二乙烯砜-谷胱甘肽系列加合物的制備及其與體外DNA加合反應活性

呂姍姍，徐 斌，高中才，趙玉梅，張雅姣，徐 華，吳劍峰，謝劍煒

（軍事醫學科學院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

二乙烯砜-谷胱甘肽系列加合物的制備及其與體外DNA加合反應活性

呂姍姍，徐 斌，高中才，趙玉梅，張雅姣，徐 華，吳劍峰，謝劍煒

（軍事醫學科學院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

目的合成制備芥子氣（SM）的重要氧化代謝產物二乙烯砜（DVS）的谷胱甘肽（GSH）加合物，并研究其體外與DNA的加合反應活性。方法以SM為起始原料，通過兩步氧化反應制備芥子亞砜（SMO）和芥子砜（SMO2），在堿性條件下通過“脫氯”反應合成并純化獲得DVS，進而采用制備液相色譜純化獲得了DVS-GSH單加合物及其與鳥嘌呤或腺嘌呤形成的2種DVS雙加合物，并通過超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術研究DVS-GSH與體外DNA的加合反應活性。核磁共振譜和高分辨質譜鑒定DVS加合物表征和結構。結果在水溶液中DVS與GSH的反應活性顯著高于SM，且生成的DVS-GSH單加合物也具有較強的反應活性，可與DNA的腺嘌呤和鳥嘌呤生成系列新的加合物，且與腺嘌呤加合物的豐度高于與鳥嘌呤加合物。結論SM的氧化代謝產物DVS的二相代謝產物（DVS-GSH）與DNA體外仍具有較強的加合反應活性，其對DNA的損傷效應值得關注。

二乙烯砜；谷胱甘肽加合物；DNA加合物

芥子氣（sulfur mustard，SM）是一種難防難治的糜爛性化學戰劑，由于其制備簡單，使用門檻低，毒性大，作用持續時間長，已被多次用于戰爭、恐怖襲擊等。我們前期的研究結果表明，SM暴露后在體內易發生氧化反應，其中大部分轉化為芥子亞砜（mustard sulfoxide，SMO），SMO還可進一步氧化成芥子砜（mustard sulfone，SMO2）［1］。而SMO2在弱堿性（pH 7.3～7.7）條件下會自發發生兩步“脫氯”反應，轉化為反應活性更高的二乙烯砜（divinylsul?fone，DVS）［2-3］。同時，DVS還是SM在氧化型洗消液中的主要終產物；工業上DVS還作為交聯劑被廣泛使用，如與透明質酸交聯形成水凝膠等［4］。近年來，DVS常被用作修飾聚合物發生“點擊”反應（click reaction）的反應試劑，用來修飾標記蛋白等［9］。已有文獻報道，SMO屬于低毒性分子，而SMO2和DVS卻具有類SM的糜爛性毒性作用，且DVS的反應活性較SMO2更強，能與氨基酸、巰基化合物和蛋白等發生反應［5-7］，其主要是由于DVS的雙烯鍵屬于缺電子型官能團，易與親核試劑發生邁克爾加成反應（Michael addition reaction）。而體內諸多重要活性物質，如一些功能蛋白、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、氨基酸和DNA等均含有較多的富電子官能團，DVS極易與其發生加成反應，產生一系列的機體損傷效應。如Dearfield等［8］用DVS染毒小鼠淋巴瘤細胞，誘變遺傳毒性試驗結果為陽性，表明DVS存在一定的基因毒性。有研究表明，DVS的雙烯鍵與一分子的親核試劑發生加成反應生成單加合物后，裸露的另一烯鍵反應活性會得到增強，更易生成交聯加合物［10-12］。我們前期研究數據還表明［13］，DVS與GSH具有很高的反應性，可生成DVS與GSH的單加合物（DVS-GSH）和雙加合物（GSH-DVS-GSH），其中DVS-GSH單加合物的穿透細胞膜（核）的能力也顯著增加。推測其可能具有基因毒性，能與細胞核內的DNA形成加合物，并產生DNA損傷效應。因此，深入研究DVS及DVSGSH加合物與DNA的單加合反應活性，對了解其DNA損傷效應具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

SM（防化學院提供，純度＞98%）；GSH（美國Acros公司）；腺苷（北京伊諾凱有限公司）；鳥苷（中國Alfa Aesar公司）；鮭魚精DNA（北京索萊寶科技有限公司）；甲醇和乙腈（色譜純）（德國Merck公司）；實驗用水為超純水（18.2 MΩ），由MilL-Q 10超純水機（美國Millipore公司）制備；其余試劑均為分析純（國藥集團北京化學試劑公司）。

Xevo G2超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（ultra-performance liquid chromatography-quadru?pole time-of-fight mass spectrometry，UPLC-QTOF/ MS）聯用儀（美國Waters公司）；Qtrap質譜儀和Agilent 5975氣相色譜質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀（美國Agilent公司）；LC 3000型半制備型高效液相色譜儀（北京創新通恒科技有限公司）；ECA 400超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜（nuclear magnetic resonance，NMR）儀（日本JEOL公司）；DL 203電子天平（瑞士MettlerToledo公司）；旋轉蒸發儀RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 芥子亞砜和芥子砜的制備

將SM用少量乙腈溶解后緩慢滴入濃硝酸中［14］，室溫下反應約3 h，待反應液由棕紅色逐漸轉變為深綠色時，用GC-MS監測反應液至SM反應完全，反應液用二氯甲烷萃取3次（20 mL×3），合并有機相，用無水硫酸鈉干燥過夜后，旋轉蒸發除去有機溶劑得到白色固體，即為SMO粗品。

將上述制備的SMO粗品，用少量乙腈溶解后，轉移至三頸瓶中，加入適量KMnO4和濃硫酸［15-16］，120℃下加熱回流反應6 h，GC-MS監測至SMO反應完全即停止反應。冷卻至室溫后，反應液用二氯甲烷提取3次（20 mL×3），合并有機相，用無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉蒸發除去溶劑即可得到SMO2粗品。

1.3 二乙烯砜的制備

將上述制備的SMO2用少量乙腈溶解后轉移至三頸瓶中，加入碳酸鈣水溶液，室溫下反應3 h，再升溫至120℃回流反應6 h，GC-MS監測反應，待SMO2粗品全部轉化為DVS后，即停止反應，冷卻至室溫，用二氯甲烷提取3次后，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后，旋轉蒸發除去有機溶劑，獲得無色油狀液體即為DVS。經GC-MS和NMR表征，其純度≥95%，可以滿足后續實驗要求。

SM和DVS均為糜爛性毒劑，所有操作必須在通風櫥內進行。操作完畢后的溶液和所使用的器皿均需要以醇堿溶液進行洗消處理。

1.4 DVS-GSH單加合物制備

稱取適量DVS，用少量乙腈溶解，轉移至三頸瓶中，加入10 mL超純水，攪拌至DVS溶解后，按摩爾比1∶1.2加入GSH，冰浴下反應20 min，高分辨質譜監測至GSH反應完全。用制備液相色譜分離純化獲得單加合物，分離條件為：A相為水，B相為甲醇；0 min：1%B，10 min：20%B，20 min：20% B，收集5～6 min流份。用NMR及超高效液相色譜-高分辨質譜（UPLC-high resolution mass spec?trometry，UPLC-HRMS）對產物的結構進行鑒定。

有杕之杜，其葉菁菁。 獨行睘睘。 豈無他人？不如我同姓。 嗟行之人，胡不比焉？人無兄弟，胡不佽焉？(睘，孤獨。)[3]111-112

1.5 DVS-GSH與嘌呤加合物的制備

稱取適量DVS-GSH加合物溶于PBS緩沖液中（pH=7.4），冰浴下以摩爾比1∶1.5加入鳥苷或腺苷，室溫下攪拌1 h后，停止反應，用等體積1 mol·L-1鹽酸溶液60℃酸解1 h，酸解液用制備液相色譜分離純化，分離條件與1.4描述相同，收集23～25 min流份，合并所收集的流份后旋轉蒸發除去部分溶劑，剩余組分經冷凍干燥得白色固體。用NMR及UPLC-HRMS對產物加以鑒定。

1.6 UPLC-HRMS分析條件

液相色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40℃；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：甲醇；流速0.25 mL·min-1；梯度：0～2 min，1%B；2～7 min，1%～50%B；7～12 min，50%～95%B；進樣量2 μL。

Q-TOF質譜條件：電離模式：電噴霧電離(elec?trospray ionization,ESI)正離子模式；采集模式：全信息串聯（MSE）模式；毛細管電壓，3 kV；錐孔電壓，15 V；萃取電壓，4 V；源溫，100℃；脫溶劑溫度，300℃；碰撞能量：低碰撞能量為6 eV，高碰撞能量為10～40 eV；一級質譜分辨率10 000 FWHM。

1.7 建立生物樣品中DVS-GSH與嘌呤加合物的檢測方法

為了有效表征生物樣品中加合物，采用檢測特異性和靈敏度好的三重四極桿超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術，應用多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM），基于實驗1.5中所獲得GSH-DVS-嘌呤加合物參考品，選取特異性母離子與子離子，建立用以檢測生物樣品中的GSH-DVS-嘌呤加合物的方法。

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫40℃；流動相A：水B：甲醇；流速0.35 mL·min-1；梯度0～4 min，5%～35%B；4.1～4.5 min，35%～80%B；進樣量3 μL。

質譜條件：電離模式：ESI正離子源；采集模式：MRM；電噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：550℃；霧化氣（Gas1）35 psi；輔助加熱干燥氣（Gas2）60 psi，分解電壓（declustering potential，DP）、碰撞電壓（colli?sion energy，CE）、碰撞室出口電壓（collision cell exit potential，CEX）、入口電壓（entrance poten?tial，EP）參數見表1。

Tab.1 Mass spectroscopic parameters for determina?tion of DNA adducts

稱取1mg的DVS-GSH，加至含有5 mg雙鏈鮭魚精的DNA溶液中，室溫下攪拌反應數小時后，停止反應，用2.5倍體積的冷乙醇進行沉淀，高速離心后，棄去上清液，下層沉淀用適量70%乙醇洗2～3次后，揮干乙醇，加入等體積15%甲酸水溶液75℃進行酸化，酸化時間約為0.5 h，將酸解液旋至近干，用少量水-甲醇混合液復溶后，再用LC-MS/MS檢測DNA加合物的生成。

2 結果

2.1 SMO，SMO2和DVS的合成和鑒定

Fig.1 Structures of synthesized chemicals.SMO：mustard sulfoxide；SMO2：mustard sulfone.

本實驗所合成化合物的結構式如圖1所示，包括3種SM氧化產物和3種DVS加合物，氣相色譜圖見圖2，SMO（tR=9.5 min）、SMO2（tR=9.4 min）及DVS（tR=5.9 min），圖中箭頭所指為幾種氧化產物的轉化關系。合成所得終產物DVS的純度＞97%（純度由峰面積歸一化法測得），可以滿足后續實驗要求。

Fig.2 GC-MS chromatogram of SMO，SMO2and DVS. Arrows indicate transformation of several oxidative products of sulfur mustard（SM）.

2.2 DVS-GSH單加合物的分析和鑒定

制備液相色譜分離獲得的化合物DVS-GSH用NMR和LC-HRMS進行分析。在ESI+模式下可檢測到準分子離子峰［M+H］+的質荷比（m/z）=426.1002，與理論值426.1005（C14H23N3O8S2）一致（質量偏差0.7 ppm）。二級碎裂離子m/z297.0576為DVSGSH單加合物GSH部分上谷氨酸與半胱氨酸鏈接的肽鍵處（-CO-NH-）斷裂，丟失C5H8NO3碎片形成。1HNMR和質譜分析結果如下，表明制備的化合物即為目標產物DVS-GSH，總產率為62%，純度＞97%。液相色譜圖及質譜圖分別見圖3A和圖3B。

ESI+-HRMS：m/z426.1002［M+H］+→297.0576［M+H-C5H8NO3］+。1HNMR（D2O，400 MHz）δ6.69（q，2H），6.31（q，H），4.43（t，H），3.58（m，3H），3.36（t，2H），2.93（m，H），2.75（m，3H），2.34（m，2H），1.98（m，2H）。

Fig.3 HPLC chromatogram(A)and mass spectrum (B)of DVS-GSH.

2.3 DVS-GSH-嘌呤雙加合物的分析和鑒定

液相色譜分離純化所得的雙加合物用LC-HRMS和NMR進行分析。2種化合物的液相色譜圖如圖4A和4B所示，質譜圖如圖4C和4D所示，其中GSH-DVS-Ade的分子式為C19H28N8O8S2，在ESI+模式下可檢測到GSH-DVS-Ade準分子離子峰［M+ H］+的m/z=561.1570（質量偏差3.56 ppm）。但僅根據準分子離子峰不能確定加合物的具體結構，其二級碎裂離子m/z為 434.1120，330.0753和130.0519，分別是DVS側鏈上S-O雙鍵斷裂和GSH部分肽鍵（-CO-NH-）斷裂形成。同樣，GSHDVS-Gua質譜圖如圖4D所示，其準分子離子峰［M+H］+的m/z=577.1472（質量偏差4.68 ppm），計算分子式為C19H28N8O9S2，二級碎裂離子信號強度較強的m/z分別為 448.1049，345.0784和130.0500，分別是由GSH部分上谷氨酸與半胱氨酸鏈接的肽鍵（-CO-NH-）斷裂和C-C鍵斷裂形成的。雙加合物的1HNMR和質譜檢測結果均表明，制備的化合物即為目標產物，2種加合物的合成產率分別為71%和66%，純度＞96%。

ESI+-HRMS：m/z561.1570［M+H］+→434.1120［M+H-C5H9NO3］+，330.0753［M+H-C5H9NO3-C2H4NO2-2O］+，130.0519［M+H-C14H20N7O5S2］+。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ8.52（br，5H），7.85（s，H），7.39（s，H），7.26（s，2H），4.78（br，2H），4.53（br，H），3.89（m，1H），3.51（br，8H），3.11（m，1H），2.53（s，2H），1.29（m，3H）。

Fig.4HPLC chromatograms(A and B)and mass spectrum（C and D）of GSH-DVS-Ade（A and C）and GSH-DVS-Gua（B and D）.

ESI+-HRMS：m/z577.1472［M+H］+→448.1049［M+H-C5H9NO3］+，345.0784［M+H-C5H9NO3-C3H4NO3］+，130.0500［M+H-C14H20N7O6S2］+。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ8.47（m，10H），7.48（br，2H），7.34（br，4H），4.72（br，2H），4.52（br，H），3.85（m，15H），3.09（m，2H），2.45（s，6H），1.98（br，3H），1.28（m，5H）。

2.4 生物樣品中DVS-GSH與嘌呤加合物的分析

為了實現生物樣品中GSH-DVS-嘌呤加合物（GSH-DVS-Ade和GSH-DVS-Gua）的分析。首先用2種加合物參考品獲得其質譜圖，并選擇了其檢測母離子和子離子對，采用MRM模式進行監測，如圖5A和5B所示，GSH-DVS-Ade和GSH-DVSGua的色譜保留時間分別為1.21 min和1.01 min。

Fig.5 UPLC chromatograms of DVS-GSH-Ade and DVSGSH-Gua.Transition m/z：561→177，561→288，561→415; 577→304，577→448，577→345.

2.5 GSH-DVS-DNA加合物確證分析

直接以雙鏈鮭魚精DNA為底物與DVS-GSH反應數小時，經酸解后用QTOF/MS檢測，提取離子的液相色譜如圖6所示。通過保留時間和質譜圖與2.3中所述的加合物參考品比較，tR=4.77 min和tR= 4.53 min的色譜峰分別為GSH-DVS-Ade和GSHDVS-Gua組分，可以確定DVS-GSH可與DNA上的腺嘌呤和鳥嘌呤發生加成反應，生成2種加合物。依據液相色譜圖的峰面積估算GSH-DVS-Ade的量約是GSH-DVS-Gua的1.5倍，表明DVS-GSH更易與腺嘌呤生成加合物。

Fig.6HPLC chromatogram of DNA adducts from DVS-GSH.

3 討論

依據SM系列氧化產物的特性，對DVS的合成路線進行了優化，僅通過一次“串聯氧化”反應和一步“脫氯”反應即可獲得較高純度的DVS。具體如下：以SM為起始原料，實驗中用GC-MS監測反應進程，發現用濃HNO3氧化過程中，除主要生成SMO外，還會伴隨生成單乙烯亞砜（SVSO）和雙乙烯亞砜（DVSO）；而在以SMO粗品為原料制備SMO2時，SVSO和DVSO分別也被氧化成單乙烯砜（SVS）和DVS；但經過脫氯反應，SMO2及其副產物SVS均可轉化為DVS。因此，制備DVS的過程中將中間體SMO和SMO2的純化步驟省去，僅需用GC-MS分別監測至SM，SMO和SMO2反應完畢即可。優化后的合成路線減少了純化步驟帶來的產物損失，有效提升了合成效率。制備的DVS純度＞97%，總產率＞80%，完全可以滿足后續實驗要求。

根據DVS自身的化學性質，DVS也可劃歸為雙功能烷基化試劑，能與帶有孤對電子的活性分子如GSH、半胱氨酸和氨基酸等發生親電加成反應，加上DVS的水溶性較好（溶解度＞100 g·L-1），因此DVS在水體系中，對上述活性分子的損傷效應可能會更加明顯。本實驗結果表明，SM與GSH在37℃下孵育30 min后，約有50%的SM與GSH反應生成SM-GSH單加合物，1 h后反應完成。相比于SM，DVS與GSH混合后，即使在冰浴條件下，數十分鐘后DVS就基本可與GSH反應完全，主要生成單加合物DVS-GSH，伴隨有少量GSH-DVS-GSH雙加合物的生成。由此說明，在水體系中，DVS確實比SM對GSH的反應性更強。為獲得滿意產率的DVS-GSH單加合物，整個反應始終在冰浴下進行，反應20 min后即進行制備液相分離純化，有效避免了交聯和雙取代加合物的生成。

為實現生物樣品中GSH-DVS-DNA加合物的檢測，建立相應定性檢測方法，首先需制備出DVSGSH與嘌呤加合物的參考品。如直接以嘌呤為原料，由于其加合位點較多，在制備過程中易形成多種副產物，導致產率較低且后續分離很困難。而腺苷和鳥苷由于N9位的活性位點被糖基占據，一方面減少了可加合的位點，另一方面其空間位阻也可有效減少副反應的發生，且在加合反應后可用合適濃度的酸溶液脫去糖基即可方便獲得所需的目標加合物。因此，實驗中分別選用腺苷和鳥苷作為原料與DVS-GSH在室溫下反應用以制備嘌呤加合物。

眾所周知，DNA分子是以4種脫氧核苷酸為單位以鏈間、鏈內氫鍵的方式連接而成的長鏈。理論上，DNA鏈上任意親核基團都能與親電化合物形成DNA加合物。但DNA加合物的形成受多種因素的影響，包括特定的電化學、立體化學和堿基序列特異性等。目前，DNA加合物研究最多的為DNA鏈上的堿基A（腺嘌呤）與G（鳥嘌呤）的加合物［17-18］。因此，為評價DVS-GSH是否具有DNA損傷效應，實驗中重點考察了DVS-GSH直接與鮭魚精雙鏈DNA室溫下孵育數小時后的加合物種類。液質分析結果表明，DVS-GSH可與DNA形成GSH-DVSAde和GSH-DVS-Gua 2種加合物，且與腺嘌呤的加合物含量高于鳥嘌呤加合物。形成的加合物豐度存在差異的原因可能是由于DNA的立體選擇性，DNA鏈上堿基對A-T與G-C形成特定的雙螺旋結構，腺嘌呤的N3位電負性較大，空間位阻較小，成為活性物質DVS-GSH最主要的攻擊位點。但實驗中未檢測到胞嘧啶和胸腺嘧啶加合物，這與胞嘧啶和胸腺嘧啶質譜響應較差或不易與DVS-GSH發生加合反應有關。

基于上述體外實驗結果初步表明，SM體內重要氧化代謝產物的二相代謝產物DVS-GSH有DNA損傷效應，且DVS-GSH更易與DNA鏈上的腺嘌呤形成加合物。

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Preparation of divinylsulfone-glutathione adducts and their reactive activities with DNA in vitro

LYU Shan-shan,XU Bin,GAO Zhong-cai,ZHAO Yu-mei,ZHANG Ya-jiao,XU Hua,WU Jian-feng,XIE Jian-wei

(State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures,Laboratory of Toxicant Analysis, Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China)

OBJECTIVETo prepare the glutathione adducts of divinylsulfone(DVS),which is an important oxidative metabolism product of SMin vivo,and to investigate their reactive capability with DNAin vitro.METHODSThe mustard sulfoxide(SMO)and mustard sulfone(SMO2)were prepared by oxidation reaction using HNO3and KMnO4as oxidants,respectively.Then,DVS was prepared through dechlorination reaction using CaCO3under alkaline conditions.Furthermore,the DVS-GSH adduct and DVS-GSH-purine adducts were prepared and identified using ultra-performance liquid chromatographymass spectrometry(UPLC-MS/MS)and nuclear magnetic resonance(NMR).Finally,the adduct reac?tion process of DVS with GSH was monitored using UPLC-MS/MS.RESULTSThe DVS-GSH and GSH-DVS-purine adducts were obtained through preparative HPLC and characterized using NMR and high-resolution MS.In aqueous solution,the reactive activity of DVS with GSH was significantly higher than that of SM,and the DVS-GSH adduct had high or reactive activity,which could produce a series of adducts with adenine and guanine in DNA,and the abundance of the adenine adducts was higher than that of the guanine.CONCLUSIONDVS-GSH adducts still have high reactive activity with DNA, and more attention should be paid to its potential damage to DNA.

divinylsulfone;glutathione adduct;DNA adduct

WU Jian-feng,Tel:(010)66930621,E-mail:ammswjf@163.com;XIE Jian-wei,Tel:(010) 68225893,E-mail:xiejwbmi@163.com

R917

：A

：1000-3002-（2017）05-0422-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.05.007

2017-03-17 接受日期：2017-05-10）

（本文編輯：賀云霞）

呂姍姍，碩士研究生，主要從事毒物分析研究。

吳劍峰，E-mail：ammswjf@163.com，Tel：（010）66930621；謝劍煒，E-mail：xiejwbmi@163.com，Tel：（010）68225893