Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變文庫熱穩定性提高突變體的篩選及鑒定

喬超超，王新俠，李鶴賓，倪 輝，肖安風，朱艷冰,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門醫學院藥學系，福建 廈門 361023）

Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變文庫熱穩定性提高突變體的篩選及鑒定

喬超超1，王新俠1，李鶴賓2，倪 輝1，肖安風1，朱艷冰1,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門醫學院藥學系，福建 廈門 361023）

利用易錯聚合酶鏈式反應技術引入隨機誘變，構建一個Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變體庫。經過篩選，獲得一個芳香基硫酸酯酶熱穩定性提高的突變株4-153。序列分析表明，該突變體有2 個氨基酸替換，包括D84A和H260L。以對硝基苯硫酸鉀為底物，突變酶4-153（M4-153）的最適反應溫度為55 ℃，在45、50、55、60 ℃處理30 min后，M4-153分別保留85%、83%、48%和13%的殘留酶活力。野生型酶（WT）在45、50、55、60 ℃處理30 min后，分別保留79%、68%、21%和1%的殘留酶活力。M4-153與WT相比具有更好的熱穩定性。M4-153的最適反應pH值為8.0，在pH 5.0～9.0范圍內保持穩定。EDTA對突變酶的抑制作用表明，金屬離子在突變酶的催化過程中起重要作用。M4-153對一些洗滌劑，包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80和Chaps，有好的耐受性。M4-153對龍須菜粗多糖硫酸基團的脫硫率為79.5%。

芳香基硫酸酯酶；易錯聚合酶鏈式反應；熱穩定性提高；突變體性質

瓊脂是構成紅藻細胞壁的主要結構多糖，由瓊脂糖和硫瓊膠組成[1]。瓊脂糖是由（1-3）-β-D-半乳糖和（1-4）-3,6-內醚-α-L-半乳糖相互交替連接而成的長鏈結構[1]。硫瓊膠的結構與瓊脂糖基本相同，主要差別是替換了半乳糖殘基C6位置上的羥基，以硫酸基、甲氧基等基團進行替代[1]。瓊脂的凝膠過程主要是由糖殘基的相互交聯作用所導致，交聯越緊密，形成的瓊脂凝膠強度就越大，而硫瓊膠上具有的硫酸基等基團會影響分子間的相互交聯作用，使得瓊脂凝膠強度降低[2]，瓊膠產品質量下降。在瓊脂的工業生產中，脫除硫酸基團是很重要的環節，最為廣泛的方法為堿法[3]。國內外常用的堿法可分為3 種類型：低溫濃堿法、常溫濃堿法和高溫稀堿法[4]。這類方法工藝簡單、操作方便，但是由于處理過程中大量強堿的使用，使得該方法有反應難控制、產品得率低、膠質易損失和環境污染嚴重等缺陷。很多研究者開始嘗試探索新的有效方法。芳香基硫酸酯酶能催化芳香基硫酸酯鍵的水解，生成芳基化合物和無機硫酸鹽[5]。芳香基硫酸酯酶具有廣泛的分布性，在真菌[6]、細菌[7]、海膽[8]、海藻[9]、蝸牛[10]、哺乳動物[11]和人體[12]中都有分離得到。其中對一些微生物來源的芳香基硫酸酯酶，這包括從米曲霉[13]、肺炎克雷伯桿菌[14]、肺炎克雷伯菌[15]、海單胞菌[16]、交替假單孢菌[17]、銅綠假單胞菌[7,18]、鼠傷寒沙門氏菌[19]、黏質沙雷氏菌[20]、鞘氨醇單胞菌[21]、鏈霉菌[22]和海棲熱袍菌[23]中得到的芳基硫酸酯酶進行了研究，并發現某些芳香基硫酸酯酶具有可裂解瓊脂上硫酸酯鍵的功能[5,16-17]。利用酶法去除硫酸基團具有反應條件溫和、易控制、硫酸基團脫除率高，環境污染小等優點。芳香基硫酸酯酶在瓊脂提取工業中具有潛在的應用價值[24]。

來自Pseudoalteromonas carrageenovora的芳香基硫酸酯酶對對硝基苯硫酸鉀（potassium 4-nitrophenyl sulfate，p-NPS）有活性，以及有脫除瓊脂硫酸基團的能力[17]。從P. carrageenovora分離得到的芳香基硫酸酯酶基因（984 bp）克隆并在大腸桿菌中表達，發現45 ℃以上重組酶熱穩定性不高。本研究以易錯聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）為基礎定向進化提高該酶的熱穩定性，并研究突變酶的酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E. coli BL21（DE3）、pET-28a質粒由集美大學食品與生物工程學院發酵工程實驗室保藏。

質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、rTaq酶、dNTPs TaKaRa公司；p-NPS 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

雙層全溫度恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；酶標儀 美國BioTek公司；超聲細胞破碎儀 美國Sonics公司；數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；小型高速常溫離心機、蛋白核酸測定儀 德國Eppendorf公司；大型高速冷凍離心機 美國Beckman公司；離子色譜 美國Dionex公司；凝膠成像系統 美國GE公司；數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芳香基硫酸酯酶隨機突變體庫的構建

P. carrageenovora芳香基硫酸酯酶含有信號肽，其長度為18 個氨基酸。在前期研究中，構建了不含信號肽的芳香基硫酸酯酶基因（930 bp）重組質粒pET-28a-ars。隨機突變體庫是基于易錯PCR構建。以重組質粒pET-28aars為模板，使用上游引物ars-F（5’-CGCGGATCCTTT ACGTTTAACGGCAGC-3’）和下游引物ars-R（5’-CCC AAGCTTGCGTTTTAGTTCGTAAC-3’）（劃線部分分別為BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點）對目的基因進行擴增?？偡磻w系為50 μL，其中包含5 μL 10×緩沖液、0.2 μmol/L引物、0.5 mmol/L dTTP、0.5 mmol/L dGTP、0.1 mmol/L dATP、0.1 mmol/L dCTP、1 U rTaq 聚合酶、7 mmol/L MgCl2、2 ng重組質粒模板。熱循環參數為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min（35 次）；72 ℃ 10 min。BamHⅠ和HindⅢ消化后，PCR產物插入pET-28a（+）載體，構建重組質粒突變文庫。質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3），生成突變文庫。

1.3.2 熱穩定性提高突變株的篩選

將文庫的突變子涂布于LB固體培養基（含50 mg/mL卡那霉素和0.05 mmol/mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG），37 ℃過夜培養后，根據產芳香基硫酸酯酶菌株水解底物p-NPS的顯色反應來進行突變文庫的初篩。含有菌株的平板經過50 ℃處理2 h后，用含20 mmol/L p-NPS的軟瓊脂覆蓋，這時野生型菌株無顯色反應，具有顯色反應的菌落認為是熱穩定性提高的突變株。菌株過夜培養后，按1∶100（V/V）轉接到5 mL LB液體培養基（含50 mg/mL卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min培養至OD600nm達到0.6，加入終濃度為0.05 mmol/mL IPTG，25 ℃、180 r/min培養10 h。離心收集菌體，重懸于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）中，在冰浴條件下進行超聲波破碎處理，10 000 r/min離心20 min獲得的上清液即為粗酶液。粗酶液在50 ℃處理2 h后，按下述1.3.5節的方法檢測酶的殘余活力，進行復篩驗證。復篩后得到的熱穩定性提高突變株，送至鉑尚生物技術（上海）有限公司進行基因測序分析。

1.3.3 重組酶的表達與純化

突變型和野生型菌株分別接種至200 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37 ℃搖動培養至OD600nm達到0.5，然后加入IPTG至終濃度為0.05 mmol/L。在25 ℃孵育10 h后，誘導細胞通過6 000 r/min離心5 min收獲。純化帶有His標簽的蛋白質，使用Ni Sepharose 6 Fast Flow在自然條件下進行親和層析。純化后的蛋白用Bradford法測定蛋白質濃度[25]，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析純化的酶，并對其分子質量進行分析。

1.3.4 芳香基硫酸酯酶的活性測定

根據Kim等[17]的方法稍作修改后，測定芳香基硫酸酯酶的活性（文中進行酶學性質分析使用的酶為純化后的酶，除非另有說明）。取80 μL用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（野生型使用pH 7.5，突變體使用pH 8.0）配制的20 mmol/L p-NPS底物溶液，加入20 μL酶液（400 ng），55 ℃孵育10 min后，加入25 μL 5 mol/L NaOH溶液終止反應。在410 nm波長處使用分光光度計測定吸光度。在此條件下，每分鐘催化生成1 μmoL對硝基苯酚所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.5 反應溫度對酶活性的影響

突變酶的最適反應溫度在30～80 ℃的范圍內測定。突變型與野生型酶的熱穩定性在45、50、55、60 ℃下進行。將酶在不同溫度條件下處理30 min后，測定酶的殘余活力，以未經處理的酶活力作為100%。

1.3.6 pH值對突變酶活性的影響

將酶在pH3.0～10.0的緩沖液中于37 ℃放置 1 h后，測定酶的殘余活力。以未經處理的酶活力定義為100%。測定使用的緩沖液為：50 mmol/L 磷酸二氫鈉-檸檬酸（pH 3.0～5.0）、50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.0～7.0），50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0～9.0），50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.0～10.0）。

1.3.7 金屬離子對突變酶活性的影響

在突變酶中分別添加終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L的不同金屬鹽離子，包括NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2、CuCl2、MnCl2、CoCl2和CdCl2。37 ℃條件下放置1 h后，測定酶的殘余活力，研究金屬離子對突變酶活性的影響。以未添加金屬離子的酶活力為100%。

1.3.8 抑制劑和洗滌劑對突變酶活性的影響

在突變型芳香基硫酸酯酶中分別添加終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L的抑制劑（包括乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、β-巰基乙醇（β-mercaptoethano，β-ME）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyluoride，PMSF））、0.1%或1%去垢劑（包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80、Chaps和SDS）。置于37 ℃條件下放置1 h后，測定酶的殘余活力，研究抑制劑和洗滌劑對突變酶活性的影響。以未添加抑制劑或去垢劑的酶活力為100%。

1.3.9 動力學參數的測定

400 ng突變酶與不同濃度（0.1～3.0 mmol/L）p-NPS在最適條件下反應10 min后，測定酶的活力。用Lineweaver-Burk雙倒數作圖，得到線性回歸方程，并分析計算酶的動力學參數米氏常數（Km）和最大反應速率（vmax）。

1.3.10 脫除龍須菜粗多糖硫酸基團的研究

稱取0.1 g龍須菜粗多糖溶解于20 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中。分別加入60 U和90 U的野生型或突變型酶，45 ℃條件下處理4 h。將處理后的混合溶液置于尼龍布上，用超純水充分洗滌后，烘干粉碎。稱取等質量的經過酶處理后與未處理的龍須菜粗多糖，高溫碳化后，置于馬弗爐中550 ℃灰化4 h，將所得灰分全部溶于超純水中，定容至25 mL。取1 mL溶液用0.22 μm的膜過濾后，利用ICS-2100離子色譜測定樣品的硫酸基團含量。以未經酶處理的粗多糖為對照，根據以下公式計算脫硫率：

2 結果與分析

2.1 芳香基硫酸酯酶隨機突變體庫的構建與篩選

芳香基硫酸酯酶基因利用易錯PCR技術引入隨機誘變，庫容量約為2.0×105。經過兩步篩選，發現突變體4-153與野生型相比熱穩定性提高?；蛐蛄蟹治霭l現，野生型與突變型酶基因相比有3 個堿基被替換，導致4-153有2 個氨基酸殘基發生改變，分別為D84A和H260L（野生型和突變型芳香基硫酸酯酶4-153分別命名為WT和M4-153）。突變酶4-153被選定做進一步的酶學性質研究。

2.2 突變型和野生型酶的表達與純化

經過誘導表達后，分別對重組的WT和M4-153進行純化。對純化后的蛋白質進行SDS-PAGE分析顯示，突變后的芳香基硫酸酯酶大小與野生型一致，并測得WT和M4-153的酶活力分別為11.3、7.8 U/mg。

圖 1 芳香基硫酸酯酶在大腸桿菌中的表達Fig. 1 Expression of the arylsulfatase genes in E. coli

2.3 溫度對芳香基硫酸酯酶的影響

圖 2 溫度對M4-153和WT的影響Fig. 2 Effect of temperature on the activity of M4-153 and WT

M4-153的最適溫度在30～80 ℃內進行測定。如圖2所示，M4-153和WT的最適反應溫度為55 ℃，在45～60 ℃溫度范圍內仍可以保持超過80%活性（圖2A）。熱穩定性分析顯示，在45、50、55、60 ℃條件下處理30 min后，M4-153分別保留了85%、83%、48%、13%的殘余活性，而WT在45、50、55、60 ℃處理30 min后，分別保留了79%、68%、21%、1%的殘余活性（圖2B）。以上結果表明，突變酶M4-153比野生型酶WT具有更好的熱穩定性。

2.4 pH值對突變酶活性的影響

芳香基硫酸酯酶M4-153和WT的最適pH值在5.0～10.0的范圍內測定，結果如圖3A所示，M4-153的最適pH值為8.0，WT的最適pH值為7.5。當pH值低于6.5或高于9.5，M4-153和WT的酶活性急劇降低。pH值穩定性實驗結果表明，M4-153在pH 5.0～9.0范圍內保持穩定，在37 ℃放置1 h后仍能保留其原活性的60%以上，而WT在pH 6.0～9.0范圍內保持穩定，在37 ℃放置1 h后仍能保留其原活性的60%以上（圖3B）。

圖 3 pH值對M4-153和WT活性和穩定性的影響Fig. 3 Effect of pH on the activity and stability of M4-153 and WT

2.5 金屬離子對突變酶活性的影響

表 1 金屬離子對突變酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on mutant arylsulfatase activity

由表1可知，K+對突變芳香基硫酸酯酶活力沒有顯著的影響，而Mg2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+會抑制酶的活性，濃度越高抑制越明顯，Zn2+和高濃度的Cu2+會導致酶完全失活。Ca2+對突變酶的活力有一定的促進作用。1 mmol/L的Na+和Mn2+對酶活力沒有影響，而10 mmol/L的Na+、和Mn2+對酶活力具有促進作用。Co2+在1 mmol/L對酶活性有促進作用，當濃度增大到10 mmol/L時會稍微抑制酶活力。

2.6 抑制劑和去垢劑對突變酶活性的影響

表 2 抑制劑和去垢劑對突變酶的影響Table 2 Effects of inhibitors and detergents on mutant arylsulfatase activity

由表2可知，抑制劑EDTA、β-ME和DTT都對酶活力有抑制作用，其中最明顯的是EDTA，使得芳香基硫酸酯酶失去超過70%的酶活力。PMSF對酶活性沒有強烈的抑制效果，在濃度為10 mmol/L時，芳香基硫酸酯酶仍可保留89.7%的相對酶活力。去垢劑SDS和1%的Chaps對酶活力有抑制作用,其中SDS抑制效果顯著，在加入1%的SDS時，芳香基硫酸酯酶失去近70%的酶活力。突變酶對Triton X-100、Tween 20和Tween 80有良好的抗性。

2.7 動力學參數

以p-NPS為底物，用Lineweaver-Burk雙倒數法做圖，計算突變酶的動力學參數。M4-153的Km和vmax值分別為0.73 mmol/L和12.21 μmol/（mg·min）。

2.8 脫除龍須菜粗多糖的硫酸基團

由表3可知，在45 ℃條件下處理4 h的條件下，隨著加酶量的增多，龍須菜粗多糖被脫除的硫酸基團就越多。當加酶量為90 U時，M4-153能脫除79.5%的硫酸基團，而野生型脫除率為76.3%。

表 3 突變型和野生型芳香基硫酸酯酶對龍須菜粗多糖硫酸基團的脫除Table 3 Effects of enzymatic treatment with purified mutant and wide-type arylsulfatases on the desulfuration efficiency of crude polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis

3 討 論

定向進化是一種提高酶熱穩定性、底物特異性等的有效方法?；谝族ePCR的定向進化方法，由于簡單易行而被廣泛應用[26-27]。本研究利用易錯PCR方法構建了一個P. carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變體庫，并篩選得到熱穩定性提高的突變酶M4-153。

瓊脂是典型的熱融性分子，需要加熱以成為液體狀態，它的融解溫度為43 ℃，溫度保持在45 ℃以上時不會形成凝膠。因此，水解瓊脂硫酸基團的酶在45 ℃以上保持穩定才能在工業應用上有良好的前景。本研究中，突變酶的熱穩定性分析結果顯示，酶在高于45 ℃時熱穩定性提高。在相同的條件下，M4-153對龍須菜瓊脂硫酸基團的脫硫率高于WT，并且M4-153在pH 5.0～9.0范圍內保持穩定，這些提高了突變酶的工業應用前景。

EDTA對M4-153的酶活性有較強的抑制效果，這表明金屬離子在酶的催化過程中起主要作用。SDS對酶活力也有著抑制作用，推測是由于SDS與芳香基硫酸酯酶的疏水性氨基酸殘基上的烷基結合并造成影響，來自Marinomonas sp. FW-1的芳香基硫酸酯酶也有著相似的結果[16]。M4-153在一些洗滌劑的存在下仍然保持相對穩定，如Triton X-100、Tween 20、Tween 80和Chaps，這些性質提高了該突變酶在工業利用過程中的潛在價值。

硫酸基含量是瓊脂的一個重要質量標準[28]，芳香基硫酸酯酶是一種可在溫和條件下進行瓊脂脫硫的理想候選酶。本研究中當突變酶M4-153的加酶量達90 U，在45 ℃處理4 h后，龍須菜粗多糖硫酸基含量下降了79.5%，該突變芳香基硫酸酯酶是瓊脂脫硫應用中的潛在催化劑。

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Screening and Characterization of Mutant with Improved Thermostability from a Random Mutant Library of Pseudoalteromonas carrageenovora Arylsulfatase

QIAO Chaochao1, WANG Xinxia1, LI Hebin2, NI Hui1, XIAO Anfeng1, ZHU Yanbing1,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Department of Pharmacy, Xiamen Medical College, Xiamen 361023, China)

A library of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase mutants was constructed by random mutagenesis using error-prone PCR. After screening, one mutant strain named 4-153 was obtained whose arylsulfatase had improved thermal stability. It was found that there were two amino acid substitutions in the mutant, including D84A and H260L. When p-nitrophenyl sulfate was used as a substrate, the optimal reaction temperature for the mutant enzyme was 55 ℃. Mutant arylsulfatase 4-153 (M4-153) retained 85%, 83%, 48%, and 13% of its initial activity after incubation at 45, 50, 55 and 60 ℃for 30 min, respectively. Meanwhile, wild-type arylsulfatase (WT) retained 79%, 68%, 21%, and 1% of its initial activity after incubation at 45, 50, 55 and 60 ℃ for 30 min, respectively. These results showed that M4-153 had a better thermal stability than WT. M4-153 had an optimum pH of 8.0, and it was stable over the pH range of 5.09.0. Inhibition assay with EDTA indicated that metal ions played an important role in the catalytic process of the mutant enzyme. The recombinant arylsulfatase 4-153 showed a relatively strong tolerance to some detected detergents including Triton X-100, Tween 20, Tween 80, and Chaps. The desulfuration ratio of the crude polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis by M4-153 was 79.5%.

arylesterase; error-prone PCR; improved thermostability; mutant property

10.7506/spkx1002-6630-201710004

Q814.9

A

1002-6630（2017）10-0018-06

喬超超, 王新俠, 李鶴賓, 等. Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變文庫熱穩定性提高突變體的篩選及鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 18-23. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710004. http://www.spkx.net.cn

QIAO Chaochao, WANG Xinxia, LI Hebin, et al. Screening and characterization of mutant with improved thermostability from a random mutant library of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase[J]. Food Science, 2017, 38(10): 18-23. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710004. http://www.spkx.net.cn

2016-09-02

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401632）；福建省高校新世紀優秀人才支持計劃項目（B15139）

喬超超（1991—），男，碩士研究生，主要從事食品科學研究。E-mail：451028523@qq.com

*通信作者：朱艷冰（1976—），女，副教授，博士，主要從事食品科學研究。E-mail：yanbingzhu@163.com