共培養體系下不同培養時間對奶山羊乳腺上皮細胞功能基因表達的影響

木合依扎·熱很別克，邵 偉，余 雄

（新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052）

遺傳育種與繁殖

共培養體系下不同培養時間對奶山羊乳腺上皮細胞功能基因表達的影響

木合依扎·熱很別克，邵 偉，余 雄

（新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052）

為提高奶山羊乳腺上皮細胞泌乳功能基因的表達量，采用分離培養至P3代的1月齡健康薩能奶山羊乳腺上皮細胞和骨髓間充質干細胞并按2∶1的接種比例混合培養0、24、48、72、96、120、144和168 h（每個處理設置3個重復）后收集細胞，以QPCR檢測各時間段SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因的表達量，比較不同培養時間對奶山羊乳腺上皮細胞SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因表達量的影響。結果表明：共培養體系下培養時間影響奶山羊乳腺上皮細胞中SREBP、ST T5A 基因的表達量，卻對F BP3A 基因表達量沒有影響。說明共培養體系下奶山羊乳腺上皮細胞與骨髓間充質干細胞混合培養72 h時乳腺上皮細胞泌乳功能基因的表達量最佳。

共培養；乳腺上皮細胞；骨髓間充質干細胞；功能基因

由于乳腺功能的重要性，人們對其整體及細胞功能的研究較早，乳腺細胞的增殖和分化始終貫穿于乳腺發育及泌乳過程，因此，在細胞水平上研究乳腺上皮細胞增殖及分化的調控是非常有意義的［1］。乳腺上皮細胞具有特殊的分泌乳汁的功能，泌乳期大量乳汁的分泌主要是由這些具有分泌活性的乳腺上皮細胞完成［2-4］。乳腺上皮細胞泌乳相關功能基因是奶山羊乳腺上皮細胞中直接影響泌乳性能的基因組，其基因表達是奶山羊乳腺發育狀況的標志。

乳脂和乳蛋白是乳中主要成分，是評估乳及乳產品的感官指標。乳脂由甘油三酯和少量的甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸和視黃醇組成［5］。乳中甘油三酯主要有兩個來源，一是從外周循環血液中吸收的脂肪酸；二是通過乳腺分泌細胞合成。乳中乳蛋白含量受許多因素的影響，如遺傳、生理階段、環境、疾病及飼養方式等［6］，乳腺是一個合成蛋白質十分活躍的場所，乳蛋白的合成僅在乳腺上皮細胞中進行。而乳腺中 FABP3、SREBP、STAT5基因就是調控乳腺上皮細胞乳脂和乳蛋白的關鍵基因。梁夢瑤［7］采用基因過表達和基因沉默技術，驗證了FABP3基因在奶牛乳腺上皮細胞中的功能，發現FABP3基因表達的變化可調控乳脂合成重要調節分子蛋白的表達，證明FABP3具有調控乳脂合成的功能。催乳素入胞后引起轉錄因子STAT5的酪氨酸磷酸化，酪氨酸磷酸化的STAT5再與乳蛋白基因上的結合位點結合。當糖皮質激素和催乳素同時存在時，STAT5和GR兩者結合形成復合物，可增強對靶基因的誘導作用［8］。因此，本研究通過共培養技術不同培養時間檢測奶山羊乳腺上皮細胞SREBP、FABP3、STAT5基因的表達量，從而為確定間充質干細胞與體細胞共培養對乳腺上皮細胞泌乳功能基因表達量的最適時間提供依據。

1 材料

1.1 樣品

從1月齡健康薩能奶山羊的乳腺組織中分離乳腺上皮細胞（BMEC）和骨髓中提取骨髓間充質干細胞（BMSCs），將乳腺上皮細胞（BMEC）和骨髓間充質干細胞（BMSCs）經3代純化培養。

1.2 儀器及試劑

二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、低速離心儀、Benchmark酶標儀、六孔板，SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（takara）；PrimeScriptTMRTMasterMix（PerfectRealTime）（takara）；MX3000P實時熒光定量PCR儀（Stratagene，US）。

1.3 試驗設計

本試驗采用分離培養至P3代的1月齡健康薩能奶山羊乳腺上皮細胞和骨髓間充質干細胞，按2∶1的接種比例混合培養0、24、48、72、96、120、144和168 h（每個處理設置3個重復）后收集細胞，以QPCR檢測各時間段SREBP、STAT5、FABP3基因的表達量，比較不同培養時間對奶山羊乳腺上皮細胞SREBP、STAT5、FABP3基因表達量的影響。

1.4 方法

1.4.1 奶山羊骨髓間充質干細胞（BMSCs）的分離、純化參考解放軍蘭州軍區蘭州總醫院全骨髓法制備大鼠骨髓間充質干細胞方法，無菌采集1月齡雌性薩能奶山羊股骨，剔除肌肉、筋膜、骨膜、軟骨等，用吸有培養液的一次性注射器沖出骨髓。采用percoll密度梯度離心法純化細胞［9］。將分離純化的細胞培養至P3代。

1.4.2 奶山羊乳腺上皮細胞（BMEC）的分離、純化 參考張以濤等［10］的乳腺上皮細胞分離、純化及傳代方法，培養純化至P3代。

1.4.3 奶山羊骨髓間充質干細胞（BMSCs）和乳腺上皮細胞（BMEC）的混合培養 將培養至P3代生長狀態良好的BMEC和BMSCs混合培養，10%FBS、5%CO2、37℃下培養，每48小時換液一次。

1.4.4 不同培養時間乳腺上皮細胞泌乳基因表達量的測定1.4.4.1細胞回收和總RNA的提取檢測 奶山羊乳腺上皮細胞與骨髓間充質干細胞按2∶1的接種比例混合培養至0、24、48、72、96、120、144和168 h時收集細胞，并進行總RNA的提取。用何彥林［11］的細胞收集方法與馬杰等［12］的總RNA的提取方法。之后用全自動酶聯免疫分析儀測出RNA濃度以及OD260/OD280值，檢測其純度。

1.4.4.2 引物合成和實時熒光定量PCR 各基因引物由上海博谷丁生物科技公司合成。SREBP基因引物序列為F（上游引物）：5′-TCTGGAGGCATCGCAAGC-3′，R（下游引物）：5′-GAGGTTCCAGAGGAGGCTACA-3′，產物大小為 149 bp；STAT5基因引物序列為 F（上游引物）：5′-CAGTGGTTTGACGGGGTGA-3′，R（下游引物）：5′-TCCAGGCGATGGTGATGC-3′，產物大小為181bp；FABP3基 因 引 物 序 列 為 F（上 游 引 物）：5′-CTCACCCTAAAAACACACAGCAC-3′，R（下游引物）：5′-GTGAACAAGTTTCCCTCCATCC-3′，產物大小為135bp。

PCR反應條件體系：PCR Master Mix 10μL，上游引物（20 pmol/μL）0.08 μL，下游引物（20 pmol/μL）0.08 μL，cDNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 IU/μL）0.4 μL，ddH2O加至20 μL。

PCR擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性12 s；59℃退火40 s；72℃延伸45 s；重復循環40次。擴增結束后自動分析融解曲線，確定PCR產物的特異性。將各基因的熒光定量PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，進一步驗證擴增片段的特異性和擴增片段長度。

1.5 統計分析方法

熒光定量的數據用△Ct值表示，ΔCt=Ct（目的基因）－Ct（GAPDH）。所得的2-△△Ct值經SPSS18.0中的ANOVA過程進行單因子方差分析。

2 結果與分析

2.1 DNA完整性檢測結果

用1%的瓊脂糖凝膠電泳和全分光光度計檢測提取總RNA模板。如圖1所示，試驗提取的基因組DNA模板質量良好、純度高、不需要純化，可直接用作模板DNA。

2.2 乳腺上皮細胞SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因QPCR產物特異性

熔解曲線如圖2～4所示，PCR產物均為單一峰，梯度模板熔解曲線十分集中，擴增曲線均已光滑。說明沒有引物二聚體并擴增產物特異。

圖1 DNA完整性檢測結果

圖2 FABP3基因擴增曲線與溶解曲線

圖3 SREBP基因擴增曲線與溶解曲線

圖4 STAT5基因擴增曲線與溶解曲線

2.3 共培養體系下不同培養時間BMEC泌乳功能基因表達量的比較

由表1可見，乳腺上皮細胞與骨髓間充質干細胞混合培養體系下不同培養時間乳腺上皮細胞SREBP基因與ST T5A 基因表達量差異顯著（P＜0.05），混合培養體系下乳腺上皮細胞SREBP基因表達量在24～96 h時顯著高于其他時間段（P＜0.05），其中72 h時的表達量最高，96 h開始表達量隨著時間的延長而下降；乳腺上皮細胞STAT5基因表達量在72～120 h時顯著高于24～48 h時的表達量（P＜0.05），其中72 h時的表達量最高；而不同培養時間F BP3A 基因的表達量差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 混合培養體系下不同的培養時間對BMEC功能基因表達量的影響

3 討論

本試驗結果表明，在不同培養時間條件下奶山羊乳腺上皮細胞與骨髓間充質干細胞混合培養時，乳腺上皮細胞SREBP基因與ST T5A 基因表達量在72 h時與其他時間段存在顯著差異（P＜0.05），而F BP3A 基因表達量在不同時間點均差異不顯著（P＞0.05）。通過3種基因表達量圖分析，當共培養72 h時SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因表達量均最高?？赡艿脑蚴枪撬栝g充質干細胞適應共培養環境并開始旁分泌等功能的激活需要一段時間，當共培養72 h時細胞生長旺盛，分泌的細胞因子較多，使調控通路得到實現，細胞表面的受體從而與周圍的環境更加有效作用，為細胞因子的調控提供了條件。細胞的形態形成與其功能性是密切相關的，在共培養體系下觀察兩種細胞的形態觀察結果也發現，混合培養72 h時兩種細胞形態更接近于細胞最佳形態，因此基因的表達量得到最佳狀態。而72 h后細胞也慢慢開始進入凋亡時期，骨髓間充質干細胞的功能開始表現降低，細胞的腺泡結構不再完整，除此之外，共培養72 h之后共培養細胞的密度也越來越高，不利于細胞的增殖、分化，所以共培養72h時乳腺上皮細胞泌乳功能基因的表達量最高。本試驗中乳腺上皮細胞與骨髓間充質干細胞混合培養不同的時間，對乳腺上皮細胞F BP3A 基因表達量無顯著影響，是因為骨髓間充質干細胞分泌的細胞因子能抑制F BP3A 基因表達量，使其表達量不顯著（P＞0.05）。

王立文等［13］在奶牛乳腺上皮細胞與臍帶間充質干細胞共培養的試驗研究中表明，奶牛乳腺上皮細胞與臍帶間充質干細胞共培養至72 h時目的細胞的增殖、分化等最佳。顧勁揚［14］在骨髓間充質干細胞與肝細胞共培養研究試驗中提出，肝細胞與骨髓間充質干細胞2∶1組成的最適共培養體系培養至第2天時有望為今后BAL的構建提供理想細胞材料。這些研究結果與本試驗結果相符，所以奶山羊乳腺上皮細胞與骨髓間充質干細胞混合培養至72 h時乳腺上皮細胞泌乳功能基因的表達量為最佳。

4 小結

共培養體系下培養時間影響BMEC中SREBP、STAT5基因的表達量，卻對FABP3基因的表達量沒有影響。表明共培養體系下奶山羊BMEC與BMSCs混合培養72 h時乳腺上皮細胞泌乳功能基因的表達量最佳。

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Effects of Different Culture Time on Gene Expression of Mammary Gland Epithelial Cell in Dairy Goat under Co-culture System

Muheyizha·Rehenbieke，ShaoWei，Yu Xiong
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

In order toimprove the expression oflactation genes in mammarygland epithelial cells ofdairygoats,the mammarygland epithelial cells and bone marrowmesenchymal stemcells were cultured in a ratio2∶1，the expression ofSREBP，ST T5A and F BP3A were detected byQPCR at 24，48，72，96，120，144，168 h（three replicates per treatment）.The results showed that the culture time of co-culture system affected the expression of SREBP and ST T5A gene in dairy goat mammary gland epithelial cells，but had no effectonF BP3A geneexpression.Accordingtotheresults，theexpressionoflactationgeneinmammaryglandepithelialcellsafter72h ofmixedculturewasthebest.

co-culture；mammaryepithelialcell；mesenchymalstemcell；functionalgene

S827.2

A

2095-3887（2017）03-0001-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.001

2017-03-24

新疆維吾爾自治區重點實驗室開放課題（2015KL018）；2015年國家自然基金（31560645）；農業部現代奶產業體系（cars-37）；中國博士后基金委資助作者簡介：木合依扎·熱很別克(1991-)，女，碩士研究生。

余雄，教授，博士生導師，主要從事動物營養與飼料的教學與研究工作。