*值從小到大依次為3 g/100 mL卡拉膠寡糖（45.92）、1 g/100 mL卡拉膠寡糖（46.94）、3 g/100 mL焦磷酸鈉（47.51）、1 g/100 mL焦磷酸鈉（47.94）和蒸餾水（48.81）。蝦仁L*值升高主要是因為冷凍過程中形成的冰晶改變了肌肉的持水性，導致解凍后蝦仁表面的游離水增多，從而提高了對光的反射效果[26]。在各浸泡處理組中，3 g/100 mL卡拉膠寡糖處理蝦仁的L*值增加幅度最小，說明該處理組蝦仁肌肉組織內的冰晶損傷較小，即3 g/100 mL卡拉膠寡糖能有效減少凍藏過程中冰晶對細胞膜的機械損傷作用。

圖4 不同浸泡處理對冷凍蝦仁彈性（A）、咀嚼性（B）的影響Fig. 4 Effects of different soaking treatments on the springiness (A) and chewiness (B) of frozen shrimps

由圖4可知，隨凍藏時間的延長，不同處理組蝦仁的彈性和咀嚼性均呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。凍藏6 周后，卡拉膠寡糖和焦磷酸鈉處理組蝦仁的彈性均顯著優于蒸餾水處理組（P＜0.05），其中3 g/100 mL卡拉膠寡糖和3 g/100 mL焦磷酸鈉處理組蝦仁，彈性值分別為1.36 mm和1.34 mm，二者無顯著性差異（P＞0.05）。另外，隨著凍藏時間的延長，蝦仁肌肉的組織結構被破壞，也導致咀嚼性不斷下降；凍藏6 周后，卡拉膠寡糖和焦磷酸鈉浸泡處理的蝦仁咀嚼性均優于蒸餾水處理組（7.21 mJ），其中以3 g/100 mL卡拉膠寡糖（8.43 mJ）和3 g/100 mL焦磷酸鈉（8.14 mJ）處理效果最佳。研究發現，蝦仁貯藏過程中品質的劣變與蛋白質降解所引起的空間結構破壞有關[27]。本實驗中，卡拉膠寡糖及焦磷酸鈉的添加在一定程度上延緩了肌肉蛋白質的冷凍變性，進而減小了質構品質的下降程度。

2.5 不同抗凍劑處理對冷凍蝦仁肌原纖維蛋白含量的影響

從圖5可以看出，新鮮蝦仁肌原纖維蛋白含量為129.78 mg/g；隨凍藏時間的延長，不同處理組蝦仁的肌原纖維蛋白含量均呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。凍藏6 周后，蒸餾水處理組肌原纖維蛋白含量為98.21 mg/g，顯著低于其他處理組（P＜0.05）；1 g/100 mL卡拉膠寡糖和1 g/100 mL焦磷酸鈉處理組蝦仁肌原纖維含量分別為104.03 mg/g和104.86 mg/g，二者無顯著性差異（P＞0.05）。3 g/100 mL卡拉膠寡糖和3 g/100 mL焦磷酸鈉處理對肌原纖維蛋白含量的保持作用顯著（P＜0.05）；凍藏6 周后，蝦仁肌原纖維蛋白含量分別為111.32 mg/g和107.97 mg/g。研究表明，凍藏過程中肌原纖維蛋白含量下降主要是因為蛋白質的部分結合水形成冰晶，使肌動球蛋白分子間形成非共價鍵，進而形成超大分子的不溶解凝集體所致[28]。本實驗中，卡拉膠寡糖對肌原纖維蛋白質的保護效果較好，可能是因為卡拉膠寡糖抑制了蝦仁肌肉內冰晶的破壞，防止了肌球蛋白重鏈的冷凍變性，從而達到保護肌肉蛋白質構象穩定性的效果。

圖5 不同浸泡處理對蝦仁肌原纖維蛋白含量的影響Fig. 5 Effects of different soaking treatments on the content of myof i brillar proteins in frozen shrimps

2.6 不同抗凍劑處理對冷凍蝦仁肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

圖6 不同浸泡處理對蝦仁肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的影響Fig. 6 Effects of different soaking treatments on the Ca2+-ATPase activity of frozen shrimps

由圖6可看出，新鮮南美白對蝦蝦仁Ca2+-ATPase活力為0.171 U/mg。隨凍藏時間的延長，不同抗凍劑處理組蝦仁的Ca2+-ATPase活性均呈下降趨勢。蒸餾水處理組Ca2+-ATPase活性下降顯著（P＜0.05），凍藏6 周后，Ca2+-ATPase活力為0.102 U/mg，下降約40%。3 g/100 mL卡拉膠寡糖和3 g/100 mL焦磷酸鈉處理，對冷凍蝦仁肌肉Ca2+-ATPase活性的保護效果相對較好；凍藏6 周后，Ca2+-ATPase活力分別為0.134 U/mg和0.130 U/mg，顯著高于同樣抗凍劑低質量濃度處理組（P＜0.05）。研究發現，凍藏過程中形成的冰晶及體系離子強度的增強，均會改變肌球蛋白的頭部結構，致使其Ca2+-ATPase活性下降[29]。由此可見，卡拉膠寡糖及焦磷酸鈉處理能延緩蝦肉肌原纖維蛋白的冷凍變性及降低Ca2+-ATPase活性的下降程度。

2.7 不同抗凍劑處理對冷凍蝦仁微觀結構的影響

圖7 蝦仁肌肉（縱切）HE染色結果Fig. 7 HE staining of shrimp muscle (longitudinal cross sections)

圖8 蝦仁肌肉（橫切）HE染色結果Fig. 8 HE staining of shrimp muscle (transverse cross sections)

不同抗凍劑浸泡處理對冷凍蝦仁肌肉組織微觀結構的影響，見圖7和8。新鮮蝦仁（圖7A和8A）內部結締組織排列均一整齊，彼此間結合較緊密，存在少量空隙。凍藏6 周后，蒸餾水處理組（圖7D和8D），冷凍蝦仁組織結構發生了明顯的變化，其肌肉纖維結構變得松散，肌束間的間隙變大，橫切面出現大小不一的孔洞，這可能是由于凍藏過程中冰晶破壞了肌肉組織細胞，加劇了凍結過程中蛋白質的變性，致使肌束間、肌束內部的孔間距增大[30]。3 g/100 mL焦磷酸鈉處理組（圖7C和8C），冷凍蝦仁肌束收縮顯著，肌束間產生了較多空隙，但其肌肉纖維排列仍較緊密，孔洞直徑較蒸餾水處理組小。3 g/100 mL卡拉膠寡糖處理組（圖7B和8B），冷凍蝦仁肌纖維排列仍較緊密，完整性較好，無明顯扭曲、擠壓現象，與新鮮蝦仁的組織結構較為相近。這可能是由于卡拉膠寡糖與蛋白質相結合，提高了肌肉蛋白質的穩定性，抑制了蛋白質的降解變性。以上結果表明，卡拉膠寡糖對冷凍蝦仁微觀組織結構具有顯著保護作用，這也與肌原纖維蛋白含量和Ca2+-ATPase活性研究結果相一致。

3 結 論

在凍藏過程中，卡拉膠寡糖浸泡處理能有效降低冷凍蝦仁的解凍汁液損失，且在保持蝦仁質構及色澤，延緩肌原纖維蛋白含量下降和保護Ca2+-ATPase活性等方面均具有較好的效果。此外，卡拉膠寡糖處理對冷凍蝦仁微觀結構的保持作用也較好，同時以較高質量濃度的卡拉膠寡糖處理效果最佳。因此，卡拉膠寡糖可作為一種優良的抗凍保水劑應用于冷凍水產品中，為水產品低甜味、低熱量抗凍劑的開發與應用提供參考。

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Cryoprotective Effects of Carrageenan Oligosaccharides on Pacif i c White Shrimp (Litopenaeus vannamei) during Frozen Storage

WU Haixiao1, ZHANG Bin1,*, SHI Zhourong1, FANG Chuandong1, ZOU Junjie1, LI Haibo2
(1. College of Food and Medicine, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Zhejiang International Maritime College, Zhoushan 316022, China)

Objective: To evaluate the cryoprotective effects of carrageenan oligosaccharides on peeled shrimp (Litopenaeus vannamei). Methods: The thawing loss, color, texture, myof i brillar protein content, Ca2+-ATPase activity, and microscopic structure of shrimp muscle were investigated during frozen storage with sodium pyrophosphate as a positive control. Results: Both sodium pyrophosphate and carrageenan oligosaccharide treatments signif i cantly decreased the thawing loss, inhibited the degradation of myof i brillar proteins and Ca2+-ATPase activity, and maintained the pH and textural and color properties of shrimp muscle, when compared with the control during frozen storage. In addition, each treatment at a concentration of 3 g/100 mL showed better cryoprotective effect on shrimp muscle than at 1 g/100 mL. Importantly, carrageenan oligosaccharides were significantly more effective than sodium pyrophosphate (P ＜ 0.05) at the same concentration of 3 g/100 mL. The microstructural analysis revealed that the texture of shrimps treated with 3 g/100 mL carrageenan oligosaccharide after six weeks of frozen storage was compact and showed good integrity, which was not significantly different from that of fresh shrimps after frozen storage. Conclusion: Carrageenan oligosaccharide treatment at 3 g/100 mL is more benef i cial for maintaining the quality of white shrimp during frozen storage. This study can lay the foundation for developing a low-sweetness and low-calorie cryoprotective additive for frozen shrimp.

Litopenaeus vannamei; cryoprotective; water retention; sodium pyrophosphate; carrageenan oligosaccharides

10.7506/spkx1002-6630-201707041

TS254.4

A

1002-6630（2017）07-0260-06

吳海瀟, 張賓, 史周榮, 等. 卡拉膠寡糖對冷凍南美白對蝦的抗凍保水作用[J]. 食品科學, 2017, 38(7): 260-265.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707041. http://www.spkx.net.cn

WU Haixiao, ZHANG Bin, SHI Zhourong, et al. Cryoprotective effects of carrageenan oligosaccharides on pacif i c white shrimp (Litopenaeus vannamei) during frozen storage[J]. Food Science, 2017, 38(7): 260-265. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707041. http://www.spkx.net.cn

2016-06-22

中國博士后科學基金項目（2016M590663）；浙江省自然科學基金項目（Y15C200052）；浙江省公益項目（2016C32080；2016C32081）

吳海瀟（1993—），女，碩士研究生，研究方向為水產品加工及貯藏。E-mail：1443813242@qq.com

*通信作者：張賓（1981—），男，副教授，博士，研究方向為水產品加工及貯藏。E-mail：zhangbin_ouc@163.com