HPLC法測定藏藥二十五味珊瑚丸中B—細辛醚的含量

蘭鈞　阿萍

[摘要]目的：建立藏藥二十五味珊瑚丸中B-細辛醚的HPLC含量測定方法。方法：采用Waters XSELECT CSHc投色譜柱，以甲醇-水（56：44）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為254nm，柱溫為35℃。結果：B-細辛醚在0.9926～2.9778ug范圍內線性良好（r=0.9999），平均回收率為99.27%，RSD為1.1%。結論：該方法準確、可靠、快速、靈敏，可用于藏藥二十五味珊瑚丸的質量控制。

[關鍵詞]二十五味珊瑚丸；B-細辛醚；高效液相色譜法；含量測定

二十五味珊瑚丸是傳統藏藥，由珊瑚、珍珠、青金石、珍珠母、訶子、木香、紅花、丁香、沉香、朱砂、龍骨等二十五味藥材制成，具有清熱定驚、開竅通絡、止痛的功效，用于治療“白脈病”，即中樞神經系統疾病，如神志不清，身體麻木，頭昏目眩，腦部疼痛，血壓不調，頭痛，癲癇及各種神經性疼痛。首次收載于1995《中國藥典》標本版，1997年被國家衛生部批準為國家中藥保護品種，目前被《中國藥典》2010年版收載?，F行檢驗標準包含簡單的化學反應和西紅花、紅花主要成分的薄層色譜鑒別以及烏頭堿的限量測定。涉及的藥材少，代表性不足，缺乏組方藥材的質控指標及定量標準，難以保證產品質量的穩定和用藥安全有效。

二十五味珊瑚丸治療癲癇等神經性疼痛，藏菖蒲中有效成分B-細辛醚起重要作用，采用UP-LC-DAD/Q-TOF-MS對二十五味珊瑚丸全方進行了系統的成分分析，鑒定出6大類61個成分，其中苯丙素類B-細辛醚和a-細辛醚來自藏菖蒲，且二十五味珊瑚丸成藥中B-細辛醚含量較高。研究表明，B-細辛醚能降低小鼠癲癇發作級別，延長癲癇發作潛伏期，減少濕狗樣抖動次數。而B-細辛醚是主要入血入腦的成分，既是有效成分，但在高濃度下又是潛在的毒性成分，因此控制B-細辛醚的含量關系到全方的安全性和有效性。本研究擬采用HPLC建立了二十五味珊瑚丸中B-細辛醚的含量測定方法，為藏藥二十五味珊瑚丸的質量控制提供參考方法。

1.儀器與材料

1.1儀器 Waters高效液相色譜儀（Waters2695泵自動進樣器，2998二極管陣列紫外檢測器，Waters自帶數據處理器）；超聲儀；旋轉蒸發儀；十萬分之一電子天平。

1.2材料 B-細辛醚（批號：C10301000，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；二十五味珊瑚丸（抽自青海金訶、西藏神猴、昌都光于利民、西藏甘露、西藏藏醫學院等9個生產企業，占全國生產企業的73%）。配制陰性樣品的藥材由西藏自治區食品藥品檢驗所標本室提供。甲醇為色譜純（美國Fisher公司），水為超純水。

2.方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Waters Xselect CSH Cls（4.6mm×250mm，5txm）；柱溫：35～C；流動相：甲醇一水（56：44）；流速：1mlZmin；檢測波長：254nm；進樣量：10uL。

2.2空白試驗 按處方中藥味比例，配制不含藏菖蒲的群藥，按其工藝制成陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備并測定，色譜圖見圖1。表明陰性樣品溶液在與B-細辛醚對照品相同保留時間處未現色譜峰，故認為無干擾。

2.3對照品溶液的制備 精密稱取B-細辛醚對照品適量，加甲醇制成1mL含0.25mg的溶液，作為對照品溶液。

2.4供試品溶液的制備 取本品2g，研細，精密稱定，加甲醇20mL，加熱回流提取1h，過濾后，藥渣再用20mL甲醇加熱回流提取1h。合并兩次提取液，用旋轉蒸發儀在30℃下減壓干燥完全，加入少量甲醇洗滌，用甲醇定容至10mL量瓶中，搖勻，用0.45um微孔濾膜過濾，取續濾液即得。

2.5線性關系的考察 精密稱取B-細辛醚對照品適量，制得濃度溶液為0.24815mg/mL，分別進樣2、4、6、8、10、12ul，按上述色譜條件，測定峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，回歸方程：y=2.23e+006X-8.85e+004（r=0.9999），結果表明，B-細辛醚在0.4963～2.9778ug范圍內線性關系良好。

2.6精密度試驗 取同一供試品溶液，連續進樣6次，RSD值為0.5%。表明儀器的精密度良好。

2.7穩定性試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別在室溫下放置0、2、4、8、12h進樣測定，結果峰面積基本不變，RSD值為0.73%，表明供試品溶液在12h內基本穩定。

2.8重復性試驗 取本品1批，按照上述方法制備成6份供試品溶液，測得B-細辛醚平均含量為2.04mg/g，RSD值為1.1%。

2.9回收率試驗 精密稱取來自7個不同生產企業已知含量的樣品約1g，分別精密加入濃度的B一細辛醚對照品，進樣測定，平均回收率及RSD值見表1。

2.10樣品的測定 取7個生產企業樣品，按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，進行含量測定。計算樣品中B-細辛醚的含量，結果見表2。

3.討論

3.1用甲醇、水超聲提取，結果雜質峰干擾嚴重，分離度較差。而采用甲醇加熱回流提取后用旋轉蒸發儀回收溶劑，可除去較多雜質峰，各組分能夠良好分離。

3.2采用不同流動相進行考察，乙腈和0.05%磷酸溶液梯度洗脫，結果出峰時間推遲且峰拖尾，甲醇和水比例為（65：35），結果峰分離差。用甲醇和水比例（46：44）結果峰形對稱，分離好且分析時間縮短。

3.3二十五味珊瑚丸中同時含B-細辛醚和a-細辛醚，是藏菖蒲發揮藥效的重要指標成分。目前國內無B-細辛醚和a-細辛醚標準品，國外購進的純度較低，B-細辛醚對照品色譜圖顯示含B-細辛醚和a-細辛醚兩種成分，但是樣品中a-細辛醚的含量低，故未建立a-細辛醚的含量測定方法。

3.4由于藏菖蒲藥材產地、年限、采收季節等因素不同，B-細辛醚含量明顯不同。同時結合78批次樣品含量測定結果，考慮該藥品存放時問、生產工藝穩定對B-細辛醚含量影響等因素，暫訂本品每1g含藏菖蒲以B-細辛醚計，應為0.40～2.20mg。

3.5對全國8家生產企業涉及的78批次的二十五味珊瑚丸進行了B-細辛醚的含量測定，范圍在0.30～2.20 mg/g之間，表2可以看出西藏甘露生產（批號：14125A）的二十五味珊瑚丸中B-細辛醚的含量最高，比由西藏藏醫學院生產（140701）的高6倍，說明不同生產企業的該藥品B-細辛醚含量差異較大，含量較低難以保證藥效，故建議現行標準增加B-細辛醚的含量測定以便控制該藥品質量。

綜上，本實驗采用HPLC法對藏藥二十五味珊瑚丸的質量進行了評價，并對建立的方法進行了詳盡的方法學考察，為二十五味珊瑚丸質量標準的提高提供了實驗依據，可作為二十五味珊瑚丸的質量控制方法。