1株Lodderomyceselongisporus酵母對濃香型白酒發酵的影響

游玲，李美華，王陟垚，梅伶俐，孫雪琴，余麗辰，王濤*

1(宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓，644000) 2(宜賓學院，固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

1株Lodderomyceselongisporus酵母對濃香型白酒發酵的影響

游玲1,2，李美華1，王陟垚1，梅伶俐1，孫雪琴1，余麗辰1，王濤1,2*

1(宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓，644000) 2(宜賓學院，固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

為探究1株Lodderomyceselongisporus酵母對濃香型白酒發酵的影響，通過強化接種該酵母到固態發酵糟醅中發酵50 d，分析糟醅的理化指標、風味物質含量以及微生物區系的變化。結果顯示，該酵母可使糟醅中還原糖含量顯著增加，氨基態氮顯著減少，乙縮醛、己酸生成量顯著增加；且該酵母菌株大幅降低糟醅中真菌群體豐富度和多樣性，強化接種的L.elongisporus取代原有優勢真菌Zygosaccharomyces成為新的優勢真菌，同時該酵母對細菌群體多樣性影響相對較小，優勢細菌Lactobacillus屬豐度增加，Pseudomonas屬豐度減少。結果表明,強化接種L.elongisporus酵母菌將改變濃香型白酒風味，且可對續糟發酵產生不可預知的持續影響。

Lodderomyceselongisporus；濃香型白酒；強化接種；影響；微生物區系

白酒釀造是原料、微生物細胞及其代謝產物相互作用的結果，酵母菌是主要的產酒功能菌，同時在香氣物質形成方面也起著重要作用[1]，如產酯酵母有助于形成濃香型白酒的特征風味[2]。已有研究表明，不同香型白酒的釀造酵母區系有著明顯差異[3]，但多數報道主要集中在酵母，特別是釀酒酵母在純培養條件下的產酒精、產酯能力研究[4-5]。近年來的研究表明，酵母與多種風味物質的生成關系密切[6]，不同酵母菌對白酒風味有不同的影響[7]，并且酵母菌與細菌、真菌之間還存在廣泛的相互作用[8]。因此，在濃香型白酒釀造這種典型混菌發酵體系中，酵母群體不僅可通過自身代謝產物，也可通過與其他微生物的相互作用來影響濃香型白酒的產量及風味，但目前仍缺乏相應的實驗證據。

Lodderomyces酵母作為一種發酵效率較低，但對風味有重要貢獻的非釀酒酵母，雖不能分泌麥芽糖水解酶，不能發酵麥芽糖和麥芽三糖，但能發酵部分葡萄糖、果糖以及全部的蔗糖[9-10]，在啤酒釀造中，Lodderomyces酵母產生的酒精僅為啤酒酵母的1/6，且酸類物質、酯類物質及酯類和正丙醇生成量較少，對口感沒有明顯影響[11]。在白酒釀造中該屬酵母的研究、應用均較少，而作為宜賓濃香型白酒中四大優勢酵母之一[12]，L.elongisporus酵母很可能與濃香型白酒風味形成有關。

因此，本研究以濃香型白酒糟醅中分離到的1株可在YPD培養基中產酯的L.elongisporus酵母為研究對象，通過接種該菌株到混菌固態發酵糟醅中，檢測其對濃香型白酒主要風味物質生成的影響，以及對釀造微生物生態的影響，來探究該酵母菌株在濃香型白酒發酵過程中的作用，并評估其可能的應用價值，為后續用于濃香型白酒生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

分離自濃香型白酒窖房的酵母菌株，編號Z8Y-91，鑒定為Lodderomyceselongisporus(現保存于四川省固態發酵資源利用四川省重點實驗室)。

1.2 發酵試驗

入窖糟醅取自四川宜賓某知名多糧濃香型白酒企業，黃水為取糟醅的窖池上一輪發酵黃水。

斜面菌種以YPD 培養基活化并擴培后，3 000 r/min離心5 min去掉上清液，加入無菌水調整濃度為108個/mL，4 ℃保存備用。

混菌處理：在濃香型白酒釀造車間，入窖糧糟中加入體積分數為1%的黃水混勻后，分裝入1 L的玻璃壇，每壇(0.83±0.05) kg，每個玻璃壇接種50 mL菌懸液，充分混勻后，自內向外依次以丟糟、窖皮泥、保鮮膜、牛皮紙封口。

純菌對照：添加黃水的糟醅裝入玻璃壇后，1×105Pa滅菌30 min，冷卻至35 ℃左右接種50 mL菌懸液，其余操作同混菌處理。

空白對照：除以等體積的無菌水代替50 mL菌懸液接種未滅菌的糟醅外，其余操作同混菌處理。處理和對照均設3個重復。

1.3 總DNA提取

采用Omega細菌及真菌基因組提取試劑盒(E.Z.N.A)提取混菌發酵及空白糟醅DNA，送至上海生物工程有限公司進行高通量測序。

1.4 風味物質以及乳酸檢測

將固液態發酵樣品加入200 mL的去離子水，蒸餾得到100 mL的蒸餾液，所有的蒸餾液均過濾備用。

采用FFAP色譜柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent USA)和LZP-930色譜柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm，鄭州普析)通過安捷倫氣相色譜(Agilent 7890A)檢測有機酸及其他主要風味物質[13]；采用C18柱(5 μm×250 mm×4.6 mm)通過安捷倫液相色譜(Agilent 1220)檢測乳酸含量[14]。

1.5 理化指標檢測

(1)淀粉含量：依據GB/T 5009.9—2008，采用酶水解法來測定淀粉含量[15]。

(2)還原糖含量：依據GB/T 5009.7—2008，采用斐林試劑滴定法來測定還原糖含量[15]。

(3)酸度：依據GB/T 9736—2008，采用滴定分析法來測定酸度[16]。

(4)氨基態氮：依據GB 12143.2，采用甲醛值法來測定氨基態氮含量[16]。

2 結果與分析

發酵50 d后，所有處理及對照均氣味正常，表面無肉眼可見的雜菌污染，強化接種Z8Y-91菌株的混菌發酵糟醅保持了與對照一致的濃香風味，但其糟香較空白略淡，而純菌發酵的風味與混菌發酵差別較大。以下分別討論該酵母對糟醅中碳氮源轉化、風味物質生成及微生物區系構成的影響。

2.1 Z8Y-91對糟醅中的碳氮源轉化的影響

從圖1可知，接種Z8Y-91的混菌發酵糟醅淀粉、還原糖、乙醇含量高于接種該菌株的純菌發酵糟醅，可能是因為糟醅滅菌后，其中的微生物及酶活性被滅活，導致整個發酵體系中原有的糖化酶不再起作用，而外加的糖化酶糖化效果較差，導致由淀粉生成的還原糖量較少，因此產酒精也較少?；炀l酵糟醅中的氨基態氮略高于未添加蛋白酶的滅菌糟醅，也證實了高溫對蛋白酶的滅活作用，但總體上滅菌與否對糟醅碳、氮源轉化均沒有顯著影響。

圖1 Z8Y-91對糟醅中的碳氮源轉化的影響(乙醇的單位是mg/10L，淀粉、還原糖的單位是mg/100g，氨基態氮的單位是g/kg；a、b分別表示與空白對照、純菌發酵糟醅的差異達到顯著水平(P<0.05)，下同。) Fig.1 Influence on the degradation of carbon and nitrogen in fermentative grains caused by Z8Y-91(The unit of ethanol is mg/10L, mg/100g for the starch and reduced sugar, and g/kg for the amino nitrogen; a, b means P<0.05 compared with the control and the pure culture respectively, and the same below)

與空白相比，接種Z8Y-91菌株的混菌發酵糟醅中淀粉、還原糖含量較高，乙醇含量、氨基態氮較低，可能是因為強化接種Z8Y-91后雖然使發酵體系的淀粉轉化率提高，還原糖顯著增加，但是整個發酵體系的發酵力減弱，因此產酒精較少?；炀l酵醩醅中的氨基態氮顯著低于空白對照，可能是因為接種Z8Y-91后蛋白酶活性降低，轉化生成較少的氨基態氮。

2.2 Z8Y-91對糟醅中風味物質生成的影響

2.2.1 Z8Y-91對糟醅中的醛類物質生成的影響

從圖2可知，接種Z8Y-91菌株的滅菌糟醅中乙縮醛含量極顯著地高于混菌發酵糟醅，而混菌糟醅乙縮醛生成量又極顯著地高于空白對照，表明該酵母菌株對乙縮醛的生成有重要影響，混菌發酵糟醅中的其他微生物可顯著抑制該酵母產乙縮醛，而該酵母在乙醇、乙醛含量較低的糟醅中生成的乙縮醛較多，說明該酵母可促進乙縮醛縮合。同時，該酵母菌株在混菌發酵糟醅中的乙醛生成量高于純菌發酵糟醅，可能是由于純菌糟醅乙醇含量較低，由乙醇氧化生成的乙醛也較少。

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另外，該酵母菌株對異丁醛、生成糠醛的影響也與乙縮醛類似，但不顯著，但該酵母仍傾向于增加異丁醛、糠醛的生成，可能對白酒產生不良風味。

圖2 Z8Y-91對糟醅中醛類物質的影響(異丁醛的單位是mg/mL，乙醛、糠醛、乙縮醛的單位是mg/100mL；A、B分別表示與空白對照、純菌發酵糟醅的差異達到極顯著水平(P<0.01)，下同。)Fig.2 Fluctuation of aldehydes in fermentative grains caused by Z8Y-91( The unit of iso-butyl aldehyde is mg/mL, and mg/100mL for the acetaldehyde, furfural, acetal; A, B means P<0.01 compared with the control and the pure culture respectively, and the same below.)

2.2.2 Z8Y-91對糟醅中高級醇生成的影響

從表1可知，接種Z8Y-91的混菌發酵糟醅中正丁醇含量顯著高于純菌發酵醩醅，除乙醇外的總醇生成量明顯高于純菌發酵糟醅，可能是因為醩醅滅菌后整個發酵體系的發酵力降低，而酵母是影響高級醇生成的重要因素。

表1 Z8Y-91對糟醅中醇含量的影響 單位：mg/100mL

與空白相比，接種Z8Y-91的混菌發酵糟醅中除乙醇外的醇類物質含量高于空白對照，說明Z8Y-91對混菌體系中醇類物質生成有一定影響，雖未達到顯著水平，但多輪次發酵累積后可能會最終增加濃香型白酒的高級醇含量。并且，該菌株還可能增加甲醇的生成量，體現在接種該菌株的純菌及混菌發酵糟醅中的甲醇含量均高于空白糟醅，但3種發酵體系中甲醇生成量均低于國標限量(≤ 0.6 g/L)[17]。

2.2.3 Z8Y-91對糟醅中有機酸、酯類物質生成的影響

從表2可知，與接種酵母菌株的滅菌糟醅相比，混菌發酵糟醅的酸度基本沒有變化，但4種主要有機酸總含量及其對應酯的總生成量均較高，原因可能是糟醅滅菌后導致產酸菌減少，酯化酶被滅活，且滅菌過程中酸、醇揮發損失也減少了酯的生成量。

表2 Z8Y-91對糟醅中有機酸和酯生成的影響 單位：mg/100mL

與空白對照相比，混菌發酵糟醅中己酸含量顯著增加，但己酸乙酯含量卻略有降低，可能是因為Z8Y-91削弱了己酸菌的酯化力?；炀l酵糟醅與空白對照酸度非常接近，但4種主要有機酸、酯總含量較低，說明Z8Y-91可在一定程度上削弱糟醅濃香風味。

2.3.1 Z8Y-91對糟醅中真菌區系的影響

如表3所示，2個樣本高通量測序的序列覆蓋率均超過97%，能夠很好地反映菌群真實情況。接種Z8Y-91后有效序列條數增加了79.3%，但OTU數量減少了77.3%，同時香農指數和ACE指數表明該酵母降低了糟醅中真菌的多樣性及豐富度，對種屬數量的統計也證實了這一點，接種該酵母菌株后，糟醅中的真菌屬從96個下降到54個，種從150個下降到67個。

表3 Z8Y-91對真菌區系多樣性的影響

從圖3可以看出，接種L.elongisporus菌株Z8Y-91后，該酵母豐度達97.5 %，表明該菌株對混菌發酵糟醅適應能力較強，對糟醅中原有酵母種屬具有一定的生態優勢，同時對糟醅真菌區系影響較大，表現在優勢酵母Zygosaccharomyces屬大幅度減少，Chloridium、Fusarium、Lecythophora等屬的豐度也不同程度的降低。

圖3 Z8Y-91對糟醅中真菌區系構成的影響Fig.3 Influence on fungus flora in fermentative grains caused by Z8Y-91

2.3.2 Z8Y-91對糟醅細菌區系的影響

由表4可知，2個樣本高通量測序的序列覆蓋率在90%左右，能夠較好地反映菌群真實情況。接種Z8Y-91后糟醅中有效序列條數增加了3.6%，但OTU數量減少了33%，同時細菌群體多樣性降低，細菌屬從593個減少到400個，減少了32.5%，種從520個減少到272個，減少了47.7%。

從圖4可以看出，接種L.elongisporus菌株Z8Y-91后優勢屬Lactobacillus的豐度上升至81.77%，而Pseudomonas屬明顯減小，豐度<1%的屬(other)減少，這與表6中細菌屬的個數從593個降低到400個是一致的，說明該菌株可促進Lactobacillus優勢屬的生長，但會通過抑制某些非優勢種屬細菌生長來降低群體多樣性。

表4 Z8Y-91對細菌區系多樣性的影響

圖4 Z8Y-91對糟醅中細菌區系構成的影響Fig.4 Influence on bacteria flora in fermentative grains caused by Z8Y-91

3 結論與討論

自然混菌固態發酵的影響因素和不確定因素較多，且其發酵基質不均勻，因此其微生物發酵機理的研究一直較為滯后，本研究通過強化接種1株L.elongisporus酵母到混菌發酵糟醅中，來探究該酵母菌在濃香型白酒發酵過程中可能的作用，并評價其潛在的應用價值及應用風險，在本實驗條件下，可得出以下結論：

(1)強化接種該酵母不影響淀粉糖化，但對糟醅發酵力有一定影響，同時顯著抑制蛋白質分解；

(2)該酵母傾向于增加乙縮醛、己酸、糠醛、異丁醛、乙縮醛、甲醇的生成，其中乙縮醛、己酸達到顯著水平；

(3)該酵母在混菌發酵糟醅中具有很好的生態優勢，強化接種后可降低糟醅真菌多樣性和豐富度，對細菌多樣性也有不利影響。

綜合上述研究結果，我們認為，盡管該分離自濃香型白酒糟醅的酵母菌株與濃香型白酒風味的形成有一定關聯(增加乙縮醛、己酸的生成)，但其對釀造微生物生態環境可能造成不利影響，要將其用于生產，尚需在多家白酒企業的多輪次生產中跟蹤驗證，并通過調整酵母的接種量、接種方式等優化應用方案，趨利避害，改善濃香型白酒風味。

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DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703003

Influences of aLodderomyceselongisporusstrain on fermentation of strong-flavored liquor

YOU Ling1,2,LI Mei-hua1,WANG Zhi-yao1,MEI Ling-li1, SUN Xue-qin1,YU Li-chen1,WANG Tao1,2*

1(College of Life Science and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China) 2(Key Laboratory of Sichuan Province for the Utilization of Solid State Fermentation Resources, Yibin University, Yibin 644000, China)

In order to explore the role of aLodderomyceselongisporusyeast in the strong-flavored liquor fermentation, the strain was inoculated to fermentation grains, the fluctuation of physicochemical indexes, flavor substances and microflora in fermented grains were then analyzed after fermentation for 50d. It was found that the addition of this yeast strain significantly increased the content of reducing sugar and decreased the amino-N, and promoted the formation of acetal and hexanoic acid. Furthermore, the fungus diversity in fermentative grains considerably reduced when enhanced by the yeast strain,L.elongisporusbecame dominant strains instead ofZygosaccharomyce. Meanwhile, bacteria diversity was slightly influenced, as the dominant genus, the frequencies ofLactobacillusincreased while Pseudomonas decreased. The results indicated thatL.elongisporuscould change the flavor of Strong -flavored liquor, and might result in unpredictable sustained influences on continuous fermentation.

Lodderomyceselongisporus; strong-flavored liquor; enhancement; influences; microflora

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703002

博士，助理研究員(王濤教授為通訊作者,E-mail：289615848@qq.com)。

固態發酵資源利用四川省重點實驗室項目(2015GTC001)；宜賓學院博士啟動項目(2016QD09)；大學生創新項目(201510641015)

2016-08-19,改回日期：2016-09-29