姬松茸多糖ABP-AW1對免疫功能低下小鼠的免疫增強作用

蔣麗艷，于智浦，姚淑娟，劉伯陽，劉吉成

（齊齊哈爾醫學院1.醫學技術學院，2.附屬第二醫院，黑龍江齊齊哈爾 161000）

·論 著·

姬松茸多糖ABP-AW1對免疫功能低下小鼠的免疫增強作用

蔣麗艷1，于智浦2，姚淑娟1，劉伯陽1，劉吉成1

（齊齊哈爾醫學院1.醫學技術學院，2.附屬第二醫院，黑龍江齊齊哈爾 161000）

目的探討低分子質量姬松茸多糖ABP-AW1對免疫功能低下小鼠的免疫增強作用。方法ICR小鼠ip給予環磷酰胺80 mg·kg-1，連續3 d，制備免疫功能低下小鼠模型；隨后分別ig給予ABP-AW1 125，250和500 mg·kg-1，每天1次，連續7 d。治療結束后處死小鼠，檢測小鼠胸腺指數和脾指數，碳廓清實驗檢測小鼠巨噬細胞吞噬功能，MTT法檢測小鼠脾淋巴細胞增殖反應，ELISA法檢測小鼠脾淋巴細胞分泌白細胞介素2（IL-2）和干擾素γ（IFN-γ）水平，流式細胞術檢測小鼠脾T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+比值。結果與正常對照組比較，免疫低下模型小鼠胸腺指數和脾指數以及巨噬細胞吞噬指數均降低（P＜0.05）；ABPAW1 250和500 mg·kg-1可顯著提高免疫低下模型小鼠胸腺指數和脾指數（P＜0.05），升高巨噬細胞吞噬指數（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型小鼠伴刀豆凝集素A（Con A）和脂多糖（LPS）分別誘導的T淋巴細胞增殖反應和B淋巴細胞增殖反應降低，脾細胞分泌IL-2和IFN-γ水平降低，脾細胞CD4+/CD8+比值下降（P＜0.05）；與模型組比較，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1可促進免疫低下模型小鼠Con A和LPS分別誘導的T淋巴細胞增殖反應和B淋巴細胞增殖反應（P＜0.05），顯著增加脾細胞IL-2和IFN-γ水平（P＜0.05），明顯逆轉免疫低下小鼠脾細胞CD4+/CD8+比值的下降（P＜0.05）。結論ABP-AW1對免疫功能低下小鼠具有一定的免疫增強作用。

姬松茸；多糖；ABP-AW1；環磷酰胺；免疫抑制

姬松茸（Agaricus blazeiMurill，ABM）又名巴西蘑菇，原產于巴西，是一種兼具藥用及食用價值的名貴真菌［1］。研究表明，藥用ABM具有免疫調節、抗炎和抗腫瘤等多種藥理學作用［2］。多糖是ABM的主要成分之一，因其具有天然、低毒等優勢而受到廣大學者的關注。大量實驗資料表明，ABM多糖有抗炎和抗腫瘤等功效［3-5］。本實驗室從ABM子實體中分離純化出一種結構新穎的水溶性多糖，代號為ABP-AW1，并經氣相色譜和高效凝膠排阻色譜等方法確定其為組分均一的低分子質量（50 ku）多糖［6］。前期研究結果表明，ABP-AW1可以增強卵白蛋白致敏小鼠的體液免疫和細胞免疫功能［7］。本研究觀察ABP-AW1對免疫功能低下模型小鼠的免疫增強作用，為其開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

ABP-AW1由齊齊哈爾醫學院醫藥研究所分離純化［6］，純度＞95%，用生理鹽水配置。注射用環磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）購自上海華聯制藥有限公司，用生理鹽水配置；RPMI 1640培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國HyClone公司；小鼠脾淋巴細胞分離液、白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）檢測用ELISA試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司；大鼠抗小鼠CD4-FITC抗體、大鼠抗小鼠CD8a-PE抗體、MTT和二甲亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；伴刀豆凝集素A（concanavalin A，ConA）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）購自美國Sigma公司。酶標儀（奧地利TECAN公司）；FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 動物

健康雌性ICR小鼠，體質量18～22 g，由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供，實驗動物合格證號SCXK（吉）-2015-003。小鼠常規飼養于齊齊哈爾醫學院實驗動物中心，許可證SYXK（黑）2016-001，室溫20～24℃，濕度55%～70%，12/12 h光照/黑暗，自由飲水攝食。

1.3 動物分組和給藥

將小鼠隨機分為5組：正常對照組、模型對照組及ABP-AW1 125，250和500 mg·kg-1組，每組10只。除正常對照組外，各組小鼠ip給予Cy 80 mg·kg-1，每天1次，連續3 d，制備免疫低下模型小鼠；正常對照組小鼠給予等量生理鹽水。隨后ABP-AW1組小鼠每天分別ig給予ABP-AW1 125，250和500 mg·kg-1，每天1次，連續7 d；正常對照組和模型對照組予以等量生理鹽水。

1.4 小鼠巨噬細胞吞噬功能的測定

末次給藥后1 h，測體質量，各鼠尾靜脈注射印度墨汁（10 mL·kg-1），注射后2 min（T1）和10 min（T2）從小鼠眼眶靜脈叢取血20 μL，溶于0.1% Na2CO3溶液2.0 mL，搖勻后放置20 min，于680 nm波長處測定T1和T2時間點樣品的吸光度（A1和A2）值。根據公式計算廓清指數（K），K=（lgA1-lgA2）/（T2-T1）［8］。將小鼠處死，取肝和脾稱重，計算吞噬指數（α），α=K1/3×體質量/（肝質量+脾質量）［8］

1.5 小鼠臟器指數的測定

分離小鼠脾和胸腺，稱重，依據公式計算脾指數和胸腺指數。胸腺指數=胸腺質量（mg）/體質量（g）；脾指數=脾質量（mg）/體質量（g）。

1.6 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗

參照小鼠脾淋巴細胞分離液說明書，分離各組小鼠脾淋巴細胞，制備脾淋巴細胞懸液。按每孔100 μL含5×105細胞將細胞接種至96孔培養板［9］。設細胞對照組、Con A組和LPS組，每組設3復孔。細胞對照組細胞用完全培養基常規培養，Con A和LPS組細胞在接種當天分別給予含Con A 5 mg·L-1或LPS 1 mg·L-1的培養基培養。將細胞置于37℃、含5%CO2的培養箱中培養60 h后，各孔加入MTT 5 g·L-1溶液20 μL，繼續培養4 h。隨后棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩溶解結晶，酶標儀測定570 nm波長處的吸光度（A570nm）值。

1.7 小鼠脾淋巴細胞IL-2和IFN-γ水平的測定

參照IL-2和IFN-γ的ELISA試劑盒說明書，檢測1.6項制備的脾淋巴細胞培養上清液中IL-2及IFN-γ的含量。

1.8 流式細胞術檢測小鼠脾T淋巴細胞亞群CD4+/ CD8+比值

取各組小鼠脾淋巴細胞懸液50 μL置于流式管中，加入大鼠抗小鼠CD4-FITC抗體和大鼠抗小鼠CD8a-PE抗體，混勻后在室溫下避光孵育30 min。加入PBS 2 mL，250×g離心5 min，用PBS洗滌細胞2次。棄去上清，加入PBS 0.5 mL溶液將細胞重懸，用BD FACS Calibur流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T淋巴細胞，計算CD4+/CD8+比值。

1.9 統計學分析

實驗結果數據以x±s表示，應用統計軟件SPSS17.0進行數據統計分析，組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析和t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ABP-AW1對免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

圖1結果可見，與正常對照組相比，Cy誘導的免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能減退，吞噬指數顯著減?。≒＜0.05）。與模型組相比，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d，可顯著提高Cy所致免疫低下模型小鼠巨噬細胞吞噬指數（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of ABP-AW1,low-molecular-mass poly?saccharides isolated from Agaricus blazei Murill，on phagocytic index of cyclophosphamide（Cy）-induced immunosuppression mice.Mice were ip given Cy 80 mg·kg-1once daily for three days，and then were administrated ig with ABP-AW1 for 7 d.，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with Cy group.

2.2 ABP-AW1對免疫低下小鼠臟器指數的影響

圖2結果可見，與正常對照組比較，模型組小鼠胸腺指數和脾指數顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d顯著提高免疫低下小鼠的胸腺指數和脾指數（P＜0.05），但尚未達到正常對照組水平。

2.3 ABP-AW1對免疫低下小鼠脾淋巴細胞增殖反應的影響

Fig.2 Effect of ABP-AW1 on organ index of Cy-induced immunosuppression mice.See Fig.1 for the mouse treat?ment.Thymus index=thymus mass（mg）/body mass（g）.Spleen index=spleen mass（mg）/body mass（g）.n=10.＊P＜0.05，compared with corresponding normal control group；#P＜0.05，compared with corresponding Cy group.

圖3結果表明，采用Con A和LPS分別刺激脾淋巴細胞，模型小鼠脾淋巴細胞增殖反應均受到明顯抑制（P＜0.05）；與模型組相比，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d可促進Con A誘導的T淋巴細胞增殖反應（P＜0.05）和LPS誘導的B淋巴細胞增殖反應（P＜0.05），只有500 mg·kg-1組可以達到正常對照組水平，其余組與正常對照組相比仍有顯著差異（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of ABP-AW1 on spleen lymphocyte prolifer?ation induced by concanavalin A（Con A）or lipopoly?sacchride（LPS）in Cy-induced immunosuppression mice detected by MTT method.See Fig.1 for the mouse treatment.n=10.＊P＜0.05，compared with corresponding normal control group；#P＜0.05，compared with corresponding Cy group.

2.4 ABP-AW1對免疫低下小鼠脾細胞細胞因子生成的影響

圖4結果可見，模型組小鼠脾細胞IL-2和IFN-γ水平較正常對照組顯著降低（P＜0.05）。給予ABPAW1 250和500 mg·kg-1治療7 d，能顯著增加免疫低下小鼠脾細胞IL-2和IFN-γ的生成（P＜0.05），但均未恢復至正常對照組水平（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of ABP-AW1 on levels of interleukin-2（IL-2）and interferon-γ（IFN-γ）in spleen lymphocytes of Cyinduced immunosuppression mice.See Fig.1 for the mouse treatment.，n=10.＊P＜0.05，compared with corre?sponding normal control group；#P＜0.05，compared with corre?sponding Cy group.

2.5 ABP-AW1對免疫低下小鼠T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+的影響

Fig.5 Effect of ABP-AW1 on T lymphocyte CD4+/CD8+ratio in spleen of Cy-induced immunosuppression mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：representative data of flow cytometric analysis；B：the quantification of A.n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，com?pared with Cy group.

圖5結果表明，與正常對照組相比，免疫低下模型小鼠脾T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d可逆轉免疫低下模型小鼠脾細胞CD4+/CD8+比值的下降（P＜0.05），但尚未達到正常對照組水平。

3 討論

Cy是一種烷化類免疫抑制劑，可殺傷淋巴細胞，抑制細胞免疫和體液免疫，因而常用于制備免疫功能低下動物模型［10-12］。本研究選用單次ip給予Cy 80 mg·kg-1抑制小鼠免疫功能。結果顯示，模型組小鼠免疫功能與正常對照組比較明顯降低，表明成功制備免疫功能低下小鼠模型。

本課題組前期研究結果顯示，低分子量ABM多糖具有抗腫瘤功效，能顯著抑制體外培養肝癌細胞的遷移能力［4］。這種抗腫瘤效應可能與其增強NK細胞活性有關［13］，提示低分子質量ABM多糖可能具有免疫增強作用。本研究進一步研究了低分子質量ABM多糖ABP-AW1對免疫功能低下小鼠的免疫增強作用。結果顯示，小鼠ig給予ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d，可改善免疫低下小鼠胸腺和脾萎縮，使胸腺指數和脾指數升高。

單核巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的指標之一［14］。本研究結果表明，ABPAW1 250和500 mg·kg-1組小鼠巨噬細胞吞噬指數較模型組明顯提高，提示ABP-AW1對免疫低下小鼠的非特異性免疫功能有一定的增強作用。淋巴細胞增殖反應能夠直接反映機體免疫功能狀態。淋巴細胞按其功能不同可分為B淋巴細胞、T淋巴細胞和NK細胞。一般以LPS刺激B淋巴細胞增殖，Con A誘導T淋巴細胞增殖，用于檢測檢測B和T細胞的免疫反應［15-16］。本研究結果表明，ABPAW1治療7 d能顯著促進免疫低下小鼠脾T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖反應，提示ABP-AW1可能通過促進機體淋巴細胞的增殖活性，提高機體免疫功能。IL-2和IFN-γ是在機體免疫調節中起重要作用的細胞因子，主要由活化的Th1細胞或CD4+T細胞產生。本研究結果表明，模型組小鼠脾淋巴細胞中IL-2和IFN-γ水平較低，而ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療能促進免疫低下小鼠脾淋巴細胞生成IL-2和IFN-γ，這可能是ABP-AW1調節機體免疫功能的機制之一。T淋巴細胞亞群在病毒感染和惡性腫瘤等多種疾病中都會發生異常改變。一般認為，CD4+/ CD8+細胞比值在一定程度上可以反映機體的免疫功能狀態，CD4+/CD8+細胞比值下降，表明機體免疫功能低下；CD4+/CD8+比值升高，表明免疫功能增強［17-18］。本研究結果顯示，模型組小鼠脾CD4+/ CD8+細胞比值明顯低于正常對照組，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1可使CD4+/CD8+細胞比值明顯升高，提示ABP-AW1可改善免疫低下小鼠的免疫功能狀態。

綜上所述，ig給予ABP-AW1 250和500 mg·kg-1連續7 d，對免疫功能低下小鼠具有免疫增強作用。降低ABP-AW1劑量并延長給藥時間，或者提高ABP-AW1劑量能否進一步增強療效有待進一步研究。

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Immunity-enhancing effect of polysaccharide ABP-AW1 isolated from Agaricus blazei Murill on immunosuppressive mice

JIANG Li-yan1,YU Zhi-pu2,YAO Shu-juan1,LIU Bai-yang1,LIU Ji-cheng1

(1.College of Medical Technology,2.The Second Affiliated Hospital,Qiqihar Medical University, Qiqihar 161000,China)

OBJECTIVETo explore the immunity-enhancing effect of ABP-AW1,a low-molecularmass polysaccharides isolated fromAgaricus blazeiMurill,on immunosuppressive mice.METHODSICR mice were ip injected cyclophosphamide 80 mg·kg-1,once daily for 3 d,to establish an immuno?suppressive mouse model.Then,ABP-AW1 125,250 and 500 mg·kg-1were ig given to the immuno?suppressive mice,respectively,once daily for 7 d.The mouse thymus index and spleen index were calcu?lated,and the phagocytic function of phagocytes was determined using carbon clearance test.Splenic lym?phocyte proliferation was measured by MTT method.The interleukin 2(IL-2)and interferon γ(IFN-γ) production from splenic lymphocytes was examined by ELISA.The splenic lymphocyte CD4+/CD8+ratio was determined by flow cytometric analysis.RESULTSCompared with normal control group,the thymus index,spleen index and phagocytic index of phagocytes in the immunosuppressive model mice declined(P＜0.05).ABP-AW1 250 and 500 mg·kg-1treatment significantly increased the thymus index,spleen index and phagocytic index in immunosuppressive mice(P＜0.05).Compared with normal control group,concanavalin A(Con A)and lipopolysaccharide(LPS)induced T and B lymphocyte proliferation, respectively,and IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes in the immunosuppressive model mice was lower(P＜0.05).Compared with model group,ABP-AW1 250 and 500 mg·kg-1promoted Con A and LPS induced T and B lymphocyte proliferation(P＜0.05),and elevated IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes(P＜0.05).In addition,ABP-AW1 250 and 500 mg·kg-1reversed the decreased splenocyte CD4+/CD8+ratio in immunosuppressive model mice(P＜0.05).CONCLUSIONABP-AW1 has immuneity-enhancing effect on cyclophosphamide-induced immunosuppressive mice.

Agaricus blazeiMurill;polysaccharides;ABP-AW1;cyclophosphamide;immunosup?pression

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81173609)

LIU Ji-cheng,Tel:13304621328,E-mail:qyybliu@126.com

R285.1

：A

：1000-3002-（2017）05-0393-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.05.003

2016-11-22 接受日期：2017-05-12）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學基金（81173609）

蔣麗艷，碩士研究生，主要從事藥理學研究；劉吉成，博士，教授，主要從事分子藥理學和腫瘤藥理學研究。

劉吉成，Tel：13304621328，E-mail：qyybliu@ 126.com