亞硝酸鹽對植物乳桿菌FQR細胞表面性質及形態的影響

韋田，梅林，王志耕，薛秀恒

(安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽農產品加工工程實驗室，安徽 合肥，230036)

亞硝酸鹽對植物乳桿菌FQR細胞表面性質及形態的影響

韋田，梅林，王志耕，薛秀恒

(安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽農產品加工工程實驗室，安徽 合肥，230036)

研究不同NaNO2濃度對植物乳桿菌(Lp)FQR降解NaNO2能力、亞硝酸鹽還原酶(NiR)活性以及細胞表面特性的影響，并經電鏡觀察細胞形態。結果表明，在0～0.150% NaNO2范圍內，隨著濃度的增大，FQR降解能力以及NiR活性均呈下降趨勢，在0.045% NaNO2條件下，FQR能夠高效降解NaNO2，16 h降解率達(94.85±2.96)%，NiR活力(174.60±13.67)U/104細胞，而高濃度NaNO2會引起細胞表面疏水性和膜通透性發生顯著升高。掃描電鏡觀察發現，0.045% NaNO2條件下FQR表面形態與對照組相比未發現明顯變化，但0.120% NaNO2時菌體表面出現褶皺和凹陷。透射電鏡觀察發現，對照組中FQR存在大量儲能顆粒，隨著NaNO2濃度增大，顆粒物數量明顯下降；在0.120% NaNO2時胞內儲能物質幾乎消失，并出現細胞質空化現象。高濃度NaNO2會引起菌體表面形態和內部結構發生明顯變化。

亞硝酸鹽；植物乳桿菌；亞硝酸鹽還原酶；細胞表面性質；電鏡

亞硝酸鹽是一種重要的食品添加劑，常用于肉制品加工。中國傳統腌肉制品添加亞硝酸鹽已有上千年歷史，亞硝酸鹽在其中具有發色、抑菌、抗氧化和形成獨特風味等重要作用[1]。由于亞硝酸鹽的殘留和積累具有潛在的食品安全風險，其應用受到很大限制。雖然有部分添加物可以在一定程度上替代亞硝酸鹽[2-3]，但是還沒有哪一種物質能夠完全徹底地替代亞硝酸鹽在肉類食品中的作用。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，Lp)與人類的生活密切相關，是發酵食品中常用發酵劑，還具有維持腸道內菌群平衡、提高機體免疫力和促進營養吸收等多種功能。有文獻報道[4-5]，Lp菌具有降解亞硝酸鹽的能力，在泡菜發酵過程中產生亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，NiR)，降解亞硝酸鹽[6]。王盼等[7]利用PCR技術克隆Lp NiR基因編碼序列，將其構建至原核表達載體，經誘導表達及表達產物的純化，最終獲得高純度的NiR。但是，對于Lp調控亞硝酸鹽代謝的機制還不清楚。

本課題研究了在不同濃度的亞硝酸鹽環境下，Lp對亞硝酸鹽的降解效果及其自身的細胞學特性，旨在為探明Lp對亞硝酸鹽的應答調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養基

植物乳桿菌FQR(Lp FQR)從中國傳統腌肉制品中篩選得到，由安徽農業大學畜產品加工實驗室提供。

MRS肉湯培養基：蛋白胨 10 g，牛肉粉5 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，MgSO40. 2 g，MnSO40. 05 g，吐溫80 1.0 mL，加入1 000 mL蒸餾水，制得pH(6. 2±0.1)肉湯培養基。

MRS固體培養基：上述MRS肉湯培養基中添加15 g瓊脂。

亞硝酸鈉鹽培養基：MRS肉湯培養基中添加一定量的NaNO2(m∶m)。

1.1.2 試劑

NaNO2、K2HPO4、KH2PO4、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、二甲苯等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；Fluo3-AM 熒光探針，上海碧云天生物技術有限公司；亞硝酸還原酶試劑盒，蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 主要儀器及設備

LS-45熒光分光光度計、Lambda 35紫外可見分光光度計，珀金埃爾默企業管理(上海)有限公司；JY92-IIN超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；JSM-7500F掃描式電鏡、JEM-1230透射式電鏡，日本電子株式會社；超薄切片機，(瑞典)LKB產品有限公司；FA2004 電子分析天平，上海上天精密儀器有限公司。

1.3 實驗驗方法

1.3.1 亞硝酸鹽含量的檢測

參照GB/T5009.33—2010 《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[9]，并結合張馨月等[10]測定方法，略有修改。培養基置于離心管中3 500×g離心5 min，取上清液，不經過提取液凈化的步驟，直接加2 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min 后各加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液(2 g/L)，靜置15 min，于波長538 nm處測定吸光度值。同時做試劑空白。NaNO2含量計算公式如下：

式中：X—試樣中NaNO2的含量，mg/kg；A1為測定用樣液中NaNO2的質量，μg；m為試樣質量，g；V1為測定用樣液體積，mL；V0為試樣處理液總體積，mL。

1.3.2 Lp亞硝酸鹽降解能力的檢測

將凍存的Lp FQR接種于MRS肉湯培養基中，37 ℃培養24 h，活化菌種。取100 μL菌液涂布于MRS固體培養基上，37 ℃培養36 h，挑取單菌落于30 mL MRS肉湯培養基中，37 ℃培養至穩定期(16 h)，作為Lp FQR種子液。下面試驗接種量均以種子液添加。

以2 %接種量接入含有0～0.150 % NaNO2MRS肉湯培養基中，37℃培養穩定期(16 h)。按照1.3.1 的方法測定培養基中NaNO2含量，每組3個重復。NaNO2降解率(degradation rate，DR)公式如下：

DR/%= (1-X2/X1)×100

式中：X1為原始培養基中NaNO2的含量mg/kg；X2為培養16 h后培養基中NaNO2的含量，mg/kg。

1.3.3 NiR活性測定

以2%接種量接入含有0～0.150% NaNO2MRS肉湯培養基中，37 ℃培養16 h。培養液于4℃下3 500×g離心10 min，棄上清，收集菌體，用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)洗滌2次后重懸于PBS，置于冰上超聲波破碎細胞，超聲波細胞破碎儀工作參數為：功率300 W，超聲3 s，間隔7 s，總時長3 min。破碎細胞液于4 ℃下10 000×g離心10 min，取上清液置于冰上，利用亞硝酸還原酶試劑盒測定酶活。酶活單位定義為：每104個細胞每小時還原1 μmol NO2-的量為1個酶活單位。

1.3.4 細胞表面疏水性試驗

本試驗采用微生物黏著碳烴化合物法[11]，以2 %接種量接入含有0～0.150 % NaNO2MRS肉湯培養基中，37 ℃下培養16 h，菌液在3 500×g離心 10 min，棄上清，收集菌體。用0.02 mol/L PBS(pH7.2)洗滌2次，重懸于滅菌的 0.1 mol/L KNO3溶液中，使菌懸液600 nm處吸光度值達到(0.5±0.02)(A0)。取 3 mL菌懸液與 1 mL二甲苯混勻后在室溫靜置 10 min，渦旋振蕩2 min 后再靜置10 min，吸取水相于600 nm處測定吸光度(A1)。細胞表面疏水性(cell surface hydrophobicity，CSH)公式為：

1.3.5 細胞膜通透性試驗

本試驗利用細胞內Ca2+測定采用Fluo3-AM 熒光探針法[12]評價細胞膜通透性。以2 %接種量接入含有0～0.150% NaNO2MRS肉湯培養基中，37℃下培養16 h，菌液在3 500×g離心10 min，棄上清，生理鹽水洗滌并稀釋至一定濃度的菌懸液(1.0×108CFU/mL)。取3mL 菌懸液，加入0.6 μL 5 mmol/L Fluo3-AM溶液，37 ℃避光孵育30 min，10 000×g離心5 min，棄上清液，用生理鹽水洗滌1次后，重懸于3 mL生理鹽水中。將負載好的樣品置于熒光分光光度計內，以488 nm為激發波長，觀察525 nm處的熒光強度。

1.3.6 掃描式電鏡觀察

以2%接種量接入分別含有0、0.045%和0.120% NaNO2MRS中，37 ℃下培養16 h后，4℃ 3 500×g離心10 min，棄上清液，加入濃度2.5%戊二醛PBS緩沖溶液，4 ℃冰箱內固定12 h后，0.1 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌3次，再經30%、50%、70%、80%、95%及100%乙醇依次脫水，CO2臨界點干燥，噴金，掃描式電鏡觀察并拍照。

1.3.7 透射式電鏡觀察

以2 %接種量接入分別含有0、0.045% 和0.120% NaNO2MRS中，37 ℃下培養16 h后，4 ℃ 3 500×g離心10 min，棄上清液，加入濃度2.5%戊二醛PBS緩沖溶液，4℃冰箱內固定12 h后，0.1 mol/L PBS緩沖液(pH7.2)洗滌3次，用1 %鋨酸固定2 h，再用0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗數次。依次30%、50%、70%、90%及100%乙醇梯度洗脫，用環氧丙烷和環氧樹脂按1∶1(v∶v)浸透2 h，再于環氧丙烷和環氧樹脂按1∶2(v∶v)浸透1 h，環氧樹脂固化過夜，烤箱內加溫成塊，經超薄切片染色，透射式電鏡觀察并拍照。

1.4 統計分析

采用SPSS 18.0對實驗結果進行差異顯著性分析，結果以平均值±標準差表示，P<0.05 為差異顯著，用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 Lp FQR降解NaNO2能力

在0.045%～0.225% NaNO2范圍內，隨著MRS肉湯培養基中NaNO2含量的增加，FQR降解NaNO2能力呈下降趨勢(圖1)。但FQR于0.045 %和0.075 % NaNO2MRS中DR無顯著差異(P>0.05)，分別為(94.85%±2.96%)和(94.18%±3.87%)，說明在0～0.075% NaNO2范圍內，FQR具有良好的降解NaNO2能力；0.120% NaNO2條件下，FQR降解能力顯著降低(P<0.05)，DR為(50.49%±4.54%)。而在0.225% NaNO2濃度時，DR僅為(7.05%±2.77%)，同時，取100 μL菌液涂布于MRS固體培養基上，結果發現無活菌存在，而部分NaNO2的降解可能是由于菌體前期適應過程產生。因此，高濃度的NaNO2對Lp降解NaNO2能力具有抑制作用。

圖1 不同濃度NaNO2對FQR降解能力的影響Fig.1 Effect of different concentrations of NaNO2on degradation ability of FQR

2.2 不同濃度NaNO2對Lp FQR亞硝酸鹽還原酶活性的影響

目前，普遍認為微生物主要利用NiR降解NaNO2。本研究中Lp FQR在0～0.150% NaNO2范圍內，NiR活性呈下降趨勢，與圖1結果基本相符合，但0.075% NaNO2時NiR活力為(119.68±9.03) U/104細胞，相對于0.045% NaNO2條件酶活力下降了31.45%(P<0.05)(圖2)。Lp FQR于空白和0.045% NaNO2MRS中NiR活力差異不顯著(P>0.05)，分別為(181.55±8.63) U/104細胞和(174.60±13.67) U/104細胞，說明0～0.045% NaNO2濃度范圍內，NiR活力沒有受到顯著影響。但超過此范圍NiR活性受到明顯的抑制，并且NaNO2濃度越大，抑制作用越強，0.150 % NaNO2濃度時，NiR酶活僅為(29.23±5.81)U/104細胞。

圖2 不同濃度NaNO2對FQR亞硝酸鹽還原酶活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of NaNO2 on nitrite reductase activity of FQR

2.3 不同濃度NaNO2對Lp FQR表面疏水性的影響

目前認為，CSH主要是由菌體表面具有的疏水性蛋白質、糖類等化合物所賦于的一種表面特性[13]，菌體表面的蛋白類物質對細胞具有較好的保護作用[14]。有研究表明[15]，CSH強弱主要取決于其表面非極性基團的比例。

圖3 不同濃度NaNO2對FQR 細胞表面疏水性的影響Fig.3 Effect of different concentrations of NaNO2 on cell surface hydrophobicity of FQR

由圖3可知，在0～0.120%NaNO2范圍內，CSH值呈現上升的趨勢，可能由于NaNO2濃度的增加，引起環境中離子強度改變，使得細胞表面蛋白中疏水性基團打開，而表現出CSH增強[11]。在空白和0.045% NaNO2條件下，FQR CSH無顯著性差異(P>0.05)，分別(19.70±1.41)%和(21.32±1.33)%，可能0～0.045% NaNO2是菌體能夠承受的范圍，菌體表面表現出較小的應激反應。在0.120% NaNO2時，CSH值達到最大(41.38%±1.08%)，說明該濃度下細胞表層疏水性基團參與調節。但在0.150% NaNO2時，CSH值又顯著降低(P<0.05)，可能是由于細胞表層蛋白遭到破壞，而表現出菌株的表面疏水性減弱[16]。

2.4 不同濃度NaNO2對Lp FQR細胞膜通透性的影響

熒光探針Fluo-3 AM是種高度特異性Ca2+熒光指示劑，研究表明[17]，激發光波長位于可見光區，能有效地避免紫外光激發而引起的細胞自發熒光的干擾和對細胞的損傷。Fluo3與胞內游離鈣結合，在488 nm激發光的激發下，525 nm 處觀察的熒光強度，胞內Ca2+濃度與熒光強度成正比[18-19]。

本研究利用Fluo3-AM 熒光探針檢測FQR胞內Ca2+濃度，比較不同濃度NaNO2對細胞膜通透性的影響，從而評價細胞受傷害的程度。熒光強度越大，胞膜通透性越小，即細胞受傷害程度越小。結果表明，在0～0.150 % NaNO2范圍內，隨著NaNO2濃度的增大，熒光強度呈下降趨勢，相對于空白組分別降低了30.24 %、39.58 %、60.95 %和67.90 %(圖4)。說明NaNO2對細胞產生了不同程度的損害，NaNO2濃度越大，細胞膜通透性越高。

圖4 不同濃度NaNO2對FQR細胞膜通透性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of NaNO2 on membrane permeability of FQR

2.5 不同濃度NaNO2對Lp FQR形態的影響

2.5.1 掃描式電鏡觀察

Lp FQR分別于含0.045 %、0.120 % NaNO2MRS培養基中培養16 h，以不含NaNO2的MRS培養基為對照。結果表明，在對照和含0.045 % NaNO2條件下，FQR菌體大小均一，呈短桿狀，表面光滑，并且個體充盈、飽滿(圖5 a～b)，細胞表面形態未發現明顯變化。

在0.120 % NaNO2濃度下，Lp FQR菌體表面出現褶皺和凹陷(圖5c)，說明該濃度已對菌體產生了一定的傷害。但對菌體大小進行測量發現，菌體大小并未出現明顯差異，王蘭[20]等研究發現NaNO2會導致植物乳桿菌L5 菌體形態發生一定的改變，菌體變成纖細的長桿狀，與本試驗研究結果有差異，可能是由于菌株的差異性導致。某種程度上，Lp具有較強的自動調節能力，能夠減小NaNO2對細胞膜破壞作用。

本研究對掃描電鏡電壓大小做出一定的選擇，發現電壓過高菌體表面損傷，如褶皺、甚至胞膜破損等，不易真實呈現，最終選擇電壓3.0 kV為最佳。

a、b、c分別為FQR在空白、0.045 % NaNO2以及0.120 %條件下培養16 h電鏡照片，30.0 k倍圖5 不同濃度NaNO2 對FQR菌體形態的掃描電鏡圖Fig.5 Effect of different concentrations of NaNO2on morphology of FQR by scanning electron microscope

2.5.2 透射式電鏡觀察

Lp FQR分別于含0.045 %、0.120 % NaNO2MRS培養基中培養16 h，以不含NaNO2的MRS培養基為對照。透射電鏡觀察發現，對照組中FQR存在大量白色顆粒(圖 6 a)；含0.045 % NaNO2的MRS培養基中FQR胞內白色顆粒減少(圖 6 b) ；在0.120 % NaNO2條件下，胞內未發現白色顆粒，而出現細胞質空化現象(圖 6 c)。據報道[21-22]，白色顆粒物是一種無機磷酸鹽(多聚β-羥基丁酸)，是細菌體內常見的能量儲存物質，在細胞生長、代謝中具有重要的作用。此外，菌體可通過感應環境信號來調控胞內儲能物質。高濃度的NaNO2條件下，Lp白色顆粒的減少，可能是Lp為適應NaNO2脅迫環境，產生應激反應，消耗胞內儲能物質所至；細胞空化可能與高濃度的NaNO2引起的細胞膜通透性升高(圖 4)，胞質內容物流失有關。

a、b、c分別為FQR在空白、0.045 % NaNO2以及0.120 %條件下培養16 h電鏡照片，10.0 k倍圖6 不同濃度NaNO2 對FQR菌體形態的透射電鏡圖Fig.6 Effect of different concentrations of NaNO2 on morphology of FQR by transmission electron microscope

3 結論

NaNO2對Lp FQR的生長、細胞表面性質以及細胞形態均有不同程度的影響。在0～0.150 % NaNO2范圍內，隨著NaNO2濃度的增大，FQR降解NaNO2能力以及NiR活性均呈下降趨勢。

隨著NaNO2濃度增大，FQR細胞膜的通透性升高，胞內儲能物質減少；菌體表面形態和內部結構發生顯著變化，以至于細胞膜表層損傷，NaNO2濃度越大，損傷越明顯。這種細胞膜的損傷，可能造成細胞質組分外流，因此導致Lp對高濃度NaNO2的降解能力下降。

本研究從細胞學角度探明了高濃度NaNO2對Lp細胞表面特性的改變及其細胞質膜的破壞作用，為進一步深入研究Lp對NaNO2的應答調控機制奠定了基礎。

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Effect of nitrite on the cell surface property and morphology ofLactobacillusplantarumFQR

WEI Tian, MEI Lin*, WANG Zhi-geng, XUE Xiu-heng

(School of Tea and Food Science& Technology, Anhui Agriculture University, Engineering Laboratory of Agricultural Products Processing of Anhui, Heifei 230036，China)

Effects of different concentrations of NaNO2on the degradation ability, nitrite reductase (NiR) activity and cell surface properties ofLactobacillusplantarum(Lp) FQR were investigated, and the cell morphology of which was observed by electron microscope. The results showed that the degradation ability and NiR activity of FQR was decreasing with the increase of NaNO2concentrations within 0-0.150%. Under the condition of 0.045% NaNO2, FQR could efficiently degrade NaNO2within 16 h with (94.85±2.96)% of degradation rate and (174.60±13.67) U/104of NiR activity. In addition, high concentrations of NaNO2could also contribute to the significant increase of cell surface hydrophobicity and membrane permeability. There were no differences in cell surface morphology of FQR between the nitrite-free group and 0.045% NaNO2group, whereas the surface of FQR exposed to 0.120% NaNO2appeared depression and wrinkle by observation through scanning electron microscope. FQR in nitrite-free group exhibited numerous energy storage granules, number of which decreased obviously with increasing concentration of NaNO2. The intracellular energy storage material almost disappeared, and external flow of cytoplasm was observed through transmission electron microscope when FQR exposed to 0.120% NaNO2. In summary, high concentrations of NaNO2can cause changes in the surface morphology and internal structure of bacteria obviously.

nitrite;Lactobacillusplantarum; nitrite reductase; cell surface property; electron microscope

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703008

碩士研究生(梅林副教授為通訊作者,E-mail：meilin8880@sina.com.cn)。

安徽省生豬產業技術體系建設專項資金(ahszcytx-5)

2016-05-10，2016-07-19