Elongator復合物在低濃度氨基酸條件下對TORC1活性的影響

何 格，滕昕辰

Elongator復合物在低濃度氨基酸條件下對TORC1活性的影響

何 格，滕昕辰

（蘇州大學藥學院，蘇州，215000）

目的：研究Elongator復合物在低濃度氨基酸條件下對TORC1活性的影響。方法：通過生長實驗來觀察Elongator突變體在低濃度氨基酸和低濃度亮氨酸條件下的生長程度；通過免疫印跡法檢測核糖體蛋白S6的磷酸化水平來檢測TORC1的活性；將GFP-ATG8質粒轉入到Elongator突變體及野生型酵母菌株WT里，并通過免疫印跡法檢測游離的GFP蛋白的水平來檢測體內自噬。結果：生長實驗顯示Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下顯示過度生長的特性，并且這種過度生長可被TORC1抑制劑雷帕霉素所抑制；免疫印跡檢測TORC1活性的實驗以及檢測體內自噬實驗顯示Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下TORC1活性上升，而自噬進程被抑制；進一步實驗證明Elongator 突變體可特異性忽略低濃度亮氨酸而激活TORC1，抑制自噬，從而持續生長。結論：Elongator復合物在氨基酸信號下可抑制TORC1的活性，同時促進體內自噬進程。推測Elongator復合物可通過抑制TORC1信號通路確保細胞內蛋白翻譯的準確性。

Elongator復合物；TORC1活性；氨基酸信號

引言

真核生物里的Elongator復合物最早是由Otero等從酵母中分離出來的[1],它能夠與RNA聚合酶Ⅱ（RNAPII）緊密結合。因為這種蛋白質復合物與RNAPII的穩定結合依賴于RNAPII的C末端結構域（CTD）的高度磷酸化[2]，而這種磷酸化是轉錄延伸的標記，所以將這種復合物命名為延伸（Elongator）復合物。自其被發現以來，Elongator復合物被報道參與一系列細胞活動，諸如組蛋白乙?；旧|的修飾﹑DNA去甲基化﹑參與維持基因的穩定性等。Elongator復合物含有六個亞基，通常形成兩個三亞基復合物，其中較大的核心復合物是由Elp1﹑Elp2和Elp3亞基組成[1]，另一個較小的復合物是由Elp4﹑Elp5和Elp6組成[3,4]。Elongator復合物的組成亞基在酵母和人之間是高度保守的[5,6]。令人驚奇的是[7,8]，在酒釀酵母[1,3,9]﹑擬南芥[10]以及黑腹果蠅等生物體內缺失任何一個Elongator亞基都會顯示出相似的表型，說明這六個亞基中的任意一個對維持Elongator復合物的結構完整性及酶活性來說都是必須的。

之前我們實驗室通過文庫篩選發現敲除酵母內Elongator復合物的任一亞基均會導致該突變菌株產生在低濃度氨基酸條件下過度生長的表型。氨基酸不僅是蛋白質合成的重要前體，還作為信號分子被細胞內的感應器所感應從而參與細胞內信號轉導過程[11-13]。雷帕霉素靶點蛋白復合物1（target of rapamycin complex1, TORC1）是細胞內感受氨基酸信號并調控細胞生長的重要機制[14]。當氨基酸富足時，TORC1活性上升，并進一步激活下游靶標分子，提高轉錄翻譯水平，抑制自噬，促進細胞生長[15]。當氨基酸缺乏時，TORC1活性下降，轉錄翻譯被抑制，自噬進程被激活，細胞生長停滯[16,17]。TORC1信號通路的失調會導致環境營養水平和細胞生長的脫節，是許多疾病的成因[18-20]。雖然有研究顯示Elongator復合物在果蠅細胞內可通過胰島素激活TORC1的信號通路發揮作用，但目前并沒有Elongator復合物與氨基酸信號通路有直接聯系的相關報道。本文將會研究探索Elongator突變體在氨基酸缺乏條件下對TORC1活性的影響，將為完善Elongator復合物的生理功能提供幫助以及因Elongator功能缺失導致的疾病的治療提供分子基礎。也有利于我們進一步豐富以及完善TORC1信號通路，并為研發以該信號通路為靶點的藥物做出貢獻。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 酵母菌株

所用酵母菌株及其基因型名稱見表1

1.1.2 質粒

酵母表達所用質粒見表2

1.1.3 培養基

酵母常用液體培養基CSH含0.17%酵母氮基（無氨基酸和硫酸銨）（生工，S505），0.5%硫酸銨（生工，A0191），0.2% CSH氨基酸混合物；ME含0.17%酵母氮基（無氨基酸和硫酸銨），0.5%硫酸銨，0.124% ME氨基酸混合物。實驗過程中所使用的CSH及ME氨基酸混合物組分見表3。在液體培養基中添加2%瓊脂即得固體培養基。

1.1.4 化學試劑

化學發光HPR底物及PVDF膜購于MILLIPORE公司；玻璃珠（酸洗過的），蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑購于Sigma公司；蛋白Marker購于Thremo公司；PGK1抗體（22C5D8）購于Abcam公司；GFP 抗體（B-2）購于Santa Cruz公司；Phospho-S6（Ser235/236）抗體，HRP-linked Anti-mouse IgG及HPR-linked Anti-rabbit IgG購于CST公司。

表1 酵母菌株

1.2 方法

1.2.1 檢測酵母TORC1的活性

挑酵母單克隆到3 mL CSH液體培養基中并放在15 mL的無菌培養管在30℃恒溫培養箱中搖過夜。使用紫外可見分光光度計測量過夜酵母菌液的OD值（吸光度）。用1.5 mL離心管離心6 OD酵母（13000 rpm/min室溫離心1 min），去除上清，然后用6 mL富足培養基CSH使之重懸在15 mL無菌培養管中，于30℃搖床里培養1 h。測量OD值，離心3管2 OD酵母，去上清。其中一管把沉淀存放于-20℃作為0點的樣本。另外兩管分別用1 mL ddH2O洗一次，用2 mL ME 培養基重懸，在30℃搖床中培養3 h和6 h，并在指定的每一個時間點離心2 OD酵母，沉淀存放于-20℃。其中每管2 OD酵母，加200 μL SDS裂解液，在處理時按1:1000分別現加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。加大約100 μL無菌玻璃珠，在漩渦混勻儀高速震蕩45 s × 4，每次在冰上間隔30 s。干式恒溫器100℃煮5 min。進行蛋白免疫印記（WB）。用12% SDS-PAGE 膠，每孔上樣15 μL。用p-S6抗體（TORC1活性指示蛋白，1:1000, 二抗兔），PGK抗體（參照蛋白, 1:1000，二抗鼠) 標記。

表3 CSH及ME培養基中氨基酸組分列表

1.2.2 酵母質粒轉染

劃出酵母菌到 YPD 瓊脂板上，放在 30℃恒溫培養箱長兩天后取出瓊脂板。挑單克隆到2 mL YPD液體培養基中，在 30℃搖過夜。測定過夜菌液的OD值，并把濃度稀釋到OD600 = 0.25。搖大約4 h左右,使菌液OD600大約等于0.8，測定OD值。將每個轉染用1.5 mL離心管離心（13000 rpm/ min，1 min）1 mL酵母菌液，并去除上清，將沉淀用1 mL 0.1 M醋酸鋰重懸，離心13000 rpm/min，1 min，去除上清。隨后將沉淀再用100 μL 0.1 M醋酸鋰重懸，這時得到的就是感受態酵母。取變性蛙魚精子DNA（其中每個轉染需加入5 μL），在100℃金屬加熱器煮5 min并立刻放在冰上。隨后在先前制備好的100 μL感受態酵母中按順序加入0.5 μg質粒DNA，5 μL蛙魚精子DNA，350 mL PLATE Mix。間歇震蕩直到完全混勻。在30℃搖床中孵育30 min。然后在42℃水浴中加熱10 min。離心并去除上清。用100 μL ddH2O重懸酵母沉淀，并涂到選擇性培養板上。

1.2.3 酵母菌株生長實驗

首先準備好無菌的平底96孔板，先在每個孔中加入200 μL符合實驗要求的培養基，按照順序挑單克隆溶在做好標記的孔中，在30℃恒溫培養箱中培養48 h。準備一次性無菌96孔板，用排槍吸取80 μL滅菌水依次放到96孔板中，6列。隨后按照1:5梯度稀釋：用排槍先混勻已經培養了48 h的酵母菌，然后吸取20 μL到第一排，混勻一下然后吸取20 μL到第二排，依次進行到第6排。這是五倍濃度梯度稀釋菌液。接下來點板，事先準備好將要用的培養板，從梯度稀釋濃度最低的那一排開始，用排槍依次吸取5 μL菌液點到培養板上。然后把培養板放回培養箱，在30℃培養2～3天。最后在成像儀上拍照。

1.2.4 酵母蛋白的蛋白質印記

將用于檢測TORC1活性所制備的樣品裂解后（見1.2.1），用12% SDS-PAGE電泳并轉移到 PVDF 膜上，用 5%牛奶在試問中封閉 0.5 h，一抗（用1%的牛奶按1:1000稀釋）放置在 4oC下孵育過夜，用 PBST 洗膜4次，每次10分鐘。再用二抗（用1%牛奶按1:20000稀釋）封閉并在室溫下孵育1 h，用 PBST 洗膜5次，每次5分鐘。洗膜完畢之后用化學發光液均勻地浸濕膜，大約1-2分鐘，隨后放在在成像儀里成像適當的時間，最后處理圖像。

1.2.5 統計學處理

所有的數據最后都用Mean ± SEM即平均值±標準差表示。統計分析用 GraphPad Prism 5 軟件來進行并制作圖表。兩組數據之間的統計采用t檢驗，多組數據之間的運用 One-way ANOVA進行比較，并認為p ＜ 0.05 時具有統計學意義。

2 結果

2.1 Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下顯示過度生長特性，并且這種過度生長可以被雷帕霉素抑制

我們從酵母全基因組缺失庫里選取了Elongator復合物的突變體菌株來進行實驗，不同亞基缺失相對應的突變體分別是Δelp1﹑Δelp2﹑Δelp3﹑Δelp4﹑Δelp5和Δelp6。我們以野生型酵母菌株WT作為陰性對照，分別在氨基酸富足的培養基CSH﹑低濃度氨基酸培養基ME上進行生長實驗。我們發現，在CSH上WT與Elongator突變體都可以生長良好，但是在ME培養基上，WT菌株的生長受到了抑制，這是因為細胞能夠感知低濃度氨基酸從而停止生長。與WT菌株不同，Elongator突變體似乎可以忽略低濃度氨基酸信號，仍然持續生長，表現出了過度生長的表型。由于TORC1復合物是細胞中感知氨基酸信號并調控細胞生長的重要機制，為了鑒定這種過度生長是否和TORC1信 號通路相關，我們考察了TORC1抑制劑雷帕霉素對這種過度生長的影響。當我們在低濃度氨基酸培養基ME中加入雷帕霉素后，我們發現Elongator突變體的這種過度生長可以被抑制。這個實驗結果暗示Elongator突變體的過度生長與TORC1信號通路相關。

圖1 Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下顯示過度生長的特性，并且這種過度生長可以被雷帕霉素抑制

WT和Elongator突變體在營養富足（CSH）培養基，低濃度氨基酸（ME）培養基和含5 μg/L 雷帕霉素的ME培養基上的生長實驗，其中菌液分別被五倍濃度梯度稀釋后點在上述三種培養板上。

2.2 Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下通過激活TORC1的活性導致過度生長

從上述實驗結果中我們發現雷帕霉素可以抑制Elongator突變體的過度生長。由于雷帕霉素是TORC1的特異性抑制劑，我們認為野生型Elongator復合物可能具有抑制TORC1活性的功能。所以當Elongator復合物的亞基缺失導致突變時，就解除了對TORC1活性的抑制，從而導致TORC1活性升高，細胞過度生長。為了驗證這個猜想，我們需要檢測Elongator突變體中TORC1的活性。TORC1可以通過磷酸化激活其下游靶標分子——核糖體蛋白S6。當TORC1活性增強時，其下游S6蛋白的磷酸化水平也會提高，所以可以根據S6蛋白的磷酸化水平來檢測TORC1的活性。我們采用免疫印跡檢測了不同Elongator亞基缺失菌株在低濃度氨基酸條件下S6蛋白的磷酸化水平。圖2顯示ELP1﹑ELP2﹑ELP3﹑ELP4﹑ELP5﹑ELP6基因缺失菌株在低濃度氨基酸條件下，TORC1的活性都要高于WT酵母菌株。統計學分析表明，Δelp1﹑Δelp2﹑Δelp3﹑Δelp4﹑Δelp5和Δel6的實驗組與WT相比是有統計學意義的。以上結果說明，與WT菌株不同，Elongator突變體在低濃度氨基酸的條件下仍能保持較高的TORC1活性，從而導致細胞過度生長。

圖2 Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下仍保持較高的TORC1活性

（A）在低濃度氨基酸條件下檢測WT菌株與ELP1和ELP2基因缺失菌株的TORC1的活性。Δelp1和Δelp2實驗組(低濃度氨基酸處理3h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01，***P＜0.001有顯著性差異，Δelp1和Δelp2實驗組(低濃度氨基酸處理6h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01有顯著性差異。（B）在低濃度氨基酸條件下檢測WT菌株與ELP3和ELP5基因缺失菌株的TORC1活性，Δelp3和Δelp5實驗組(低濃度氨基酸處理3h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理3h)相比較，*P＜0.05有統計學意義，Δelp3和Δelp5實驗組(低濃度氨基酸處理6h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01，###P＜0.001有顯著性差異。（C）低濃度氨基酸條件下檢測WT菌株與ELP4和ELP6基因缺失菌株的TORC1活性。Δelp4和Δelp6實驗組(低濃度氨基酸處理3h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01，***P＜0.001有顯著性差異，Δelp4和Δelp6實驗組(低濃度氨基酸處理6h)與WT對照組(低濃度氨基酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01，###P＜0.001有顯著性差異。作圖及方差分析均用GraphPad Prism5軟件完成，數據來源于3次實驗結果，誤差線為標準方差。

2.3 在低濃度氨基酸條件下Elongator突變體體內的自噬可以被抑制

由于TORC1活性的變化可以影響體內的自噬過程,所以，我們設計實驗來觀察Elongator突變體體內的自噬通路在低濃度氨基酸條件下是否有所改變。我們利用一個自噬檢測體系——一個由ATG8啟動子驅動的GFP-ATG8表達質粒。當自噬被誘導時，GFP-ATG8表達；當自噬進一步進行時，ATG8蛋白被降解，產生自由的GFP蛋白（圖3A）。

我們分別在Δelp1﹑Δelp2﹑Δelp3﹑Δelp4﹑Δelp5﹑Δelp6這六種突變菌株和WT中轉入GFP-ATG8質粒，并通過檢測突變體及WT酵母菌株細胞內游離GFP蛋白的表達量來觀察自噬水平的變化。將WT菌株在6h的GFP蛋白的表達量設定為1，其他時間點的GFP蛋白的表達量與WT菌株6h的GFP蛋白的表達量的比值即為%Free GFP的值。由WB結果（圖3B/3C/3D）可知在低濃度氨基酸條件下，Elongator突變體內的游離GFP蛋白的表達量是明顯低于WT菌株的。這說明在低濃度氨基酸條件下， Elongator突變體體內的自噬進程被抑制了。這和Elongator突變體中的高TORC1活性是吻合的。

圖3.在低濃度氨基酸條件下Elongator突變體體內的自噬可以被抑制

（A）在低濃度氨基酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP1和ELP2基因缺失菌株的自噬水平。（B）在低濃度氨基酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP3和ELP5基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達水平。（C）在低濃度氨基酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP4和ELP6基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達水平。

2.4 Elongator突變體可以特異性忽略低濃度亮氨酸從而導致過度生長

目前已有研究報道顯示，TORC1并不是對所有氨基酸的敏感程度都一樣，亮氨酸對它的激活格外重要。通過比較CSH和ME培養基的氨基酸成分，我們發現亮氨酸在CSH中的濃度是ME中的10倍以上。因此，我們想進一步考察Elongator突變體是否能特異性感應低濃度亮氨酸。我們在不改變其他氨基酸濃度的情況下將CSH培養基里亮氨酸含量降低為原來的10%，發現和野生型酵母菌株相比，Elongator突變體仍然呈現出過度生長的特性，并且這種過度生長也可以被雷帕霉素所抑制。與低濃度氨基酸條件下十分 相似。所以，我們可以初步得到結論，Elongator突變體可以特異性忽略低濃度亮氨酸從而導致過度生長。

圖4.Elongator突變體可以特異性忽略低濃度亮氨酸從而導致過度生長，并且這種過度生長可被雷帕霉素抑制

WT和Elongator突變體在營養富足（CSH）培養基，低濃度亮氨酸培養基（10%LEU）和含5 μg/L 雷帕霉素的低濃度亮氨酸培養基上的生長實驗，其中菌液分別被五倍濃度梯度稀釋后點在上述三種培養板上。

2.5 Elongator突變體可以通過特異性忽略低濃度亮氨酸來激活TORC1的活性

從上述實驗結果中我們發現雷帕霉素可以抑制Elongator突變體在低濃度亮氨酸條件下導致的過度生長。根據上述已有實驗結果，我們認為野生型Elongator復合物可能具有特異性感受低濃度亮氨酸從而抑制TORC1活性的功能。所以當Elongator復合物缺失導致突變時，就不能感應細胞內亮氨酸濃度，從而解除了對TORC1活性的抑制。我們同樣對低濃度亮氨酸處理之后的酵母菌株進行免疫印跡分析。實驗結果圖5顯示，在低濃度亮氨酸條件下處理3h和6h之后，Elongator突變體的磷酸化S6蛋白的表達量均高于WT菌株，并通過統計學分析表明，具有統計學意義。這說明，在低濃度亮氨酸條件下，Elongator突變體的TORC1活性也是升高的。以上結果說明，Elongator突變體可以通過特異性忽略低濃度亮氨酸從而激活TORC1的活性，導致細胞過度生長。

圖5.Elongator突變體可通過特異性感受低濃度亮氨酸來激活TORC1的活性

（A）在低濃度亮氨酸條件下檢測WT菌株與ELP1和ELP2基因缺失菌株的TORC1的活性。Δelp1和Δelp2實驗組(低濃度亮氨酸處理3h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01有顯著性差異，Δep1和Δelp2實驗組(低濃度亮氨酸處理6h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01有顯著性差異。（B）在低濃度亮氨酸條件下檢測WT菌株與Elp3和Elp5基因缺失菌株的TORC1活性。Δelp3和Δelp5實驗組(低濃度亮氨酸處理3h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01，***P＜0.001有統計學意義，Δelp3和Δelp5實驗組(低濃度亮氨酸處理6h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理6h)相比較，0.001＜##P＜0.01，###P＜0.001有顯著性差異。（C）低濃度亮氨酸條件下檢測WT菌株與ELP4和ELP6基因缺失菌株的TORC1活性，Δelp4和Δelp6實驗組(低濃度亮氨酸處理3h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理3h)相比較，0.001＜**P＜0.01,***P＜0.001有顯著性差異，Δelp4和Δelp6實驗組(低濃度亮氨酸處理6h)與WT對照組(低濃度亮氨酸處理6h)相比較， ###P＜0.001有顯著性差異。作圖及方差分析均用GraphPad Prism5軟件完成，數據來源于3次實驗結果，誤差線為標準方差。

2.6 Elongator突變體可以特異性忽略低濃度亮氨酸從而抑制體內的自噬

我們接下來來考察低濃度亮氨酸會不會影響Elongator突變體內的自噬。選用上述所說的已轉入GFP-ATG8質粒的WT菌株和Elongator突變體來進行實驗，并通過檢測細胞內游離GFP蛋白的表達量來觀察自噬水平的變化。同樣的將WT菌株在6h的GFP蛋白的表達量設定為1，其他時間點的GFP蛋白的表達量與WT菌株6h的GFP蛋白的表達量的比值為%Free GFP的值。由WB結果（圖6A/6B/6C）可知在低濃度亮氨酸條件下，Elongator突變體內的游離GFP蛋白的表達量是明顯低于WT菌株的。這說明Elongator突變體可以通過特異性忽略低濃度亮氨酸來抑制體內自噬進程。這與上述實驗結果Elongator突變體可特異性忽略低濃度亮氨酸從而導致高TORC1活性是相吻合的。

圖6.Elongator突變體可通過特異性感受低濃度亮氨酸來抑制體內自噬過程

（A）在低濃度亮氨酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP1和ELP2基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達水平。（B）在低濃度亮氨酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP3和ELP5基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達水平。（C）在低濃度亮氨酸條件下處理3h和6h之后檢測WT菌株與ELP4和ELP6基因缺失菌株的游離GFP蛋白的表達水平。

3 討論

包含6個亞基（Elp1-6）的Elongator復合物被報道在許多細胞生理活動中都發揮作用，包括轉錄﹑蛋白乙?；pDNA的去甲基化﹑包外分泌以及tRNA修飾。然而近年來，越來越多的證據顯示，Elongator復合物主要是通過調節tRNA的修飾從而來維持翻譯的高保真性[7]。已有數個研究顯示Elongator復合物參與tRNA擺動位置處尿嘧啶的早期修飾過程。tRNA的第34位核苷酸位于tRNA反密碼子的第一位擺動點，此處的核苷酸修飾往往會影響tRNA對密碼子的識別。在釀酒酵母中，11個tRNA反密碼環的第34位尿苷酸被修飾成5-甲氧羧甲基尿苷（mcm5U），5-氨基酰胺甲基尿苷（ncm5U）以及二硫-5-甲氧羧甲基尿苷（mcm5s2U）。而有研究表明mcm5U 和 ncm5U會提高尿苷酸與腺苷酸或鳥苷酸配對的效率。

Elongator復合物亞基的突變會導致神經退行性疾病，比如家族性自主神經異常（FD）[21]﹑肌萎縮側索硬化癥（ALS）[22]以及羅蘭多癲癇[23]。盡管我們認為Elongator復合物在神經退行性疾病中的角色與它調控著許多細胞進程有關，但是關于此復合物究竟是直接調控多種細胞進程還是通過調控一個進程從而導致不同的下游效應仍然不清楚。有報道顯示，提高細胞內tRNALysUUU和 tRNAGluUUc 這兩種被修飾的tRNA水平可繞過轉錄和胞外分泌過程中對Elongator復合物的需求。而且最近在秀麗隱桿線蟲中的研究發現Elongator并不是一個直接的微管蛋白乙酰轉移酶，而是通過提高AAA密碼子的數量并進行tRNA修飾在翻譯水平上調節微管蛋白乙酰轉移酶的表達水平。一般認為依賴Elongator復合物進行tRNA修飾的過程出錯會通過兩種不同的方式來擾亂轉錄，一種是因為賴氨酸豐富蛋白如核糖體蛋白的翻譯減少而導致整體蛋白質的合成減少，另一種是導致翻譯的不精確以及蛋白質的錯誤折疊。Elongator參與的一些其他細胞生理過程也可能與它對翻譯的調控有關。

在我們的研究中發現，酵母菌株的Elongator復合物中任意一個亞基發生缺失突變都會導致在氨基酸缺乏條件下TORC1活性的增加以及自噬的降低。這說明Elongator復合物與氨基酸介導的TORC1信號通路存在著一定的聯系。TORC1信號通路在酵母和哺乳動物細胞里是高度保守的，其中哺乳動物細胞里的RagA/B蛋白相對應的酵母里的同源蛋白是Gtr1p，RagC/D相對應的酵母里的同源蛋白是Gtr2p，并且RagA/B和RagC/D以及Gtr1p和Gtr2p都是以異二聚體的形式存在[20]。當環境中的氨基酸含量充足時，TORC1的活性就會被Rag/Gtr復合物激活，從而激活下游的一些信號通路比如翻譯來促進細胞的生長。當環境中的氨基酸受到限制時，GATOR1/SEACIT復合物作為RagA/Gtr1的GTPase活化蛋白（GTPase-activing protein,GAP）會使RagA/Gtr1處于非活化狀態[19]，從而來抑制TORC1的活性并誘導自噬。我們的實驗結果顯示，Elongator發生缺失突變的酵母菌株不能通過感應低濃度氨基酸信號來降低TORC1的活性。所以我們認為Elongator對于細胞感應氨基酸信號分子并作出相應的應答是必不可少的。目前普遍認為能夠感應氨基酸水平對于維持細胞的正常生長是至關重要的[17]。而且越來越多的證據顯示氨基酸介導的信號通路失調將會造成細胞生長和營養因子信號脫節，導致許多疾病的產生，包括癌癥﹑糖尿病﹑組織肥大﹑神經退化以及加速老化等。因為Elongator在維持翻譯的準確性里扮演著必不可少的角色，所以Elongator很有可能通過抑制TORC1的活性來防止因過度翻譯而產生錯誤折疊的蛋白。盡管關于Elongator復合物是通過怎樣的分子機制來調節氨基酸介導的TORC1信號通路仍然不是很清楚，但是我們發現了一個有趣的現象，Elongator發生缺失突變的酵母菌株在只缺乏亮氨酸的條件下也顯示出較高的TORC1活性。目前已有相關報道表明單一亮氨酸足便以激活TORC1。在哺乳動物細胞里亮氨酰-tRNA合成酶（leucyl-tRNA synthetase，LRS）可作為細胞內亮氨酸的感應器[24]，通過與RagD相互作用來激活mTORC1。在酒釀酵母中，Elongator可以修飾亮氨酸轉運體反密碼子環的第34位核苷酸形成tRNALeuncm5UmAA，而亮氨酸轉運體很有可能是作為一個中間分子調節調細胞內亮氨酸水平和TORC1活性兩者之間的關系，當然這還需要更多的實驗去證明。

4 結論

本課題運用生物化學及遺傳基因學等方法探討Elongator復合物在低濃度氨基酸條件下對TORC1活性的影響。我們發現Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下顯示過度生長的特性，并且這種過度生長可被TORC1抑制劑雷帕霉素（Rapmycine）所抑制。免疫印跡結果顯示Elongator突變體在低濃度氨基酸條件下TORC1活性上升，而自噬進程被抑制。進一步實驗顯示Elongator 突變體可特異性忽略低濃度亮氨酸而激活TORC1，抑制自噬，從而持續生長。我們認為野生型Elongator復合物有抑制TORC1活性的功能，從而防止因TORC1活性過高導致過度翻譯而產生錯誤折疊的蛋白。

[1] Otero G, Fellows J, LI Y, et al.Elongator, a multisubunit component of a novel RNA polymerase II holoenzyme for transcriptional elongation [J].Mol Cell, 1999, 3(1): 109-118.

[2] Dahmus M E.Reversible phosphorylation of the C-terminal domain of RNA polymerase II [J].J Bio Chem, 1996, 271(32): 19009-19012.

[3] Winkler G S, Petrakis T G, Ethelberg S, et al.RNA polymerase II elongator holoenzyme is composed of two discrete subcomplexes [J].J Bio Chem, 2001, 276(35): 32743-32749.

[4] LI Y, Takagi Y, Jiang Y W, et al.A multiprotein complex that interacts with RNA polymerase II elongator [J].J Bio Chem, 2001, 276(32): 29628-29631.

[5] Hawkes N A, Otero G, Winkler G S, et al.Purification and characterization of the human Elongator complex [J].J Bio Chem, 2002, 277(4): 3047-3052.

[6] Solinger J A, Paolinelli R, Kloss H, et al.The Caenorhabditis elegans Elongator Complex Regulates Neuronal alpha-tubulinAcetylation [J].Plos Genet, 2010, 6(1): e1000820.

[7] Frohloff F, Jablonowski D, Fichtner L, et al.Subunit communications crucial for the functional integrity of the yeast RNA polymerase II elongator (gamma-toxin target (TOT)) complex [J].J Bio Chem, 2003, 278(2): 956-961.

[8] Ruan G X, Kazlauskas A.Focus on Molecules: Akt (PKB) [J].Exp Eye Res, 2011, 93(5): 570-571.

[9] Krogan N J, Greenblatt J F.Characterization of a six-subunit holo-elongator complex required for the regulated expression of a group of genes in Saccharomyces cerevisiae [J].Mol Cell Biol, 2001, 21(23): 8203-8212.

[10] Versees W, De G S, Van Lijsebettens M.Elongator, a conserved multitasking complex? [J].Mol Microbiol, 2010, 76(5): 1065-1069.[11] Shimobayashi M, Hall M N.Multiple amino acid sensing inputs to mTORC1[J].Cell Res, 2016, 26(1): 7-20.

[12] Conrad M, Schothorst J, Kankipati H N, et al.Nutrient sensing and signaling in the yeast Saccharomyces cerevisiae [J].FEMS microbiol Rev, 2014, 38(2): 254-299.

[13] Efeyan A, Comb W C, Sabatini D M.Nutrient-sensing mechanisms and pathways [J].Nature, 2015, 517(7534): 302-310.[14] Yerlikaya S, Meusburger M, Kumari R, et al.TORC1 and TORC2 work together to regulate ribosomal protein S6 phosphorylation in Saccharomyces cerevisiae[J].Mol Biol Cell , 2016, 27(2): 397-409.

[15] Bond P.Regulation of mTORC1 by growth factors, energy status, amino acids and mechanical stimuli at a glance [J].J Int Soc Sport Nutr, 2016, 13(1): 8.

[16] Jin M Y, Klionsky D J.The amino acid transporter SLC38A9 regulates MTORC1 and autophagy [J].Autophagy, 2015, 11(10): 1709-1710.

[17] Meijer A J, Lorin S, Blommaart E F, et al.Regulation of autophagy by amino acids and MTOR-dependent signal transduction [J].Amino acids, 2015, 47(10): 2037-2763.

[18] Kim J, Kim E.Rag GTPase in amino acid signaling [J].Amino acids, 2016, 48(4): 915-928.

[19] Peli G M P, Sardu A, Panchaud N, et al.Amino Acids Stimulate TORC1 through Lst4-Lst7, a GTPase-Activating Protein Complex for the Rag Family GTPase Gtr2 [J].Cell Rep, 2015, 13(1): 1-7.

[20] Sekiguchi T, Kamada Y, Furuno N, et al.Amino acid residues required for Gtr1p-Gtr2p complex formation and its interactions with the Ego1p-Ego3p complex and TORC1 components in yeast [J].Genes Cells, 2014, 19(6): 449-463.

[21] Anderson S L, Coli R, Daly I W, et al.Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene [J].Am J Hum Genet, 2001, 68(3): 753-758.

[22] Simpson C L, Lemmens R, Miskiewicz K, et al.Variants of the elongator protein 3 (ELP3) gene are associated with motor neuron degeneration [J].Hum Mol Genet, 2009, 18(3): 472-481.

[23] Strug L J, Clarke T, Chiang T, et al.Centrotemporal sharp wave EEG trait in rolandic epilepsy maps to Elongator Protein Complex 4 (ELP4) [J].Eur J Hum Genet, 2009, 17(9): 1171-1181.

[24] Bonfils G, Jaquenoud M, Bontron S, et al.Leucyl-tRNA Synthetase Controls TORC1 via the EGO Complex [J].Mol Cell, 2012, 46(1): 105-110.

The Ef f ec of Elongator Complex on TORC1 in Condition with Low Concentration Amino Acid

He Ge, Teng Xinchen
(College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, 215000)

Aim: To investigate the effect of Elongator complex on TORC1 activity in response to low amino acids.Methods: Determine the growth level of Elongator mutant yeast in low amino acids and low leucine by growth assays; Determine TORC1 activity by immunoblotting phosphorylated ribosomal protein S6; Transform GFP-ATG8 plasmid in Elongator mutant and the wild type yeast cells, and determine the autophagy flux by quantifying the free GFP.Results: Elongator mutant yeast show overgrowth phenotype in low amino acids and such overgrowth phenotype can be abolished by TORC1 inhibitor rapamycin; Elongator mutant cells show elevated TORC1 activity and decreased autophagy flux; Further experiments show that the Elongator mutant cells specifically ignore low leucine signal to maintain high TORC1 activity and inhibit autophagy, thus keep growing.Conclusion: Elongator complex can inhibit TORC1 activity and promote autophagy in response to amino acid signal.It is hypothesized that Elongator complex may inhibit TORC1 signaling pathway to ensure translational fidelity.

Elongator complex; TORC1 activity; amino acid-sensing

R341 [Document Code] A

10.11967/2017150207

R341

A DOI： 10.11967/2017150207

江蘇省青年基金（BK2014318）

何格（1992-），女，碩士研究生，腫瘤藥理學。

滕昕辰（1980-），女，特聘副教授，腫瘤藥理學。E-mail:xcteng@suda.edu.cn