抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體隨機突變與篩選

吳紅靜，曹冬梅，許 楊,，付金衡，涂 追,*

抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體隨機突變與篩選

吳紅靜1,2，曹冬梅1，許 楊1,3，付金衡3，涂 追1,*

（ 1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學科學技術學院，江西 南昌 330029；3.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047）

采用易錯聚合酶鏈式反應技術，對來源于天然納米抗體文庫的抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）納米抗體進行隨機突變，通過優化和比較突變條件，構建了突變分布均勻的突變文庫。噬菌體展示技術對突變文庫進行了6 輪篩選，獲得了8 種突變序列，其檢測信號為野生型2.1 倍。多序列比對及三維結構建模分析表明，突變序列的突變位點集中于互補決定區與框架區連接的區域，并且部分序列出現了可以形成二硫鍵的氨基酸殘基。研究結果為抗DON納米抗體進一步的深度突變和改造提供了線索，同時可為其他抗小分子納米抗體的改造提供借鑒。

納米抗體；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；易錯聚合酶鏈式反應；噬菌體展示

納米抗體是由天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavychain antibodies，HCAbs）可變區構成，又稱為VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chain）抗體[1]。納米抗體具有分子質量小、易于表達以及穩定性好等優點，現已廣泛應用于生物醫學研究、診斷及食品安全等領域[2-5]。近年來，在食品安全檢測領域，納米抗體已成功用于抗原模擬、傳統抗體替代等方面的應用[6-9]。雖然如此，目前針對小分子的高親和力納米抗體報道較少，有學者指出基于納米抗體本身的結構特點，動物免疫系統可能并不適合產生高親和力的抗小分子納米抗體[10]。因此，采用體外突變和分子改造技術可為提高納米抗體的親和力、穩定性等特性提供有效途徑[11-14]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）屬于B類單端孢霉烯族真菌毒素，是一種由真菌產生的次級代謝產物[15]。前期研究從天然納米抗體噬菌體展示文庫中篩選獲得了可特異結合DON的納米抗體，命名為DONIV2[16]。本研究采用易錯聚合酶鏈式反應（error prone polymerase chain reaction，epPCR）對DONIV2進行隨機突變，通過噬菌體展示技術對突變文庫進行淘選，比較突變序列氨基酸殘基變化以及突變位點三維結構的位置，分析抗DON納米抗體與DON相互作用的機制和特點，為定向改造研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌（Escherichia coli）TG1，含有抗DON納米抗體編碼基因的質粒pRX2-DONIV2，噬菌粒pHEN1和輔助噬菌體KM13均為實驗室保藏[16]。

1.1.2 試劑

限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、TA克隆載體（pMD18-T）及各種DNA試劑盒 TaKaRa公司；T4連接酶 New England Biolab公司；酵母膏、蛋白胨英國Oxoid公司；辣根過氧化物酶偶聯的抗M13單克隆抗體（HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate） 美國GE Healthcare公司；氨芐青霉素、卡那霉素、四甲基聯苯胺、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、脫脂乳 上海生物工程有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 引物

表 1 隨機突變及鑒定所用的引物Table 1 Primers used for epPCR

隨機突變以及突變文庫鑒定所用的引物見表1。引物T7prom和T7term為載體pRX2的通用引物，分別位于抗DON納米抗體編碼基因兩側；引物M13和pHEN-R為載體pHEN1通用引物。PCR引物合成和DNA測序委托上海英俊生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 易錯PCR

常規PCR體系（25 μL）中含有模板DNA（pRX2-DONIV2）10 ng、引物各10 pmol、10×PCR緩沖液（不含Mg2+）、TritonX-100 0.01%、MgCl21.5 mmol/L、dNTP各0.16 mmol/L、Taq聚合酶1.25 U。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，10 個循環；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，25 個循環；72 ℃延伸10 min。

易錯PCR體系在常規PCR體系的基礎上進行，擴增條件相同，對Mg2+濃度、Mn2+濃度、TritonX-100濃度進行單因素試驗。單因素優化后的條件下，設置Ⅰ和Ⅱ兩組不同的dNTP濃度，Ⅰ組的4 種dNTP濃度均為0.16 mmol/L，Ⅱ組dATP和dGTP濃度均為0.16 mmol/L、dTTP和dCTP濃度均為1 mmol/L。

Ⅰ和Ⅱ兩組易錯PCR條件下的產物分別以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，然后按照TA克隆試劑盒說明，分別將兩種純化的易錯PCR產物克隆到pMD18-T載體，氯化鈣法轉化大腸桿菌TG1感受態細胞，分別隨機挑選10 個克隆進行測序。對兩組易錯PCR產物的突變位點、突變率以及突變類型等指標進行比較分析，選擇適當突變率、突變分布均勻的易錯PCR產物構建文庫。

1.2.2 易錯PCR文庫的構建與鑒定

將易錯PCR產物與噬菌粒pHEN1分別用限制性內切酶SfiⅠ和NotⅠ雙酶切，經瓊脂糖凝膠回收、定量后，以物質的量比3∶1，16 ℃條件下過夜連接。連接產物經乙醇沉淀后，溶于10 μL無菌水，電穿孔轉化大腸桿菌TG1，感受態細胞的制備與轉化，按照參考文獻[18]進行。取10 μL電擊、培養后的菌液倍比稀釋，涂布LB（含100 μg/mL氨芐青霉素）培養板，計算庫容。其余部分全部涂布于24 cm×24 cm LB（含100 μg/mL氨芐青霉素）培養板，37 ℃條件下倒置培養16 h。用5 mL LB培養基將培養板上的菌苔刮洗后，加入終含量25%甘油，分裝，－80 ℃條件下保存備用。從計算庫容的平板上隨機挑取10 個克隆，采用通用引物M13-R和pHEN-R進行菌落PCR驗證，計算有效庫容量。

接種至少10 倍庫容量的活細胞于5 mL的LB（含2%葡萄糖，100 μg/mL氨芐青霉素），30 ℃、220 r/min振搖培養至OD600nm達0.5，按感染復數20∶1加入輔助噬菌體，37℃、220 r/min振搖培養60 min。將培養物離心，用50 mL LB（含100 μg/mL 氨芐青霉素、50 μg/mL卡那霉素）重懸沉淀，30 ℃、220 r/min振搖培養過夜后，3 000×g離心取上清液，按標準的聚乙二醇/NaCl法純化噬菌體[18]，即得到噬菌體抗體文庫，取10 μL測定滴度，其余分裝于－80 ℃條件下保存備用。

1.2.3 噬菌體擴增、純化和滴度測定

[18]進行測定。

1.2.4 易錯PCR文庫的淘選

以甲基化牛血清白蛋白（methylated BSA，MBSA）為載體，參考文獻[17]制備DON人工抗原DON-MBSA。采用競爭洗脫法對突變文庫進行淘選，方法參見文獻[19]，人工抗原DON-MBSA（100 μg/mL）包被酶標板，每輪3% BSA和3% OVA交替封閉，競爭洗脫采用50 ng/mL的DON溶液孵育1 h。

1.2.5 間接phage-ELISA

采用phage-ELISA法對淘選后的克隆進行親和力鑒定[20]。酶標板中包被磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋的人工抗原DON-MBSA（1 μg/mL），3%脫脂乳封閉后，分別加入淘選后的噬菌體克隆和未突變的原始噬菌體克隆DONIV2，PBST（含0.5%吐溫20的PBS溶液）洗板后，以HRP/Anti-M13（用3%脫脂乳，按1∶5 000（V/V）稀釋）檢測吸附的噬菌體。

1.2.6 三維結構模擬與對比

采用I-TASSER4.4軟件建立納米抗體的三維結構[21-22]。預測結果采用軟件UCSF Chimera進行顯示和編輯[23]。

2 結果與分析

2.1 隨機突變文庫的構建與鑒定

2.1.1 易錯PCR條件的優化

圖 1 不同Mg2＋濃度條件下易錯PCR電泳圖Fig. 1 Effects of Mg2+concentration on the epPCR

為了獲得隨機突變的編碼基因，同時保證擴增產物特異性和產量，在普通PCR的基礎上，首先對Mg2+、Mn2+濃度、TritonX-100濃度進行了單因素優化試驗。如圖1所示，隨著Mg2+濃度的增加，擴增產物濃度下降，當Mg2+濃度大于6 mmol/L時，凝膠電泳未檢測到擴增產物。高濃度的Mg2+能穩定錯配的堿基對，因此選擇較高的Mg2+濃度6 mmol/L。

圖 2 不同Mn2＋濃度條件下易錯PCR電泳圖Fig. 2 Effects of Mn2+concentration on the epPCR

反應體系中加入Mn2+可以降低聚合酶對模板的特異性，提高錯配率。Mn2+濃度優化結果如圖2所示，當Mn2+濃度降至0.2 mmol/L時，凝膠電泳出現特異性目的條帶，選擇Mn2+適宜濃度為0.2 mmol/L。

圖 3 不同TritonX-100體積分數條件下易錯PCR電泳圖Fig. 3 Effects of TritonX-100 concentration on the epPCR

反應體系中TritonX-100體積分數對易錯PCR的影響結果如圖3所示，PCR產物的量隨著TritonX-100體積的提高而增加，當體積分數達到0.04%時，PCR產物產量最大（泳道4）。

2.1.2 易錯PCR產物突變分析

表 2 突變產物序列分析Table 2 Mutation spectrum of random mutagenesis

分別隨機挑取10 個兩組不同dNTP組分條件下的易錯PCR產物進行序列分析，突變條件Ⅰ的總突變率為1.16%，突變條件Ⅱ的總突變率為0.86%，發生的突變絕大多數為點突變，缺失和插入較少（表2）。突變條件Ⅱ的轉換比例（A∶T→G∶C/G∶C→A∶T）較突變條件Ⅰ小，即轉換的偏好性更低，同時條件Ⅱ產物突變點的分布比條件Ⅰ突變點的分布更為均勻，綜合考慮，采用突變條件Ⅱ的產物進行文庫構建，平均每個克隆突變3～4 個核苷酸位點。

2.2 隨機突變文庫的構建、淘選與鑒定

2.2.1 文庫的構建與淘選

將易錯PCR產物用SfiⅠ和NotⅠ雙酶切，凝膠電泳回收純化，連接至噬菌粒載體pHEN1，連接產物電轉化大腸桿菌TG1感受態細胞，菌落計數結果顯示，獲得約6×106個獨立克隆，輔助噬菌體救援后得到噬菌體展示文庫滴度約為2.7×1013CFU/mL。

圖 4 間接phage-ELISA測定每輪擴增產物Fig. 4 Indirect phage-ELISA of amplified phages from each round of panning

采用固相篩選的方法，對隨機突變文庫進行了6 輪篩選，phage-ELISA檢測擴增后的每輪競爭洗脫物，結果顯示在同樣的實驗條件下，OD450nm隨著淘選的進行而升高，提示親和力提高的突變得到了富集（圖4）。

2.2.2 phage-ELISA鑒定陽性克隆

圖 5 陽性克隆多序列比對結果Fig. 5 Multi-sequence alignment of mutants

從第6輪淘選競爭洗脫產物測定滴度的平板上，隨機挑取96 個克隆，經輔助噬菌體救援后，進行phage-ELISA檢測。以未突變的野生型克隆DONIV2作為對照，設置OD450nm為對照的2.1 倍為陽性標準，測定的96 個克隆中，共有30 個克隆為陽性，陽性率達31.3%。陽性克隆測序分析結果顯示，共獲得了8 條不同的突變序列（圖5）。

2.3 三維結構模擬與分析

圖 6 抗DON納米抗體三維結構模擬與對比Fig. 6 Three-dimensional structure modeling

采用蛋白建模軟件I-TASSER4.4，對突變前野生型抗DON納米抗體DONIV2和2 個出現頻率最高的突變子6A-B5和6A-D12進行三維結構建模，結果如圖6A～C所示。通過結構對比發現，突變子的CDR3區域的結構與突變前的CDR3區域結構差異較大，其他部分主鏈結構基本一致（圖6D）。

3 結 論

突變方法及反應條件對目的序列的突變率、突變位點等結果具有明顯的影響。Rasila等[24]對易錯PCR、化學突變和高突變菌株3 種突變方法的效果進行了詳細的比較研究，發現易錯PCR的突變率高和突變范圍更廣。本研究對易錯PCR突變的條件進行了優化和比較，選擇突變率適宜、突變位點分布均勻的突變條件，為鑒定影響結合活性的關鍵區域提供了基礎。

通過比較突變前后氨基酸序列的變化，發現突變位點明顯集中在CDR與FR連接的區域（圖5），而CDR形成loop結構的位置發生突變較少，說明抗原結合表位可能直接由CDR-loop組成，這與分子對接結果吻合[25]。Min等[12]通過酵母展示系統對抗黃曲霉毒素B1的親和力成熟的研究中，也發現大多數發生突變的位點不在CDR區域。值得注意的是，部分突變子（6A-D12和6A-H8）同時突變得到2 個半胱氨酸殘基，三維結構模型顯示，2 個半胱氨酸殘基空間位置相鄰（圖6C），可形成新的二硫鍵，穩定蛋白質的結構，提示在蛋白質的設計和改造中，引入二硫鍵有利于穩定分子結構。

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Random Mutation and Mutant Screening of Anti-Deoxynivalenol Nanobody

WU Hongjing1,2, CAO Dongmei1, XU Yang1,3, FU Jinheng3, TU Zhui1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330029, China; 3. Jiangxi-OAI Joint Research Institution, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In this work, an anti-deoxynivalenol nanobody isolated from a naive phage display library was adopted to investigate the relationship between bioactivity and the composition of amino acid residues using error prone polymerase chain reaction (epPCR) and phage display. The epPCR was firstly optimized to produce a phage display library with balanced distribution of mutation. After six rounds of panning of the mutant library, 30 out of 96 picked clones exhibited 8 different mutations, whose signal was 2.1 folds higher than that of the wild-type clone. Multi-sequence alignment analysis showed that mutant sites were prone to be found in the junction region between complementarity determining regions (CDRs) and framework regions (FRs). Three-dimensional structure modeling results indicated that some mutants were capable of forming an intramolecular disulphide bond, which benefits to stabilize the molecular structure. These data can provide a clue for further mutation and modification of anti-deoxynivalenol nanobody and also provide a guideline for the design of nanobody recognizing other low molecular weight compounds.

nanobody; deoxynivalenol; error prone PCR; phage display

10.7506/spkx1002-6630-201710001

TS201.6

A

1002-6630（2017）10-0001-05

吳紅靜, 曹冬梅, 許楊, 等. 抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體隨機突變與篩選[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710001. http://www.spkx.net.cn

WU Hongjing, CAO Dongmei, XU Yang, et al. Random mutation and mutant screening of anti-deoxynivalenol nanobody[J]. Food Science, 2017, 38(10): 1-5. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710001. http://www.spkx.net.cn

2016-06-12

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301479）；江西省教育廳科學技術研究項目（GJJ151502）；南昌大學科學技術學院自然科學基金項目（2013-ZR-05）

吳紅靜（1981—），女，講師，碩士，研究方向為食品安全與營養。E-mail：51531843@qq.com

*通信作者：涂追（1982—），男，副研究員，博士，研究方向為食品安全與生物技術。E-mail：tuzhui@ncu.edu.cn