吡唑啉酮衍生物鎘（Ⅱ）配合物體內外對黑素瘤B16細胞的抗腫瘤作用

常晨晨，吳 婷，2，汪梅芳，許貫誠，孫素榮

（新疆大學1.生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，3.應用化學研究所，先進功能材料自治區重點實驗室，新疆烏魯木齊 830046；2.新疆維吾爾自治區人民醫院，新疆烏魯木齊 830002）

吡唑啉酮衍生物鎘（Ⅱ）配合物體內外對黑素瘤B16細胞的抗腫瘤作用

常晨晨1，吳 婷1，2，汪梅芳1，許貫誠3，孫素榮1

（新疆大學1.生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，3.應用化學研究所，先進功能材料自治區重點實驗室，新疆烏魯木齊 830046；2.新疆維吾爾自治區人民醫院，新疆烏魯木齊 830002）

目的研究吡唑啉酮鎘（Ⅱ）配合物1-苯基-3-甲基-4-丙?；?5-吡唑啉酮縮水楊酰肼-鎘（Ⅱ）（Cd-PMPP-SAL）體內外對小鼠黑素瘤B16細胞的抗腫瘤作用及其作用機制。方法以Cd-PMPP-SAL 1.0，1.5，3.0，5.0和10.0 mg·L-1分別作用小鼠黑素瘤B16細胞24，48和72 h，采用MTT法檢測B16細胞存活率；Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50和25.00 mg·L-1作用B16細胞24 h，用Hoechst33258染色觀察B16細胞形態，AnnenxinⅤ/PI雙染色法檢測B16細胞凋亡率；胱天蛋白酶活性檢測試劑盒檢測B16細胞內胱天蛋白酶活性。C57BL/6J小鼠皮下接種B16細胞制備荷瘤模型，5 d后分別瘤內注射Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50和25.00 mg·kg-1，每天1次，連續12 d。每天檢測體質量，給藥結束后處死小鼠，測量瘤體積并測瘤質量，計算抑瘤率。HE染色法觀察瘤體、肝和肺組織病理變化；免疫組織化學法檢測腫瘤組織中血管內皮生長因子（VEGF）和成纖維細胞生長因子2（FGF2）蛋白表達；TUNEL法檢測移植瘤組織內的細胞凋亡。結果Cd-PMPP-SAL抑制B16細胞存活，IC50為4.946 mg·L-1，95%置信限為4.24～5.65 mg·L-1；Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·L-1作用24 h，B16細胞凋亡率為（12.8±1.4）%和（18.4±0.4）%，顯著高于細胞對照組（1.7±0.1）（P＜0.01）；Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·L-1組胱天蛋白酶3和9活性與細胞對照組比較顯著增高（P＜0.01），胱天蛋白酶3/7活性變化不明顯。瘤內注射Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治療組，從治療第8天起瘤體積與模型組相比明顯減?。≒＜0.01），對小鼠體質量無明顯影響；Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治療組小鼠移植瘤組織有不同程度的壞死，肝、肺組織無明顯病理變化；與模型組比較，Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治療組移植瘤組織VEGF和FGF2蛋白表達顯著下降（P＜0.05），凋亡細胞明顯增加（P＜0.05）。結論Cd-PMPP-SAL體內外可有效地抑制B16細胞生長，該作用可能與誘導細胞凋亡及抑制腫瘤內血管生成有關。

吡唑啉酮配合物；黑素瘤；細胞，B16；細胞凋亡

黑素瘤是一種惡性程度高、轉移快的皮膚癌，可隨血液和淋巴轉移至全身各器官黏膜。目前，手術是其主要治療方法，雖然手術可配合化療和靶向治療，但都有較大不良反應且有抗藥性［1-2］。因此，尋求和開發更有效的抗癌藥物或治療途徑就顯得尤為重要。研究發現，許多非鉑類金屬配合物具有抗腫瘤活性［3-4］。對于非鉑化療金屬藥物研究主要集中在過渡金屬Zn，Cu和Co等配合物。吡唑啉酮類配合物屬于西佛（schiff）堿類化合物，是一類含有氮雜環的β二酮型化合物，能與不同金屬形成多種類型的配合物。吡唑啉酮金屬配合物比吡唑啉酮本身具有更強的抗菌［5-7］、抗病毒［8］和抗腫瘤［9-10］等活性。研究表明，一些?；吝蜻c金屬離子螯合后能夠對人及動物的腫瘤具有誘導凋亡作用［10］。吡唑啉酮衍生物金屬配合物因具有合成簡單、性質穩定、結構改造方便及生物學活性豐富的優點，其應用逐漸受到了重視［11］。研究發現，吡唑啉酮銅配合物能誘導人的口底癌KB細胞及多藥耐藥性的KBV200細胞凋亡［12］，其對小鼠急性毒性較低［13］。本課題組前期研究表明，吡唑啉酮鎘（Ⅱ）配合物1-苯基-3-甲基-4-丙?；?5-吡唑啉酮縮水楊酰肼-鎘（Ⅱ）〔cadmium（Ⅱ）complex of pyrazolone deriv?atives，Cd-PMPP-SAL〕對人食管癌Eca-109細胞增殖的抑制作用比常用抗癌藥物順鉑更好，能誘導細胞凋亡［14］，而對非瘤性的人胃上皮細胞和非洲綠猴腎細胞生長的抑制作用較弱［14-15］。本實驗研究Cd-PMPP-SAL體內外對小鼠黑素瘤B16細胞增殖的抑制作用，探討其抗腫瘤作用，為后續研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

C57BL/6J小鼠，體質量18～22 g，雌性，購自新疆醫科大學實驗動物中心，使用許可證：SYXK（新）2016-0002，實驗動物許可證號：SCXK（新）2016-0003。飼養環境溫度為22～26℃，濕度為40%～60%，光照時間為12 h，自由采食飼料和水。Cd-PMPP-SAL為新疆大學應用化學研究所提供，經檢測該配合物的純度達質譜純［14］。環磷酰胺（cy?clophosphamide，CTX）購自江蘇盛迪醫藥有限公司；MTT、二甲亞砜（DMSO）、Hoechst33258染料、Dioc6（3）、DCFH-DA和RIPA細胞裂解液購自美國Sigma公司；凋亡檢測試劑盒（AnnexinⅤ/PI）購于北京聯科生物公司；胱天蛋白酶活性檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司；胱天蛋白酶3，7和9均購于美國Cell Signaling公司；SV-0002兩步法免疫組化試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒、兔抗小鼠血管內皮生長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、兔抗小鼠堿性成纖維細胞生長因子2（basic fibroblast growth factor 2，FGF2）和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體，購北京康為世紀生物科技有限公司；胎牛血清和RPMI 1640培養基購自賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；其他試劑均為分析純。

Neofuge 13R高速離心機（中國香港Heal Force公司）；Benchmark plus酶標儀（美國Bio-Rad公司）；XD-101倒置顯微鏡（江南牌）（武漢歐卡科技有限公司）；3423型CO2培養箱（美國Themo公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 B16細胞培養

小鼠黑素瘤B16細胞（新疆大學生物資源基因工程重點實驗室凍存）培養在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養箱內常規培養，取對數生長期細胞進行各項實驗。Cd-PMPP-SAL充分溶解于DMSO后，加入RPMI 1640培養基或生理鹽水配成400 mg·L-1母液，0.22 μm無菌濾器過濾，臨用時用RPMI 1640培養基按所需比例稀釋，DMSO的終濃度＜1%。

1.3 MTT法檢測B16細胞存活

每孔5×107B16細胞接種于96孔板，過夜培養后分別加入Cd-PMPP-SAL，終濃度為1.0，1.5，3.0，5.0和10.0 mg·L-1，細胞對照組直接加入含DMSO的培養基，每孔100 μL，各組設3復孔。分別培養24，48和72 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，繼續孵育4 h后，棄上清，加入DMSO 150 μL，輕輕振蕩10 min，待藍紫色甲瓚結晶物完全溶解，于540 nm/655 nm雙波長下測吸光度（A）值，細胞存活抑制率（%）=（藥物處理組A540nm/655nm-對照組A540nm/655nm）/對照組A540nm/655nm×100%。用Logit法計算Cd-PMPP-SAL抑制B16細胞存活的IC50。

1.4 Hoechst33258染色觀察B16細胞形態

取無菌潔凈的蓋玻片置于6孔板內，每孔接種1× 105B16細胞，過夜培養后分別加入Cd-PMPP-SAL，終濃度為6.25，12.50和25.00 mg·L-1；細胞對照組直接加入含DMSO介質的培養基，每孔10 μL，各組設3個復孔，繼續孵育24 h后，棄去培養液，PBS洗滌，加入Hoechst33258染色液（0.5 mg·L-1）1 mL，染色5 min，PBS洗2次，每次3 min。滴1滴細胞培養液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察B16細胞形態。

1.5 AnnenxinⅤ/PI雙染色法檢測B16細胞凋亡率

以2×108L-1B16細胞接種于6孔板，每孔2 mL，分別加入Cd-PMPP-SAL，終濃度為6.25，12.50和25.00 mg·L-1，細胞對照組同1.4，各組設3復孔。培養24 h后，消化收集細胞，按AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作檢測B16細胞凋亡率。

1.6 細胞內胱天蛋白酶活性的檢測

以1×109L-1B16細胞接種于96孔板，每孔2 mL，分別加入Cu-PMPP-SAL，終濃度為6.25，12.50和25.00 mg·L-1，細胞對照組同1.4，各組設3復孔。培養24 h后細胞裂解處理，按照胱天蛋白酶活性檢測試劑盒檢測B16細胞內胱天蛋白酶的活性。

1.7 小鼠B16荷瘤模型的制備

取對數生長期B16細胞，用生理鹽水調整細胞密度為2×109L-1，在6周齡C57BL/6J小鼠的背部皮下接種細胞懸液，每只0.25 mL。接種完成后，隨機分為5組：模型對照組給予生理鹽水10 mL·kg-1；陽性對照組給予CTX 10 mg·kg-1；Cd-PMPP-SAL治療組分別給予Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50和25.00 mg·kg-1，每組5只。小鼠接種腫瘤成功率為100%。5 d后腫瘤已長至約25 mm×25 mm× 25 mm，第6天開始采取瘤內注射給藥，每日1次，連續12 d。小鼠每天檢測體質量，隔日測量腫瘤最長徑（a）和最短徑（b），按下式計算腫瘤體積（tumor volume，V）與相對腫瘤體積（relative tumor volume，RV）：V=a×b2×0.5；RV=V/V0（V0：給藥前腫瘤體積）。停藥后剝取實體瘤，分別稱重并計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型對照組平均瘤質量-實驗組平均瘤質量）/模型對照組平均瘤質量×100%。

1.8 小鼠組織病理觀察

1.9 TUNEL法檢測細胞凋亡

小鼠腫瘤組織石蠟切片，脫蠟后按照Ronch公司的細胞凋亡檢測試劑盒操作，于200倍光鏡下計數3個視野移植瘤組織內凋亡細胞密度。

1.10 免疫組化法檢測瘤體內VEGF和FGF2的表達

小鼠腫瘤組織石蠟切片，脫蠟，加兔抗小鼠VEGF和FGF2抗體結合，使用HRP標記的山羊抗兔IgG二抗孵育，使用DAB顯色，于顯微鏡下觀察。實驗步驟按照SV-0002兩步法免疫組化試劑盒的使用說明書操作，細胞中VEGF和FGF2的表達與分布以棕染細胞為陽性表達［16］。先在100倍視野下觀察整張組織切片的陽性細胞分布情況，確定腫瘤區域內陽性細胞最密集的3個區域。再在200倍光鏡下計數每個區域內的陽性細胞數，取3個區域內200倍光鏡下視野范圍內細胞數的平均值作為該小鼠腫瘤組織VEGF和和FGF2表達水平。

1.11 統計學分析

實驗結果數據以x±s表示，使用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行比較，用t檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05為差異具有統計學意義。

水利設施的使用壽命以及工程的整體效益均與施工質量有直接關系。當前在水利工程施工管理過程中，施工隊伍綜合素質較低、質量監督制度不完善、建設單位管理體系不健全等問題的存在對工程建設質量產生較大影響。因此，施工單位應采取切實有效的措施，進一步提高施工管理水平，確保工程建設質量。

2 結果

2.1 Cd-PMPP-SAL對黑素瘤B16細胞的抑制作用

2.1.1 對B16細胞存活的抑制作用

由圖1可見，不同濃度Cd-PMPP-SAL分別處理B16細胞24，48和72 h，Cd-PMPP-SAL對B16細胞存活的抑制率隨著濃度增高和作用時間延長而升高。采用Logit法計算Cd-PMPP-SAL作用72 h抑制B16細胞存活的IC50為4.946 mg·L-1，95%置信區限為4.24～5.652 mg·L-1。

Fig.1 Inhibitory effect of cadmium（Ⅱ）complex of pyrazolone derivatives（Cd-PMPP-SAL）on B16 cell survival detected by MTT method.IC50for 72 h was 4.946 mg·L-1.，n=3.

2.1.2 對B16細胞凋亡的誘導作用

Hoechst33258染色結果（圖2）所示，細胞對照組細胞飽滿，輪廓清晰，細胞著色較淡。與對照組相比，Cd-PMPP-SAL 6.25 mg·L-1作用B16細胞24 h后，細胞著色無明顯差別；12.50 mg·L-1組細胞數量減少，體積變小，微絨毛消失，核漿比例增大；25.00 mg·L-1組細胞核物質致密，呈斑塊狀，邊集于核膜，有的斷裂成大小不一的圓形顆粒，甚至出現自體吞噬泡，呈現出凋亡細胞特有的特性，表明B16細胞出現凋亡。

Fig.2 Morphology of B16 cells treated by Cd-PMPPSAL 25.00 mg·L-1for 24 h with Hoechst33258 stain?ing.The red arrows point to the apoptotic bodies.

采用Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測Cd-PMPP-SAL誘導B16細胞凋亡作用，結果顯示（圖3），Cd-PMPPSAL 12.50和25.00 mg·L-1作用B16細胞24 h，B16細胞凋亡率顯著高于細胞對照組（P＜0.01）。

Fig.3 Inducing effect of Cd-PMPP-SAL on apoptosis of B16 cells detected by Annexin-V/PI staining.B16 cells were incubated with Cd-PMPP-SAL for24 h.A：Annexin-V/ PI staining；B：the quantitative results of A.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0.00）group.

2.1.3 對B16細胞內胱天蛋白酶活性的影響

表1結果表明，與細胞對照組相比，Cd-PMPPSAL 12.50和25.00 mg·L-1組胱天蛋白酶3和9活性顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），而胱天蛋白酶3/7活性變化不明顯。提示Cd-PMPP-SA誘導B16細胞凋亡可能與激活胱天蛋白酶3和9信號通路有關。

Tab.1 Effect of Cd-PMPP-SAL on caspases activity in B16 cells

2.2 Cd-PMPP-SAL對B16荷瘤小鼠的抗腫瘤作用

2.2.1 對B16移植瘤生長的抑制作用

連續瘤內注射Cd-PMPP-SAL或CTX治療12 d后，模型對照組、CTX組及Cd-PMPP-SAL 3個劑量組小鼠體質量（減去處死后小鼠體內腫瘤質量）與給藥前相比均未明顯下降，表明Cd-PMPP-SAL對小鼠體質量無明顯的不良反應（圖4）。

Fig.4 Effect of Cd-PMPP-SAL on body mass of B16 tumor-bearing mice.Mice were injected B16 cells at the back.Five days later，when the tumor was about 25 mm×25 mm× 25 mm，cyclophosphamide 10 mg·kg-1or Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50 and 25.00 mg·kg-1was injected into the tumors once daily for 12 d.，n=5.

由圖5可見，給藥期間，與第0天瘤體積相比，模型組小鼠相對瘤體積增長迅速，明顯增加（P＜0.05）；Cd-PMPP-SAL 3個劑量組從治療第8天起瘤體積明顯小于模型對照組（P＜0.01）；Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·kg-1治療12 d后，相對瘤體積與第1天相比無明顯增加。表明Cd-PMPP-SAL對小鼠腫瘤生長有顯著抑制作用。

Fig.5 Effect of Cd-PMPP-SAL on relative tumor volume of B16 tumor-bearing mice.See Fig.4 for the mouse treat?ment.Relative tumor volume=post-experiment tumor volume/ pre-experiment tumor volume.，n=5.＊P＜0.05，compared with the 0 day of model group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

由表2可見，Cd-PMPP-SAL12.50和25.00mg·kg-1治療12 d后，移植瘤瘤重與模型對照組相比顯著減少（P＜0.01），與CTX陽性對照組作用趨勢一致。

Tab.2 Inhibition of Cd-PMPP-SAL on growth of mela?noma in B16 tumor-bearing mice

2.2.2 Cd-PMPP-SAL對小鼠移植瘤和肝、肺組織病理變化的影響

小鼠移植瘤組織石蠟切片結果顯示（圖6），模型對照組腫瘤組織致密，可見許多血管切面，微血管廣泛分布于腫瘤組織間質內。Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治療組小鼠瘤體內可見到不同程度的點、片狀壞死，細胞間隙增大，血管數量減少，CTX對照組上述組織病理變化與Cd-PMPP-SAL組相似。Cd-PMPP-SAL治療組小鼠肝、肺組織的細胞分布均勻，未見明顯病理改變，表明Cd-PMPPSAL治療12 d對移植瘤小鼠肝、肺組織無明顯損傷（圖略）。

Fig.6 Histological changes in tumor tissue from B16 tumor-bearing mice（HE，200×）.See Fig.4 for the mouse treatment.The red arrows point to the site of tissue necrosis and enlargement of intercellular space.

2.2.3 對小鼠移植瘤組織細胞凋亡的影響

TUNEL檢測結果表明（圖7），Cd-PMPP-SAL治療組的移植瘤組織內細胞染色加深，說明凋亡細胞數量增多。結果顯示，Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治療組凋亡細胞密度為47±4和89±5，與模型對照組（26±4）相比，Cd-PMPP-SAL治療組移植瘤組織內凋亡細胞均顯著升高（n=5，P＜0.05）。

Fig.7 Determination of apoptosis of cells in tumor tis?sues from B16 tumor-bearing mice by TUNEL（200×）. The red arrows point to apoptosis cells.

2.2.4 對小鼠移植瘤組織中VEGF和FGF2蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示（圖8），治療組和陽性對照組移植瘤組織VEGF及FGF2蛋白表達較低、細胞著色淡。200倍光鏡下計數3個視野移植瘤組織內VEGF和FGF2陽性細胞。結果顯示，模型組、Cd-PMPP-SAL 12.50和25.00 mg·kg-1治療組VEGF密度分別為95±4，40±5和26±4，FGF2密度分別為81±11，30±7和20±9；與模型組相比，Cd-PMPP-SAL治療組VEGF和FGF2細胞密度均顯著降低（n=5，P＜0.05）。說明Cd-PMPP-SAL對VEGF和FGF2可能具有一定的抑制作用，提示血管生成障礙可能是細胞凋亡的原因之一。

Fig.8 Expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and fibroblast growth factor 2（FGF2）in tumor tissues from B16 tumor-bearing mice by immunohistochemistry（200×）.See Fig.4 for the mouse treatment.The red arrows point to VEGF and FGF2 positive cells，respectively.

3 討論

惡性黑素瘤具有轉移快、預后差的特點，而實體腫瘤遷移的主要原因是腫瘤細胞進入血液系統，與血液成分相互作用，內皮細胞黏附而導致轉移［17-19］，目前仍無十分有效的方法進行治療。

有機金屬配合物結構多樣，可選擇多樣的配體，對開發篩選出高生物活性，低毒性小分子化合藥物提供了可能［20-22］。Riccardo等［23］報道，吡唑啉酮衍生物金屬配合物β-酮胺釕（Ru）芳烴配合物對卵巢癌細胞具有抗腫瘤活性。Leovac等［24］研究表明，吡唑啉酮類化合物可克服順鉑等傳統藥物的毒副作用及耐藥性。本課題組前期已合成并測定了5種吡唑啉酮金屬配合物的活性。研究結果表明，Cd-PMPPSAL有顯著的殺菌抗腫瘤活性，且影響DNA紫外吸收光譜［25］。吳婷等［15］發現，Cd-PMPP-SAL對Eca109細胞有體外抗增殖活性，能夠誘導細胞早期凋亡。本研究以Cd-PMPP-SAL 6.25，12.50和25.00 mg·L-1分別作用 B16細胞24 h后，發現隨著藥物濃度增大，細胞的貼壁性下降，數量變少，Hoechst33258熒光染料的染色加深，25.00 mg·L-1處理的細胞出現了典型的凋亡小體。由胱天蛋白酶體外活性檢測結果發現，Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·L-1處理組的細胞中胱天蛋白酶3和9的活性與對照相比顯著上調，提示細胞凋亡可能與胱天蛋白酶的激活有關。

目前，關于吡唑啉酮金屬配合物在體內的抗腫瘤作用鮮有報道。本研究利用B16細胞制備了C57小鼠皮下腫瘤模型，采用瘤體內注射的方式用Cd-PMPP-SAL對小鼠腫瘤進行12 d治療。結果表明，Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·kg-1組小鼠的抑瘤率達到（22.2±2.4）%，說明Cd-PMPP-SAL具有較強的抗腫瘤作用。同時治療期間小鼠沒有明顯的食欲下降現象，體質量也沒有明顯的下降趨勢。對移植瘤組織的病理觀察結果顯示，小鼠經Cd-PMPP-SAL治療后，致密的腫瘤組織結構變得稀疏，血管數量減少，細胞間隙變大，說明移植瘤組織受到了一定程度的損害，腫瘤組織中血管數量減少可能是Cd-PMPP-SAL抗腫瘤細胞增殖的重要原因之一。而小鼠肝、肺組織形態沒有明顯的病理變化，說明Cd-PMPP-SAL對小鼠的肝、肺組織沒有明顯的損傷。本課題組前期的體外實驗也表明，Cd-PMPP-SAL對非洲綠猴腎細胞和人胃上皮細胞的增殖影響較?。?4-15］，推測Cd-PMPP-SAL毒副作用低，對實驗小鼠機體損傷較小。

VEGF是最先被發現的促淋巴管生長因子，可促進血管和淋巴管的生成［26-27］。FGF2在很多惡性腫瘤中呈高表達，可通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信號通路誘導腫瘤細胞血管的生成，腫瘤的生長和轉移很大程度上依賴腫瘤血管的形成［27-28］。已有研究表明，通過介導磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路抑制VEGF以及FGF2的表達從而抑制腫瘤細胞的復發和轉移［29-31］。為了進一步研究Cd-PMPP-SAL對血管生成的影響，本研究檢測其是否對血管生成的重要蛋白VEGF以及FGF2具有調節作用。免疫組化實驗結果表明，Cd-PMPP-SAL治療組VEGF和FGF2的表達顯著低于模型組，說明Cd-PMPP-SAL抑制腫瘤生長的作用機制可能與下調VEGF和FGF2的表達，從而減少腫瘤組織間血管生成有關。采用TUNEL法特異性地檢測Cd-PMPP-SAL對小鼠體內實體瘤細胞的誘導凋亡作用。結果顯示，經Cd-PMPP-SAL治療小鼠的腫瘤切片呈細胞深染，而模型對照組細胞染色較淺，說明經Cd-PMPP-SAL治療的小鼠腫瘤細胞發生凋亡。

綜上所述，Cd-PMPP-SAL于體內外均可顯著抑制B16細胞增殖，其作用機制可能與下調VEGF和FGF2蛋白表達、抑制瘤體血管生成并誘導細胞凋亡有關。荷瘤小鼠對Cd-PMPP-SAL治療沒有嚴重的不良反應，這一研究結果可為臨床黑素瘤化療提供一個有價值的治療方案，值得進一步研究和探討。

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Antitumor effect of cadmium(Ⅱ)complex of pyrazolone derivatives on melanoma B16 cells in vitro and in vivo

CHANG Chen-chen1,WU Ting1,2,WANG Mei-fang1,XU Guan-cheng3,SUN Su-rong1

(1.Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,College of Life Science and Technology;3.Key Laboratory of Advanced Functional Material,Institute of Applied Chemistry, Xinjiang University,Urumqi 830046,China;2.People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830002,China)

OBJECTIVETo investigate the antitumor effect of cadmium(Ⅱ)complex of pyrazolone derivatives 1-phenyl-3-methyl-4-propionyl-5-pyrazolone salicyloyl hydrazide-cadmium(Ⅱ)(Cd-PMPPSAL)on the murine melanoma B16 cellsin vitroandin vivoand its mechanisms.METHODSB16 cells were incubated with Cd-PMPP-SAL at 1.0,1.5,3.0,5.0 and 10.0 mg·L-1for 24,48 or 72 h.The prolifera?tion rate of B16 cells was evaluated by MTT assay.B16 cells were incubated with Cd-PMPP-SAL at 6.25, 12.50 and 25.00 mg·L-1for 24 h,while cell morphology was observed by Hoechst33258 staining.Apop?tosis of B16 cells was detected by AnnexinⅤ-FITC/PI staining.The activity of caspases in B16 cells was detected by caspase activity assay.C57BL/6J mice were inoculated subcutaneously with B16 cells to establish a tumor-bearing model.Five days later,Cd-PMPP-SAL at 6.25,12.50 and 25.00 mg·kg-1was injected into tumors of C57BL/6J mice once a day for 12 d.The body mass was recorded daily. One day after the last administration,all the mice were killed and the tumor was harvested.Tumor volume and mass were measured,and the tumor inhibitory rates were calculated.Pathological changes of the tumor,liver and lung were observed under a microscope.The expressions of vascular endothelial growth factor(VEGF)and fibroblast growth factor 2(FGF2)in tumor tissues were detected by immuno?histochemistry.The apoptotic cells in transplanted tumor tissues were detected by TUNEL.RESULTSCd-PMPP-SAL inhibited the proliferation of B16 cells.The IC50was 4.946 mg·L-1,and 95%confidence interval was 4.24-5.65 mg·L-1.The apoptosis rates(12.8±1.4)%and(18.4±0.4)%of Cd-PMPP-SAL 12.50 and 25.00 mg·L-1groups were significantly higher than those of control group(1.7±0.1)%(P＜0.01).The activity of caspase 3 and 9 of Cd-PMPP-SAL 25.00 mg·L-1group was significantly higher than that of control group(P＜0.01),but there was no significant difference in caspases 3/7.The relative tumor volumes of Cd-PMPP-SAL 6.25,12.50 and 25.00 mg·kg-1treated groups from the 8thday of treatment were significantly decreased compared with the model group(P＜0.01).The result of paraffin sections showed that the transplanted tumor tissues in Cd-PMPP-SAL 12.50 and 25.00 mg·kg-1groups exhibited different degrees of necrosis,but there was no significant pathological damage to the liver or lung tissues of mice.Compared with model group,expressions of VEGF and FGF2 in Cd-PMPP-SAL 12.50 and 25.00 mg·kg-1treated groups were significantly inhibited(P＜0.05),and apoptotic cell rates were significantly higher(P＜0.05).CONCLUSIONCd-PMPP-SAL can inhibit growth of B16 cellsin vivoandin vitro,which may be associated with induction of tumor cell apoptosis and inhibition of tumor angiogenesis.

pyrazolone derivative;melanoma;cells,B16;apoptosis

The project supported by Natural Science Fund of Xinjiang Uygur Autonomous Region(2013211A018)

SUN Su-rong,Tel:(0991)8582077,E-mail:sr_sun2005@163.com

R979.1

：A

：1000-3002-（2017）05-0405-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.05.005

2016-09-21 接受日期：2017-05-05）

（本文編輯：齊春會）

新疆維吾爾自治區自然科學基金（2013211A018）作者簡介：常晨晨，女，碩士研究生，主要從事生物化學與分子生物學研究，E-mail：528193074@qq.com；孫素榮，女，教授，碩士生導師，主要從事基因工程與藥物篩選研究。

孫素榮，E-mail：sr_sun2005@163.com，Tel：（0991）8582077