燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血的保護作用及機制研究

馬曉靜　王嵐　殷小杰　王智民　劉曉謙　貢磊磊　陳兩綿　梁日欣　高慧敏

[摘要] 觀察燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血的保護作用，并探討其作用機制。該實驗選用SPF級雄性SD大鼠84只，隨機分為7組：假手術組、模型組、陽性藥組（尼莫地平組12 mg·kg-1）、燈盞花素片組（48 mg·kg-1）、燈盞乙素乙酯高、中、低劑量組（100，50，25 mg·kg-1）。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈結扎（MCAO）模型，觀察大鼠MCAO時神經功能狀態，TTC染色法測腦梗死面積，半自動生化分析儀測定血清中MDA，SOD，NO的變化。分別采用200 mg·L-1OxLDL和100 μg·L-1TNFα作用人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）24 h，建立OxLDL和TNFα細胞損傷模型，測定細胞上清液中MDA，SOD，NO，ET，6ketoPGF1α，TXB2，IL1，IL6，IL8，ICAM1和PECAM1水平。結果顯示，燈盞乙素乙酯能有效改善MCAO大鼠神經功能，明顯減小腦梗死面積。與模型組比較，血清中SOD和NO活性提高，MDA含量降低；細胞上清液中SOD，6ketoPGF1α和NO活性提高，IL1，IL6，IL8，ICAM1，PECAM1，TXB2，ET和MDA含量降低。結果表明，燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血具有一定的保護作用，其作用機制可能與抗氧化應激，改善血管內皮細胞功能及減輕炎性反應有密切關系。

[關鍵詞] 燈盞乙素乙酯； 中動脈結扎； 人臍靜脈內皮細胞； 氧化應激； 炎性反應

Protective effect and mechanism of scutellarin ethyl ester on focal

cerebral ischemia induced by ligation of middle cerebral artery in rats

MA Xiaojing， WANG Lan， YIN Xiaojie， WANG Zhimin， LIU Xiaoqian， GONG Leilei，

CHEN Liangmian， LIANG Rixin*， GAO Huimin*

（Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicine Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] To observe the protective effect of scutellarin ethyl ester on focal cerebral ischemia injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats（MCAOR）， and explore its mechanism. Totally 84 male SD rats were randomly divided into seven groups： shamoperated group， model group，positive drug group（niomdipine，12 mg·kg-1）， Brevisapin tablets group（48 mg·kg-1）， and high， middle and lowdose scutellarin ethyl ester groups（100， 50， 25 mg·kg-1）. The MCAOR model was prepared by using thread embolism method to observe the neurological function of rats， the area of cerebral infarction was measured with TTC， and the levels of MDA， SOD and NO in serum were detected with semiautomatic biochemistry analyzer.OxLDL and TNFα cell injury models was established by treating HUVECs with 200 mg·L-1 oxLDL and 100 μg·L-1TNFα，and the levels of MDA， SOD， NO， ET， 6ketoPGF1α，TXB2， IL1， IL6， IL8， ICAM1 and PECAM1 in the cell supernatant were determined. The results showed that scutellarin ethyl ester could effectively improve the neurological function of MCAOR rats， and significantly reduce the area of cerebral infarction. Compared with the model group， activities of SOD and NO in serum increased， while content of MDA decreased. In the cell supernatant， activities of SOD， 6ketoPGF1α and NO increased， content of IL1， IL6， IL8， ICAM1， PECAM1， TXB2， ET and MDA decreased， which indicated that scutellarin ethyl ester has a certain protective effect on focal cerebral ischemia injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats， and its mechanism may be related to antioxidative stress， improvement of endothelial function and reduction in inflammatory reaction.

[Key words] scutellarin ethyl ester； ligation of the middle cerebral artery； HUVEC； oxidative stress； inflammatory reaction

缺血性腦血管病是嚴重威脅人類健康的一種臨床常見病[1]，在中醫學中屬中風病范疇。西醫學主要以Ca2+拮抗劑，血管擴張劑及α腎上腺素受體抑制劑為主要治療手段。中醫學則采用血塞通，丹紅注射液，燈盞花素，葛根素等活血益氣藥。燈盞花素是從菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬中提取的黃酮類有效成分，包括燈盞乙素和少量的燈盞甲素。藥理研究表明，燈盞花素具有擴張血管，增加腦血流量，降低腦血管阻力及抗血小板聚集等作用；臨床上主要用于腦中風后遺癥的治療[2]。但是，就目前上市的燈盞花素制劑來說，其注射劑半衰期短，消除速度快；而且，作為中風恢復期用藥，患者多選擇在家庭接受治療，注射給藥不認為是最佳給藥途徑。片劑雖然方便廉價，但存在生物利用度極低的問題。因此，如何對燈盞乙素開展前藥設計，提高生物利用度是迫切需要解決的問題。課題組在前期工作中，引入前藥設計理念，結合制劑學的考慮，合成了一系列燈盞乙素衍生物，發現其中的燈盞乙素乙酯（DZY02）對大鼠中動脈結扎所致的局灶性腦缺血具有保護作用，本文是在其藥效學初篩的基礎上，采用大鼠大腦中動脈結扎造成局灶性腦缺血模型，進一步觀察了DZY02對腦缺血的保護作用；并采用OxLDL和TNFα誘導人臍靜脈內皮細胞損傷模型，從抗氧化和內皮細胞保護等角度，探討了作用機制，旨在為燈盞乙素乙酯開發成為防治腦缺血的新藥提供科學依據。

1 材料

1.1 動物及細胞株

SPF級SD大鼠，雄性，體重200～220 g，購自中國食品藥品檢定研究院，合格證號SCXK（京）20090017。人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）由中國中醫科學院中藥研究所崔紅玉惠贈。

1.2 藥物及試劑

燈盞乙素乙酯（中國中醫科學院中藥研究所中藥質量標準中心高慧敏研究員提供，批號140210）；尼莫地平購自天津市中央藥業有限公司（批號130106）；燈盞花素片購自廣東彼迪藥業有限公司（批號20131101）；紅四氮唑（TTC，美國Amresco試劑公司）；總超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（批號20131228）、丙二醛（MDA）測試盒（批號20131230）、一氧化氮（NO）測試盒（批號20140318）均購自南京建成生物工程研究所；Hyclone DMEM高糖培養基購自美國Thermo公司（批號NYK0997）；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司（批號130928）；0.25%胰酶購自美國Gibco公司（批號1155732）；DMSO（ACS級）購自美國Amereso公司；噻唑藍（MTT）購自Sigma公司；OxLDL購自北京協生生物技術有限公司（批號20140109，質量濃度1.32 g·L-1）；內皮素（ET）放免試劑盒（批號20150620）、6酮前列腺素1α（6ketoPGF1α）放免試劑盒（批號20150620），血栓烷素B2（TXB2）放免試劑盒（批號20150620）均購自北京北方生物技術研究所；白介素1（IL1）定量檢測試劑盒（批號201607AO201701AC）、白介素6（IL6）定量檢測試劑盒（批號 201607AN201701ZC）、白介素8（IL8）定量檢測試劑盒（批號201607JD201701AT）均購自上海騫億生物科技有限公司。MCAO栓線（北京沙東生物技術有限公司，編號2432A3100）。

1.3 儀器

SWCF2FD雙人單面超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；MCO18AIC（UV）型CO2培養箱（日本SANYO公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Varioskan Flash多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；GFD800半自動生化儀﹙山東高密彩虹分析儀器有限公司）。

2 方法

2.1 燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血的保護作用

2.1.1 分組與給藥 84只大鼠隨機分為7組，每組12只。假手術組及模型組給予等量蒸餾水；按體表面積法換算等量動物的等效劑量，陽性藥尼莫地平組給予12 mg·kg-1；燈盞花素片組給予48 mg·kg-1；燈盞乙素乙酯組分高、中、低劑量組，分別為給予100，50，25 mg·kg-1。每日灌胃給藥1次，連續12 d；術后各組再給藥1次。DZY02藥物配制：將DZY02與MCT（中鏈甘油三酸酯）混合并充分研磨至均勻后，加阿拉伯膠，并加入少量水，研磨，使之乳化成初乳，再逐漸加水稀釋至全量，其中DZY02，MCT和阿拉伯膠比例為1∶2∶4。

2.1.2 大腦中動脈梗塞動物模型[3]（MCAO法） 大鼠用350 mg·kg-1的水合氯醛腹腔注射麻醉。頸部正中切口約2 cm，在一側的肩胛舌骨和胸鎖乳突肌形成的三角處暴露頸總動脈（CCA）及其分支頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA）。結扎ECA及其分支枕動脈、甲狀腺上動脈及ECA終末支，分離ICA的分支翼突腭動脈。夾閉CCA，ICA及翼突腭動脈，將前端燒成0.3 mm小球的尼龍線自ECA切口插入，導入至ICA，松開ICA，繼續插入尼龍線至其顱內段，當感到有明顯阻力時，此時插入尼龍線距CCA分叉處約2 cm，即可阻斷大腦中動脈（MCA）。假手術動物插線入1 cm，其余處理同模型。

2.1.3 神經功能評分[4] 在大腦中動脈結扎24 h，按Longa評分的5級4分法進行評分。0分：無明顯神經功能缺損癥狀；1分：神經功能輕微缺損，不能完全伸展對側前爪；2分：局灶性神經功能中度缺損，向對側旋轉；3分：局灶性神經功能重度缺損，行走時向對側傾倒；4分：不能自行行走及昏迷。

2.1.4 腦梗死面積檢測 大腦中動脈結扎后24 h，動物處死取腦，梗死部位切成2 mm厚片，放入已配好的TTC 5 mL染液瓶中，立即放入37 ℃水浴，20～30 min后取出染液瓶，棄染液，在原瓶內放入5 mL的10%甲醛，固定24 h，取出稱重。腦切片染色后掃描（采用PhotoShop 6.0 軟件測量像素，分析梗死面積[5]），計算腦重指數和梗死率。腦重指數=腦重/體重×100%；梗死率=梗死面積/全腦面積×100%。

2.1.5 MDA，SOD和NO檢測 大腦中動脈結扎后24 h，腹主動脈采血5 mL，3 000 r·min-1離心15 min以分離血清，用于MDA，SOD和NO的測定。

2.2 燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血保護作用的機制研究

2.2.1 DZY02母液的配制 取DZY02粉末約1 mg，精密稱定，溶于50 μL DMSO中，用不含血清的DMEM高糖培養基稀釋至10 mL，超聲2 h促進藥物溶解，藥物終濃度為100 mg·L-1。超聲后用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，實驗時用不含血清的DMEM高糖培養基配成所需濃度，現用現配。

2.2.2 細胞培養 復蘇的HUVECs，按4.0×104個/mL的密度接種于20 mm×100 mm培養皿中，加入10 mL的10%FBS DMEM培養基（含1×105 U·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，20 mmol·L-1的谷氨酰胺），置37 ℃，5%CO2培養箱培養。次日換液，2～3 d待細胞長至融合后，以0.25%胰酶EDTA消化按1∶3傳代，細胞長至對數期用于實驗。

2.2.3 OxLDL誘導HUVECs損傷模型建立及藥物預處理 OxLDL以200 mg·L-1作用細胞24 h為造模條件。取生長狀態良好的HUVEC細胞，以7.0×104 個/mL接種于96孔板，每孔0.1 mL，24 h細胞貼壁后，分為對照組、模型組、DZY02組（2.5，5，10 mg·L-1，無血清DMEM溶解，過濾除菌）；給藥組DZY02預先干預24 h，對照組和模型組給予等量的無血清培養基。24 h后，吸棄上清，模型組和給藥組加入終濃度200 mg·L-1OxLDL的培養基，對照組不做處理，各組均置37 ℃和5%CO2培養箱培養24 h，每個濃度設5個復孔。

2.2.4 TNFα誘導細胞損傷模型的建立及藥物預處理 TNFα以100 μg·L-1作用細胞為造模條件。取生長狀態良好的HUVEC細胞，以7.0×104 個/mL接種于96孔板，每孔0.1 mL，24 h細胞貼壁后，分為對照組、模型組、DZY02組（2.5，5，10 mg·L-1，無血清DMEM溶解，過濾除菌）；給藥組DZY02預先干預24 h，對照組和模型組給予等量的無血清培養基。24 h后，吸棄上清，模型組和給藥組加入終濃度100 μg·L-1TNFα的培養基，對照組不做處理，各組均置37 ℃和5%CO2培養箱培養24 h，每個濃度設5個復孔。

2.2.5 細胞存活率測定 模型處理結束后，吸出上清液，每孔加入200 μL培養基和50 g·L-1的MTT 20 μL孵育4 h，吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μL，搖床避光震蕩15 min后用酶標儀檢測吸光度（A），吸收波長為570 nm，每組設5個復孔。

2.2.6 MDA，SOD，NO/ET，6ketoPGF1α/TXB2，ICAM1，PECAM1及IL1，IL6，IL8的測定 模型處理結束后，吸出上清液，按試劑盒說明進行測定。

2.3 統計學方法

數據用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗（假手術組與模型組）或ANOVA單因素方差分析，組間比較方差齊時采用LDS，方差不齊時采用GamesHowell；有序資料采用Ridit分析，P<0.05為有統計學差異。

3 結果

3.1 燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血的保護作用

3.1.1 對腦缺血大鼠大鼠腦梗死體積及梗死率的影響 燈盞乙素乙酯高、中、低3個劑量組均明顯降低腦缺血大鼠腦梗體積和梗死率，與模型組比較，具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），見表1。

3.1.2 對腦缺血大鼠行為評分的影響 腦缺血大鼠行為學評分，模型組與假手術組比較，有顯著性差異（P<0.01）；各給藥組與模型組比較，也均有顯著差異（P<0.05或P<0.01），提示燈盞乙素乙酯及陽性藥均對腦缺血大鼠的行為學有明顯的改善作用；而各給藥組之間的神經行為學評分無顯著差異，見表2。

3.1.3 對腦缺血大鼠血清SOD，MDA及NO含量的影響 燈盞乙素乙酯低劑量組提高SOD和NO活性，降低MDA含量，與模型組比較，有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；高、中劑量組對其沒有影響，尼莫地平和燈盞花素提高SOD 活性，見表3。

3.2 燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血作用的機制研究

3.2.1 對OxLDL誘導HUVECs損傷的影響 與對照組比較，200 mg·L-1的OxLDL可明顯降低HUVEC的存活率（P<0.01）。與模型組相比，DZY02組（2.5，5，10 mg·L-1）3個濃度可顯著提高OxLDL誘導的HUVECs的存活率（P<0.05），見表4。

3.2.2 對OxLDL誘導HUVECs損傷細胞上清液中MDA和SOD含量的影響 與對照組相比，模型組MDA含量明顯升高（P<0.01），SOD及NO含量降低（P<0.01）。藥物處理組與模型組相比，DZY02組（2.5，5，10 mg·L-1）MDA含量顯著降低（P<0.05），SOD及NO含量顯著升高（P<0.05），見表5。

3.2.3 對OxLDL誘導HUVECs損傷細胞上清液中NO/ET，6ketoPGF1α，TXB2含量的影響 與對照組相比，模型組中ET，TXB2的含量明顯升高（P<0.01），NO及6ketoPGF1α含量降低（P<0.01）。各藥物處理組與模型組比較（2.5，5，10 mg·L-1），使ET，TXB2的含量顯著降低，NO和6ketoPGF1α含量升高（P<0.01），見表6。

3.2.4 對OxLDL誘導HUVECs損傷細胞上清液中ICAM1和PECAM1的影響 與空白組比較，模型組ICAM1和PECAM1含量明顯升高（P<0.01），與模型組相比，3個給藥組（2.5，5，10 mg·L-1）能顯著降低ICAM1和PECAM1的含量（P<0.05），見表7。

3.2.5 對TNFα誘導損傷的HUVECS存活率的影響 與空白組比較，100 μg·L-1的TNFα可明顯降低HUVEC的存活率（P<0.001）。與模型組相比，經DZY02預先干預24 h后，2.5，5，10 mg·L-13個劑量均提高了HUVEC的存活率（P<0.05），并且隨著藥物劑量增加呈現一定的量效關系，見表8。

3.2.6 對TNFα誘導損傷的HUVECs分泌炎性因子的影響 與空白組比較，模型組的IL1，IL6，IL8含量明顯升高（P<0.05），與模型組比較，DZY02組2.5，5，10 mg·L-13個劑量顯著降低了IL1，IL6和IL8的含量（P<0.05），見表9。

3.2.7 對TNFα誘導損傷的HUVECs分泌ICAM1和PECAM1的影響 與空白組比較，模型組的ICAM1和PECAM1含量明顯升高（P<0.01），與模型組比較，DZY02組2.5，5，10 mg·L-13個劑量顯著降低了ICAM1和PECAM1的含量（P<0.05），見表10。

4 討論

缺血性腦血管疾?。↖CVD）是目前世界上致死率較高的疾病之一，主要由短暫性和持久性的局部

腦缺血引起，其發生和發展是多因素、多機制及多環節的惡性級聯過程，可能與自由基損傷、炎性反應及血管內皮細胞損傷有關[6]。本文從行為學、形態學及生物標志物等方面證實了燈盞乙素乙酯對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用；并從抗氧化、炎性反應

和內皮細胞保護等角度，進一步證實了燈盞乙素乙酯對腦缺血損傷的保護作用可能與抗氧化應激，降低炎性反應及保護血管內皮細胞功能有關。

4.1 對MCAO損傷后大鼠神經功能缺損及腦梗死體積的改善作用

MCAO損傷是一種常見的臨床病理生理過程，由此引發的腦腫脹，可引起神經功能障礙，并最終導致死亡[7]。大腦調節運動區域的血流主要由MCA提供，MCA阻斷后該區域腦組織發生缺血性損傷，因此，MCAO損傷后大鼠出現神經功能障礙，表現為肢體肌無力，運動時向左側旋轉。本實驗結果顯示，燈盞乙素乙酯能夠降低神經動能評分及腦梗死體積，提示燈盞乙素乙酯可以改善MCA大鼠的神經功能障礙，對腦缺血性損傷具有保護作用。

4.2 提高MCAO損傷后大鼠的抗氧化應激能力

腦缺血性損傷的發病機制涉及多因素，但主要與缺血本身直接攻擊腦細胞，造成腦組織壞死，影響細胞內部的基因調控，誘導細胞凋亡有關，而這2個因素都與氧化應激密不可分。MDA是氧自由基引發的生物膜不飽和脂肪酸過氧化反應的代謝產物，反映了細胞損傷程度。SOD作為天然抗氧化劑，能夠清除體內的氧自由基，其活性反映了機體清除氧自由基的能力[8]。本實驗觀察到，MCAO損傷模型組大鼠血漿MDA水平升高，SOD活性降低，說明腦缺血后機體氧自由基大量產生，而清除氧自由基能力障礙。燈盞乙素乙酯能夠降低MDA水平，提高SOD活性和NO水平，表明其能夠減輕腦缺血引起的氧自由基損傷，具有一定的抗氧化應激作用。

4.3 燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血作用的機制研究

缺血性損傷引起腦組織中鈣超載，氧自由基（氧化應激）和炎性因子大量生成，三者之間可互相促進。在缺血性損傷發生后的數小時內，炎性因子表達的顯著增加會引發腦組織損傷，從而導致氧自由基的產生[9]，過量的自由基通過破壞膜結構導致神經元死亡。神經細胞脂質膜的損傷使其通透性增加，又造成鈣離子超載及促炎因子的大量釋放，進一步加劇氧化應激過程。氧化應激和炎性反應互相促進，誘導細胞中凋亡基因表達，促使細胞凋亡，造成了腦組織缺血后連鎖反應。缺血后的氧化應激和炎性反應是腦組織不可逆損傷的重要機制之一。因此，本文分別采用OxLDL和TNFα誘導損傷的HUVECs 模型，從抗氧化應激，血管內皮細胞保護和影響炎性反應的角度，探討燈盞乙素乙酯的作用機制。

ET和NO是近幾年發現的血管調節因子。ET具有強烈而持久的縮血管作用，而NO具有明顯的擴血管作用，并抑制血小板聚集。正常狀態下，二者的合成釋放保持動態平衡，維持血管的正常舒縮功能，ICVD 的發生發展與這種平衡的破壞有關[10]。PGI2是血管內皮細胞合成釋放的具有舒血管和抗血小板聚集作用的生物活性物質，而TXA2是促進血小板聚集和血管收縮的生物活性物質，兩者由于半衰期短，分別迅速轉化為6ketoPGF1α和TXB2[11]。正常生理狀態下，PGI2和TXA2 保持動態平衡，調節血管的舒縮活動，防止血栓形成[12]。本文觀察到，在OxLDL損傷狀態下，HUVECs分泌NO和6ketoPGF1α減少，ET和TXB2分泌增多，NO/ET和6ketoPGF1α/TXB2比例失調，同時，MDA產生增多，SOD活性降低，表明氧化損傷能夠導致內皮細胞功能紊亂并影響細胞內抗氧化活性物質的分泌。燈盞乙素乙酯作用于OxLDL損傷的HUVECs后，增加NO和6ketoPGF1α的釋放，減少ET和TXB2的分泌，MDA產生減少，SOD活性升高，表明燈盞乙素乙酯對MCAO損傷后大鼠的保護作用可能與改善血管內皮細胞功能和抗氧化應激有關。

炎癥反應在腦缺血損傷中起重要作用，在腦缺血早期炎癥介質如IL1，IL6，IL8及TNFα等即可產生，是白細胞聚集，游出血管發揮細胞毒過程中的關鍵因素。白細胞聚集阻塞腦微血管，誘發血栓形成；游出的白細胞通過進一步釋放炎性因子及氧自由基等直接損傷神經元及膠質細胞，進而加重，腦缺血后的繼發性腦損害[13]。本文采用TNFα誘導損傷的HUVECs模型，探討燈盞乙酸乙酯的作用機制，結果顯示，TNFα誘導損傷的HUVECs模型組，IL1，IL6，IL8明顯升高，燈盞乙酸乙酯降低IL1，IL6，IL8的釋放，表明減輕炎性反應可能是燈盞乙素乙酯保護MCAO所致大鼠腦缺血損傷保護作用的機制之一。

ICAM1和PECAM1是免疫球蛋白超家族成員，與腦缺血后繼發神經元損傷及炎性機制有密切關系。黏附分子的表達和活化是一個復雜而且高度調控的過程。多種介質，如氧自由基、TNFα等均可以上調黏附分子的表達[14]。在局灶性腦缺血炎性反應過程中，促進白細胞的活化、聚集、遷移及與血管內皮細胞黏附，進而通過各種機制，加重腦組織損傷。本文在OxLDL和TNFα誘導HUVECs損傷的實驗中觀察到，OxLDL和TNFα均升高ICAM1和PECAM1，與文獻報道一致。燈盞乙素乙酯可以降低ICAM1和PECAM的分泌，表明黏附因子可能參與了燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血的保護作用。

綜上所述，燈盞乙素乙酯對大鼠大腦中動脈結扎所致局灶性腦缺血具有良好的保護作用，其作用機制可能與抗氧化應激，改善血管內皮細胞功能及減輕炎性反應有密切關系。

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[責任編輯 張寧寧]