枯草芽孢桿菌纖維素酶基因整合載體的構建

聶利波，王占彬，史敦勝，宋洋洋，李 旺

枯草芽孢桿菌纖維素酶基因整合載體的構建

聶利波，王占彬，史敦勝，宋洋洋，李 旺*

（河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003）

目的：以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為宿主，構建纖維素酶基因整合表達載體，獲得能夠表達纖維素酶并且降解纖維素的工程菌。方法：通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）從B. subtilis LN基因組中克隆同源片段M1、M2基因片段，以質粒pGEM-T為載體，將同源片段M1、M2、啟動子P43和葡萄糖苷酶基因CelKg連接在一起構建整合載體pGEM-Kmpgmt，并采用雙交換同源重組的方式將其轉化進入B. subtilis LN基因組中。結果：通過PCR和雙酶切驗證整合載體構建完成，并成功整合到野生型B. subtilis LN中，獲得重組菌B. subtilis Kpg。剛果紅染色結果顯示重組菌對羧甲基纖維素鈉有降解作用。改良培養基37 ℃條件下搖瓶培養，重組菌B. subtilis Kpg生長至18 h時上清液中纖維素酶活力比野生型B. subtilis LN提高了115%。

同源重組；纖維素酶基因；枯草芽孢桿菌

纖維素是植物組織中最豐富的組成成分之一，但在飼料中的利用率較低。以秸稈丟棄和焚燒為例，既造成嚴重的環境污染，又浪費了大量的飼料資源[1-2]。但是除牛羊等反芻動物外，大多數畜禽對纖維素的利用率都很低。隨著生物技術的發展，纖維素酶的生物轉化為纖維素的利用提供新的方式。既可以高效轉化纖維素類底物，創造經濟利潤[3-5]，又可以為飼料資源的開發開辟新的方向，緩解了目前飼料資源緊張的局面[6-7]。此外，纖維素酶作為一種綠色添加劑，在提高飼料轉化率的同時，也降低了對環境的影響。

為提高纖維素酶的活性，常借助分子技術構建高表達載體來改善酶活力。在以往載體構建的相關研究中，通常將外源基因直接以質粒的形式，轉入受體菌來構建重組菌。但是由于質粒存在不穩定性，在細胞分裂過程中會引起質粒的丟失和分配不均，影響外源基因的表達[8]。同源重組技術可以將外源基因整合到宿主基因組中，避免了導入整個質粒帶來的不確定性，并且改善了工程菌遺傳的穩定性[9]。在宿主選擇方面，為了獲得高活性的外源酶產物，最初忽略了宿主的安全性。但是，隨著人們安全意識的提高和在飼料中使用方便性的要求，越來越多的動物益生菌作為基因工程的宿主來使用[10]。

本實驗采用動物消化道的野生型枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）LN為宿主菌，利用同源重組的方式，將外源纖維素酶基因整合到宿主中構建重組菌，以期提高纖維素酶活力并為將來在飼料實踐中使用提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒

大腸桿菌E.coli DH5α 天根生化科技（北京）有限公司；pGEM?-T Easy Vector載體 美國Promega公司；pGEM-P43質粒（含啟動子P43基因）、pGEM-M1質粒（含同源片段M1基因）、pGEM-M2質粒（含同源片段M2基因）、pGEM-Kg質粒（含葡萄糖苷酶基因CelKg基因）、野生型B. subtilis LN 河南科技大學生物飼料與精準營養實驗室構建保存。

1.1.2 試劑

質粒小提試劑盒、瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶 美國NEB公司；蛋白胨、酵母粉、羧甲基纖維素鈉 洛陽博冠商貿有限公司。

1.1.3 儀器與設備

高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；臺式冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scienti c公司；基因擴增熱循環儀 西安天隆科技有限公司；DYY-10C型電泳儀北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統 上海天能科技有限公司；電熱恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；雙人凈化工作臺 浙江蘇凈凈化設備有限公司。

1.1.4 引物設計和合成

根據GenBank中啟動子P43基因和同源片段M1、M2基因的序列，按照通常引物的設計原則，利用Vector NTI分析軟件分別設計含有對應酶切位點的引物P4326F/ P4326R（P43基因）、M1tF/M1tR（M1基因）和M2tF/ M2tR（M2基因）。引物由上海生工生物工程股份公司合成（表1）。

表 1 引物名稱與序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1 含M1、P43、CelKg、M2基因pGEM-T重組載體的構建

通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，分別利用引物P4326F/P4326R、M1tF/M1tR和M2tF/M2tR從相應的質粒pGEM-P43、pGEM-M1和pGEM-M2中擴增獲得啟動子P43和同源片段M1、M2基因。通過1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段純化回收。PCR回收產物分別使用對應的限制性內切酶NcoⅠ、SacⅡ（P43基因）ApaⅠ、AatⅡ（M1基因）SalⅠ、BstXⅠ（M2基因）進行雙酶切，并將產物回收。雙酶切回收產物依次插入質粒pGEM-Kg中，構建整合載體pGEM-Kmpgmt。將重組質粒進行測序，并通過VectorNTI軟件和NCBI數據庫對其序列進行分析。

1.2.2 野生型B. subtilis LN感受態的制備

野生型B. subtilis LN感受態的制備過程參考野生型枯草芽孢桿菌N4的spizizen轉化法[11]。

1.2.3 含M1、P43、CelKg、M2基因重組菌B. subtilis Kpg的構建

將構建好的pGEM-Kmpgmt質粒10 μg與500 μL的B. subtilis感受態混合，37 ℃、210 r/min振蕩培養40 min，然后加入500 μL LB液體培養基37 ℃、210 r/min振蕩培養30 min，使菌體復蘇。取100 μL菌液均勻涂布于LB固體培養基上，37 ℃恒溫培養箱中倒置培養14～16 h。從LB固體培養基上挑取單菌落為模板，以P4326F/P4326R為引物，利用PCR技術進行檢測，將顯現有500 bp的單菌落樣品進行保菌，記作B. subtilis Kpg。

1.2.4 重組菌B. subtilis Kpg的分離鑒定

將重組菌B. subtilis Kpg稀釋103倍后取10 μL滴于含1%剛果紅的羧甲基纖維素（carboxyl methyl cellulose，CMC）培養基上，倒置培養16 h，觀察是否有透明圈的出現。將出現透明圈的菌落涂布于LB固體培養基上，挑取單菌落進行革蘭氏染色，通過顯微鏡觀察菌體形態。

1.2.5 重組菌B. subtilis Kpg纖維素酶活性的分析

從CMC培養基挑取透明圈直徑最大的菌種，接種于LB液體培養基中37 ℃、210 r/min振蕩培養至對數期，分成6 個實驗組，按1∶100（V/V）接種于5 mL種子培養基中37 ℃、210 r/min進行培養。野生型B. subtilis LN作為對照組同樣處理。在12、18、24、30、36、48 h時分別取3 mL菌液4 ℃、5 000 r/min離心30 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液1 mL加入羧甲基纖維素酶底物溶液2 mL，50 ℃恒溫水浴30 min，加入2.5 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）染液沸水浴10 min，迅速用流水冷卻至室溫后定容至25 mL[12]。以不加酶液的相同底物為對照，測定540 nm波長處OD值。

1 個酶活力單位（U/mL）定義為50 ℃條件下，以1 mL纖維素酶粗酶液在1 min內水解羧甲基纖維素鈉生成1 μg葡萄糖的酶量，酶活力（X）根據以下公式計算：

式中：N為酶樣所稀釋的倍數；k為葡萄糖標準曲線的斜率；t為反應時間/min；V為酶樣體積/mL。

2 結果與分析

2.1 整合載體pGEM-Kmpgmt質粒的構建

圖 1 載體構建路線Fig. 1 Route for vector construction

將啟動子P 4 3與同源片段M 1、M 2依次和含有葡萄糖苷酶基因C e l K g的載體p G E M-K g連接（圖1），每次均利用藍白斑篩選，挑菌提取質粒進行雙酶切驗證。通過酶切結果顯示，利用NcoⅠ、SacⅡ雙酶切后，菌落3獲得大小約為477 bp和4 697 bp的兩個片段（圖2）；利用ApaⅠ、AatⅡ雙酶切后，菌落1、菌落3均獲得大小約為500 bp和5 170 bp的兩個片段（圖3）；利用SalⅠ、BstXⅠ雙酶切后，菌落1獲得大小約為500 bp和5 700 bp的兩個片段（圖4）。將連接成功的菌種保菌以便后續實驗。通過以上酶切結果顯示，在連接產物中成功地檢測到相應的目的基因，證明每一步都達到預期的結果。將構建好的載體pGEM-Kmpgmt測序，測序結果顯示啟動子P43和同源片段M1、M2均已成功克隆到載體pGEM-Kg上。

圖 2 質粒pGEM-Kpgt雙酶切檢驗（NcoⅠ、SacⅡ）Fig. 2 Identification by double restriction-enzyme digestion of plasmid pGEM-Kpgt (Nco Ⅰ, SacⅡ)

圖 3 質粒pGEM-Kmpgt雙酶切檢驗（ApaⅠ、AatⅡ）Fig. 3 Verification by double restriction-enzyme digestion of plasmid pGEM-Kmpgt (Apa Ⅰ, AatⅡ)

圖 4 質粒pGEM-Kmpgmt雙酶切檢驗（SalⅠ、BstXⅠ）Fig. 4 Verification by double restriction-enzyme digestion by plasmid pGEM-Kmpgmt (Sal Ⅰ, BstXⅠ)

2.2 重組菌B. subtilis Kpg的構建

圖 5 重組菌的PCR鑒定Fig. 5 Identification of recombinant B. subtilis by PCR method

將構建好的載體pGEM-Kmpgmt通過化學轉化的方式轉入B. subtilis LN感受態中，涂板后挑菌以P4326F/ P4326R為引物進行菌落PCR。在挑取的7 種菌里，菌落1、2、3、6均可以擴增出基因片段P43（圖5）。啟動子P43并非來源于B. subtilis LN，重組質粒pGEM-Kmpgmt進入細胞后，由于同源臂的作用，與受體菌自身基因組發生雙交換，順利將其整合到B. subtilis LN基因組內，所以能從中擴增出大小約為500 bp的片段。實驗結果證明構建的載體pGEM-Kmpgmt已通過同源重組的方式將葡萄糖苷酶基因CelKg和啟動子P43整合到了B. subtilis LN的基因序列中。

2.3 重組菌B. subtilis Kpg纖維素降解能力的檢測

將上一步獲得的重組菌1、2、3、6進行剛果紅染色，菌落周圍均產生透明圈，證明其具有分解纖維素的能力[13]（圖6）。重組菌透明圈的直徑均大于野生型B. subtilis LN，其中重組菌3的透明圈直徑最大。LB固體培養基上，這4 種菌落都呈微黃色，中間凸起，表面光滑，周圍有不規則的褶皺，符合B. subtilis的菌體形態特征。在1 000 倍的顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，均有芽孢出現，和野生型B. subtilis LN形態相同，革蘭氏染色鏡檢呈陽性（圖7）。

圖 6 重組菌與野生菌的剛果紅染色Fig. 6 Congo red staining of wild-type and recombinant B. subtilis

圖 7 重組菌與野生菌的革蘭氏染色Fig. 7 Gram staining of wild-type and recombinant B. subtilis

2.4 重組菌B. subtilis Kpg纖維素酶活性的分析

圖 8 重組菌與野生菌纖維素酶活力Fig. 8 Cellulase activities of wild-type and recombinant B. subtilis

從CMC-剛果紅培養基中挑取重組菌3，進行纖維素酶活力分析，以野生型B. subtilis LN為對照。繪制葡萄糖的標準曲線得出k為0.722 7。通過酶活力公式計算出各時間段重組菌3和野生型B. subtilis LN的酶活力。結果發現，在37 ℃、210 r/min條件下，重組菌3在各時間段纖維素酶活力均高于同時間段野生型B. subtilis LN，在18 h時重組菌3的纖維素酶活力最大，達到55.22 U/mL，相對于野生型B. subtilis LN酶活力提高了115%（圖8）。將重組菌3記作B. subtilis Kpg。

3 討 論

葡萄糖苷酶基因CelKg源自于B. subtilis K的基因組，全長為1 686 bp。通過NCBI對其進行序列分析，葡萄糖苷酶基因CelKg與已經報道的B. subtilis纖維素酶基因CP002468.1、CP003329.1、CP003695.1、AP012495.1、AP012496.1的基因序列相似度達到99%；其編碼的氨基酸序列與已知B. subtilis的葡萄糖苷酶基因ZP12669813.1、YP004205293.1、YP007428400.1、YP007464110.1、YP007208039.1編碼的氨基酸序列相似性達到99%[14]。根據本實驗剛果紅染色結果顯示，重組菌B. subtilis Kpg的表達產物對羧甲基纖維素鈉有降解作用，即葡萄糖苷酶基因CelKg能在宿主B. subtilis LN內順利表達。啟動子P43是B. subtilis胞苷脫氨酶基因的啟動子，屬于組成型啟動子，與RNA聚合酶σ43（σA）和σ37（σB）的識別區相互重疊[15]。B. subtilis的DNA轉錄過程中，σA主要參與營養期基因的起始轉錄，而當細胞生長至對數期晚期和穩定期早期時由σB負責基因的起始轉錄[16]。張婷婷等[17]將啟動子P43插入載體Peb-bgaB前段后導入B. subtilis，發現啟動子P43在細菌生長至對數期時便開始表現轉錄活性，隨著細菌的不斷生長，P43活性不斷提高，到達平穩期時其活性逐漸趨于平穩。本實驗中，重組菌B. subtilis Kpg在18 h纖維素酶活性最高，當細菌生長至36、40、48 h時，重組菌B. subtilis Kpg和野生型B. subtilis LN纖維素酶活性都趨于平穩并逐漸降低，但是重組菌B. subtilis Kpg相對同時期的野生型B. subtilis LN纖維素酶活性卻提高了147%、121%、160%，與張婷婷等[17]實驗結果一致。

本實驗選用的同源片段M1、M2均來自于B. subtilis LN的基因組中。在同源重組過程中，選擇合理的整合位點，可以減輕突變引起的破壞，且最小程度地影響目的蛋白的結構和功能[18]。此外，同源片段的長度對重組效率也很關鍵。聶宇等[19]通過實驗發現，當同源片段達到50 bp時鋅指核酸酶就可以完成對同源重組的介導，當同源片段增長時，介導能力就越強，整合效率也就越高。但當同源臂過長，整合效率不再提高，反而會增加基因突變，對目的基因的表達產生影響[20]。在B. subtilis進行同源重組時，要求同源片段的長度至少為400～500 bp，這樣才能保證重組的成功[21]。同源片段M1、M2長度各為500 bp，盡可能的減少片段過長引起的突變或過短造成的整合效率偏低。這兩段基因所在的位置在B. subtilis LN基因組中并無明確的意義，因此在此處進行同源重組，并不會給葡萄糖苷酶基因CelKg的表達和整個基因組的穩定遺傳帶來不良影響。

圖 9 雙交換同源重組Fig. 9 Double crossover homologous recombination

芽孢桿菌質粒在復制過程中對結構的重新排列比較敏感，常常產生不穩定的單鏈DNA，這樣會引起目的基因的不表達或丟失[22]。劉暉[23]將3 種來源不同纖維素酶基因以質粒的形式分別導入B. subtilis中，在獲得3 株重組菌中，只有兩株能夠表達目的蛋白，剩下一株沒有表達或表達量很低。為避免這種情況，Duncan等[24]首次使用同源重組的方式，從B. subtilis噬菌體中克隆出胸腺嘧啶合成酶基因thy，以大腸桿菌質粒為載體，構建新型重組質粒。依靠φ3Tthy基因兩側序列與芽孢桿菌染色體具有一定的同源性，成功的轉化進B. subtilis 突變體。近幾年，同源重組技術已經廣泛的應用在乳酸菌、酵母菌、B. subtilis、癌細胞等微生物方面[25-28]。本實驗在Duncan的實驗方法和原理的基礎上稍加改進設計同源重組技術路線（圖9），將外源基因及相關表達原件成功整合到野生型B. subtilis LN基因組中。證明了同源重組技術在野生型B. subtilis基因組上的可行性，同時也確保了目的基因CelKg在宿主細胞內穩定的遺傳。

B. subtilis作為革蘭氏陽性菌，具有完整的表達分泌機制，表達蛋白在胞內合成后，直接分泌到發酵液中，方便對表達產物的收集和分離提純。雖然與傳統的大腸桿菌表達系統相比，B. subtilis表達系統的研究還并不完善，但在分泌蛋白表達活性和蛋白純化方面要明顯優于大腸桿菌[29]。楊韻霏等[30]構建含細菌麥芽糖淀粉酶基因的B. subtilis重組菌，發現重組菌酶活最高為296.64 U/mL。利用相同來源的淀粉酶基因在大腸桿菌表達，淀粉酶活力僅為227.82 U/mL，再次驗證了B. subtilis表達系統相對大腸桿菌表達系統的高效性[31]。張懿翔等[32]在B. subtilis A5中進行透明顫菌血紅蛋白基因vgb的整合表達，通過高密度培養，脫膠酶的表達量提高了29.5%，脫膠效果也明顯改善。本實驗中，B. subtilis表達系統也實現了葡萄糖苷酶基因CelKg的高效表達，重組菌B. subtilis Kpg粗酶液中纖維素酶活力最高為55.22 U/mL，與野生型B. subtilis LN相比其活力提高了115%。除此之外，B. subtilis還具有抗逆性性強、易儲存的優勢，且生長迅速，有較好的發酵基礎和生產技術。作為益生菌運用到飼料中，一方面方便加工保存，提高活菌效果，另一方面能夠發揮B. subtilis對動物腸道健康和免疫能力的改善，提升和改善動物產品品質[33-36]。

本實驗構建的重組菌B. subtilis Kpg，驗證了野生型B. subtilis整合表達的可行性，將來在構建其他酶系的重組菌時，只需將葡萄糖苷酶基因CelKg敲除換成相應的酶基因就可以獲得穩定遺傳的重組B. subtilis，豐富和改善B. subtilis的功能和作用。

[1] CAO J, SUN X W, LU C H, et al. Water-soluble cellulose acetate from waste cotton fabrics and the aqueous processing of allcellulose composites[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 149: 60-67. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.04.086.

[2] KUMAR R, SINGH S, SINGH O V. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2008, 35(5): 377-391. DOI:10.1007/s10295-008-0327-8.

[3] DAS A M, ALI A A, HAZARIKA M P. Synthesis and characterization of cellulose acetate from rice husk: eco-friendly condition[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 112: 342-349. DOI:10.1016/ j.carbpol.2014.06.006.

[4] FERREIRA N L, MARGEOT A, BLANQUET S, et al. Biotechnology and biology trichoderma[M]. Amsterdam: Elsevier, 2014: 245-261.

[5] KUHAD R C, GUPTA R, SINGH A. Microbial cellulases and their industrial applications[J]. Enzyme Research, 2011, 2: 280696. DOI:10.4061/2011/280696.

[6] KUHAD R C, DESWAL D, SHARMA S, et al. Revisiting cellulase production and redefining current strategies based on major challenges[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2016, 55: 249-272. DOI:10.1016/j.rser.2015.10.132.

[7] ZAMBARE V P, BHALLA A, MUTHUKUMARAPPAN K, et al. Bioprocessing of agricultural residues to ethanol utilizing a cellulolytic extremophile[J]. Extremophiles, 2011, 15(5): 611-618. DOI:10.1007/ s00792-011-0391-2.

[8] 鄒立扣, 王紅寧, 潘欣. 枯草芽孢桿菌整合載體研究進展[J]. 生物技術通訊, 2003, 14(6): 525-527. DOI:10.3969/j.issn.1009-0002.2003.06.015.

[9] ASADA M, YAHATA K, HAKIMI H, et al. Transfection of Babesia bovis by double selection with WR99210 and blasticidin-S and its application for functional analysis of thioredoxin peroxidase-1[J]. PLoS ONE, 2015, 10(5): 575-582. DOI:10.1371/journal.pone.0125993.

[10] HELIANTI I, ULFAH M, NURHAYATI N, et al. Production of xylanase by recombinant Bacillus subtilis, DB104 cultivated in agroindustrial waste medium[J]. HAYATI Journal of Biosciences, 2016, 23(3): 125-131. DOI:10.1016/j.hjb.2016.07.002.

[11] 李春艷, 馮鳳兆, 馮露, 等. 野生型枯草芽孢桿菌N4的spizizen轉化法優化[J]. 東北農業大學學報, 2015, 42(2): 78-82. DOI:10.3969/ j.issn.1005-9369.2015.02.012.

[12] 陳靜, 匡成兵. 纖維素降解真菌的分離篩選[J]. 西南大學學報(自然科學版), 2016, 38(8): 22-26. DOI:10.13718/j.cnki.xdzk.2016.08.004.

[13] TEATHER R M, WOOD P J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1982, 43(4): 777-780.

[14] 李青青, 王旭歌, 鐘甲麗, 等. 纖維素酶系基因的克隆與序列分析[J]. 江蘇農業科學, 2016, 44(3): 40-43. DOI:10.15889/ J.ISSN.1002-1302.2016.03.010.

[15] ZHANG X Z, CUI Z L, HONG Q, et al. High-level expression and secretion of methyl parathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(7): 4101-4103. DOI:10.1128/AEM.71.7.4101-4103.2005.

[16] BLOMBACH B, EIKMANNS B J. Current knowledge on isobutanol production with Escherichia coli, Bacillus subtilis and Corynebacterium glutamicum[J]. Bioengineered Bugs, 2011, 2(6): 346-350. DOI:10.4161/bbug.2.6.17845.

[17] 張婷婷, 馬磊. 枯草桿菌啟動子P43及Pamy的轉錄活性[J]. 江蘇農業科學, 2014, 42(12): 56-58. DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2014.12.016.

[18] TRUDEAU D L, SMITH M A, ARNOLD F H. Innovation by homologous recombination[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2013, 17(6): 902-909. DOI:10.1016/j.cbpa.2013.10.007.

[19] 聶宇, 喬艷樂, 陳瑤生, 等. 供體同源臂長度對ZFN介導的同源重組效率的影響[J]. 中山大學學報(自然科學版), 2016, 55(4): 100-107. DOI:10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.04.017.

[20] HASTY P, RIVERA-PéREZ J, BRADLEY A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells[J]. Molecular and Cellular Biology, 1991, 11(11): 5586-5591.

[21] MELNIKOV A, YOUNGMAN P J. Random mutagenesis by recombinational capture of PCR products in Bacillus subtilis and Acinetobacter calcoaceticus[J]. Nucleic Acids Research, 1999, 27(4): 1056-1062.

[22] 胡海紅, 石愛琴, 胡艷華, 等. 枯草芽孢桿菌整合載體的構建及基因組的改造[J]. 浙江理工大學學報, 2010, 27(1): 134-139. DOI:10.3969/j.issn.1673-3851.2010.01.028.

[23] 劉暉. 纖維素酶基因枯草芽孢桿菌工程菌的構建及其酶學性質的初步研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2013: 39-46. DOI:10.7666/ d.Y2394883.

[24] DUNCAN C H, WILSON G A, YOUNG F E. Mechanism of integrating foreign DNA during transformation of Bacillus subtilis[J]. PNAS, 1978, 75(8): 3664-3668.

[25] van PIJKEREN J P, BRITTON R A. High ef ciency recombineering in lactic acid bacteria[J]. Nucleic Acids Research, 2 012, 40(10): e76. DOI:10.1093/nar/gks147.

[26] ARENHART S, JUNIOR S J, FLORES E F, et al. Use of homologous recombination in yeast to create chimeric bovine viral diarrhea virus cDNA clones[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2016, 47(4): 993-999. DOI:10.1016/j.bjm.2016.07.022.

[27] WEN S, YANG J, TAN T. Full-length single-stranded PCR product mediated chromosomal integration in intact Bacillus subtilis[J]. Journal of Microbiological Me thods, 2013, 92(3): 273-277. DOI:10.1016/ j.mimet.2012.11.012.

[28] BARTOSOVA Z, KREJCI L. Nucleases in homologous recombination as targets for cancer therapy[J]. FEBS Letters, 2014, 588(15): 2446-2456. DOI:10.1016/j.febslet.2014.06.010.

[29] 余小霞, 田健, 劉曉青, 等. 枯草芽孢桿菌表達系統及其啟動子研究進展[J]. 生物技術通報, 2015, 31(2): 35-44. DOI:10.13560/j.cnki. biotech.bull.1985.2015.02.005.

[30] 楊韻霏, 李由然, 張梁, 等. 細菌麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的誘導型異源表達[J]. 微生物學通報, 2016, 44(2): 263-273. DOI:10.13344/j.microbiol.china.160102.

[31] 訾楠, 沈微, 石貴陽, 等. 地衣芽孢桿菌生麥芽糖α-淀粉酶的基因克隆與鑒定[J]. 應用與環境生物學報, 2009, 15(1): 130-133. DOI:10.3724/SP.J.1145.2009.00130.

[32] 張懿翔, 丁若垚, 陳婷, 等. 同源重組整合vgb基因提升枯草芽孢桿菌亞麻脫膠能力[J]. 中國麻業科學, 2015, 37(2): 87-94. DOI:10.3969/ j.issn.1671-3532.2015.02.006.

[33] 王敏輝. 飼用纖維素酶的研究進展[J]. 飼料博覽, 2009(11): 27-30. DOI:10.3969/j.issn.1001-0084.2009.11.009.

[34] MIELENZ J R. Ethanol production from biomass: technology and commercialization status[J]. Current Opinion in Microbiology, 2001, 4(3): 324-329. DOI:10.1016/S1369-5274(00)00211-3.

[35] JIA R, MA Q G, FAN Y, et al. The toxic effects of combined a atoxins and zearalenone in naturally contaminated diets on laying performance, egg quality and mycotoxins residues in eggs of layers and the protective effect of Bacillus subtilis biodegradation product[J]. Food and Chemical Toxicology, 2016, 90: 142-150. DOI:10.1016/ j.fct.2016.02.010.

[36] SOBCZAK A, KOZ?OWSKI K. The effect of a probiotic preparation containing Bacillus subtilis ATCC PTA-6737 on egg production and physiological parameters of laying hens[J]. Annals of Animal Science, 2015, 15(3): 711-723. DOI:10.1515/aoas-2015-0040.

Construction of Cellulose Gene Integration Vector of Bacillus subtilis

NIE Libo, WANG Zhanbin, SHI Dunsheng, SONG Yangyang, LI Wang*
(College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Aim: To obtain an engineered bacterial strain able to express cellulose-degrading enzymes through constructing an integration vector using Bacillus subtilis as the host. Methods: The homologous fragments M1 and M2 were cloned by polymerase chain reaction (PCR) from the genome of B. subtilis LN. The glucosidase gene CelKg, homologous fragments M1 and M2 and the strong promoter P43 were ligated to the pGEM-T vector by T4 DNA Ligase to construct the integrated vector pGEM-Kmpgmt. The vector was then transformed to B. subtilis LN by double crossover homologous recombination method. Results: The integration vector was successfully constructed and integrated into the genome of B. subtilis LN, as veri ed by PCR. Congo red staining indicated that the recombinant B. subtilis could obviously degrade sodium carboxymethyl cellulose in the medium. The cellulase activity from the culture supernatant harvested after 18 h culture of the recombinant strain in a modi ed medium at 37 ℃ with shaking was increased by 115% as compared with the wild-type B. subtilis LN.

homologous recombination; cellulase; Bacillus subtilis

10.7506/spkx1002-6630-201710006

Q784

A

1002-6630（2017）10-0031-06

聶利波, 王占彬, 史敦勝, 等. 枯草芽孢桿菌纖維素酶基因整合載體的構建[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 31-36.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710006. http://www.spkx.net.cn NIE Libo, WANG Zhanbin, SHI Dunsheng, et al. Construction of cellulose gene integration vector of Bacillus subtilis[J]. Food Science, 2017, 38(10): 31-36. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710006. http://www.spkx.net.cn

2016-08-25

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101744）；河南省重大科技專項（131100110300）

聶利波（1991—），男，碩士研究生，主要從事動物分子營養研究。E-mail：nielibo1991@163.com

*通信作者：李旺（1976—），男，副教授，博士，主要從事分子營養和飼料生物技術研究。E-mail：liwang@haust.edu.cn