產氣莢膜梭菌α蛋白的高效可溶性表達與基因工程亞單位疫苗的制備

孫 雨，楊 林，王傳彬，董 浩，楊天意，宋曉暉

（中國動物疫病預防控制中心，北京 102600）

疾病防控

產氣莢膜梭菌α蛋白的高效可溶性表達與基因工程亞單位疫苗的制備

孫 雨，楊 林，王傳彬，董 浩，楊天意，宋曉暉

（中國動物疫病預防控制中心，北京 102600）

通過優化α蛋白的密碼子、去除蛋白信號肽、選擇親水性與抗原性較好的序列、優化表達條件等方法，在大腸桿菌表達系統中獲得了高效表達的產氣莢膜梭菌可溶性重組α蛋白，用該蛋白免疫小鼠，再用間接ELISA方法測定血清抗體水平。結果表明：針對A型、B型、C型和D型產氣莢膜梭菌的保護率分別為100%、90%、85%和90%，小鼠三免后7～14 d抗體效價達到峰值。該研究表達的α蛋白具有較好的免疫原性，可進一步用于研制預防產氣莢膜梭菌的基因工程亞單位疫苗。

產氣莢膜梭菌；α蛋白；可溶性表達與純化；基因工程亞單位疫苗

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是臨床上氣性壞疽病原菌中最多見的一種梭菌，因能分解肌肉和結締組織中的糖，產生大量氣體，導致組織嚴重氣腫，繼而影響血液供應，造成動物機體組織大面積壞死，加之本菌在體內能形成莢膜，故名產氣莢膜梭菌［1］。反芻動物的氣性壞疽、腸毒血癥、出血性腸炎、牛羊猝死癥、羔羊痢疾均由產氣莢膜梭菌引起［2］。α毒素是產氣莢膜梭菌所有毒素基因中最重要的一種外毒素，A、B、C、D、E等5個型的細菌均可產生該毒素［3-5］。編碼α毒素的基因plc位于染色體上，大小為1 194 bp，可以編碼398個氨基酸，分子量為42.5 ku，其中成熟肽和信號肽分別由370個氨基酸和28個氨基酸組成。目前國內外學者對α毒素基因的功能及其致病機理研究較多。α毒素的致病機理就是依靠鞘磷脂酶和磷脂酶C兩種酶活性，將細胞膜的膜磷脂進行水解，從而破壞細胞膜結構，導致細胞快速裂解死亡，同時該毒素對胰酶敏感，接觸后容易喪失活性［6-8］。α毒素基因相對保守，雖然不同菌株之間平均有1.3%的核苷酸以及1.2%的氨基酸序列不同，但這些核苷酸與編碼氨基酸的不同并不影響α毒素本身的活性［9-12］。α毒素基因的啟動子能被大腸桿菌的RNA聚合酶所識別，因而α毒素在自身啟動子下不僅可在產氣莢膜梭菌本身高效表達，也可在大腸桿菌中得到高效表達。筆者等嘗試在大腸桿菌表達系統中表達產氣莢膜梭菌可溶性重組α蛋白，并用其制備預防產氣莢膜梭菌的基因工程亞單位疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

載體：pET30a融合表達載體購自Novagen公司；感受態細胞：BL21（DE3）感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；酶和試劑：限制性內切酶BamHⅠ及XhoⅠ、T4DNA連接酶、2000 DNA Marker、SDS、IPTG、Taq PCR Master Mix均購自寶生物（大連）工程有限公司；瓊脂糖、DNA Extraction Kit、DNA快速純化回收試劑盒、質?？焖偬崛≡噭┖芯徸员本┤浇鹕锛夹g有限公司；預染蛋白Marker購自Fermentas公司；蛋白純化柱（鎳柱5 mL）、分子篩（Superdex2000）購自GE公司；HRP標記羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑與不完全佐劑購自Sigma公司?；蚝铣桑喝诤系鞍啄康幕蛐虻暮铣捎扇A大基因生物科技有限公司完成。菌株：A型產氣莢膜梭菌C57-10、B型產氣莢膜梭菌C58-5、C型產氣莢膜梭菌C59-4、D型產氣莢膜梭菌C60-11均購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 方法

1.2.1 α重組基因的合成與引物設計 通過去除蛋白信號肽、優化密碼子序列設計了α重組基因。根據α重組基因的序列設計1對引物，并分別在引物5’端添加BamHⅠ和3’端添加XhoⅠ酶切位點，用于目的片段的擴增（下劃線部分為酶切位點）。

上游引物F：5’-GGATCCATGTTTTGGGACCCGGACACCGAC-3’

下游引物R：5’-CTCGAGTTATTTGATGTTATAGGTGCTGT-3’

1.2.2 高效可溶性融合表達載體pET30a-α的構建及鑒定 將pET30a載體進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切體系為40 μL：10×酶切緩沖液4 μL，BamHⅠ和XhoⅠ各1 μL，載體24 μL，去離子水8 μL，酶切產物經過1%瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收。然后將酶切好的載體與擴增后的α編碼基因序列進行連接，構建10 μL的連接體系。其中，α編碼基因片段5.5 μL，pET30a載體1.5 μL，T4DNA連接酶1 μL，T4DNA連接緩沖液2 μL。輕敲管壁，上下顛倒混勻之后瞬離，放22℃連接儀中連接4h。將重組質粒進行雙酶切鑒定及測序分析，將測序鑒定為陽性的質粒命名為pET30a-α。

1.2.3 連接產物的轉化 將pET30a-α連接產物轉化進BL21（DE3）細胞中。無菌條件下，取適量BL21菌液加到LB（Kan+）固體培養基平板上，將菌液涂布均勻，待菌液完全吸收后，做好標記，倒置于37℃恒溫培養箱中，靜置培養16 h。挑取單克隆菌落分別進行菌液鑒定、酶切鑒定、菌液測序，確定α片段轉化進pET30a載體中。

1.2.4 重組蛋白可溶性誘導表達條件的建立 將上述鑒定的重組表達質粒轉化至感受態菌E.coll BL21（DE3）中，挑取陽性克隆，37℃培養過夜。將菌液以1∶100接種于含卡那霉素（50 μg/mL）的液體LB培養基中，于37℃、200 r/min培養至OD值為0.4～0.6時，取出l mL未誘導的菌液作為對照，其余液體中加入異丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）誘導蛋白的表達。經過對溫度、時間、IPTG濃度等條件進行優化，最終確定蛋白高效可溶性誘導表達條件為：0.75 mmol/L的IPTG濃度，過夜誘導13 h大量表達后，于4℃、8 000 r/min離心30 min收集菌體。經高壓大規模破碎菌體后，于4℃、16 000 r/min離心30 min收集上清。

1.2.5 重組蛋白表達形式的分析 取IPTG誘導表達13 h后的菌液用于蛋白表達形式分析。取1 mL誘導后的重組菌液置于1.5 mL離心管中，做好標記，4℃、8 000 r/min離心30 min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入1 mL PBS重懸沉淀，8 000 r/min離心5 min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200 μL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠。于4℃離心機中16 000 r/min離心30 min，將上清轉移至新的1.5 mL離心管中，向剩余的沉淀中加入50 μL PBS重懸沉淀。向上清和沉淀中加入10 μL 5× SDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸水浴中煮沸5 min，待樣品冷卻后，用掌式離心機瞬離。取10 μL用于SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 可溶性重組蛋白的AKTA系統高效純化 菌液高壓破菌后，于4℃、16 000 r/min離心30 min，棄沉淀，上清用 0.22 μm濾膜過濾，后上樣至預先用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl的溶液（pH值8.0）平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機上，分別用10個柱體積的20mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl的溶液（pH值8.0）與20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑的溶液（pH值8.0）清洗鎳柱中的雜質蛋白，并在AKTA機上監測蛋白峰。用 20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑的溶液（pH值8.0）沖洗鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現目的蛋白峰的洗脫樣品。

1.2.7 重組蛋白表達的鑒定 將純化后的蛋白進行SDSPAGE電泳，并轉移至NC膜上，用10%的BSA進行封閉，以產氣莢膜梭菌陽性血清為一抗，兔抗鼠IgG－HRP（1∶20 000）為二抗，通過western－blot方法鑒定蛋白的特異性。

1.2.8 抗產氣莢膜梭菌疫苗的制備 將使用分子篩純化的α蛋白用無菌PBS溶解，得到濃度為1 000 μg/mL的α溶液，脫毒后用于免疫。將α溶液與弗氏佐劑按1∶1等體積混合，乳化制備油乳劑疫苗，將其命名為首免疫苗。將α溶液與不完全弗氏佐劑按1∶1等體積混合，乳化制備油乳劑疫苗并脫毒，將其命名為二免疫苗。

1.2.9 細菌對小鼠最小致死量的測定 取體重在18～22 g之間的雌性小鼠100只，隨機將其分成4組（A組、B組、C組和D組），每組各25只。將每組再隨機分成5個小組，每個小組各5只小鼠，第1小組腹腔注射濃度為1×1010CFU/mL的菌液1 mL，第2小組注射0.8 mL，第3小組注射0.6 mL，第4小組注射0.4 mL，第5小組注射0.2 mL，并設10只PBS對照組。A組接種A型產氣莢膜梭菌（C57－10）菌液，B組接種B型產氣莢膜梭菌（C58－5）菌液，C組接種C型產氣莢膜梭菌（C59－4）菌液，D組接種D型產氣莢膜梭菌C60－1株菌液。于接種后一周內觀察并記錄小鼠的存活情況。

1.2.10 產氣莢膜梭菌攻毒試驗 將80只體重在18～22 g的雌性昆明小鼠隨機分成4組（攻毒劑量組20只，并另設20只小鼠的PBS對照組）。攻毒劑量組，首次免疫、第2次免疫與第3次免疫均采用皮下注射的方法，首次免疫用首免疫苗，第2次免疫與第3次免疫用二免疫苗，每次免疫劑量均為每只0.2 mL（重組蛋白免疫劑量為每只100 μg）；PBS對照組中的每只小鼠首次免疫、第2次免疫與第3次免疫均皮下注射0.2 mL PBS。首次免疫之前，先對小鼠進行一次割尾采血，分離血清，用作陰性對照血清。首次免疫后，間隔14 d進行第2次免疫，二免后14 d進行第3次免疫。第3次免疫2周后每只攻毒劑量組小鼠和每只PBS對照組小鼠腹腔注射各型產氣莢膜梭菌。根據1.2.9中確定的細菌最小致死量進行攻毒，具體的攻毒劑量為A型產氣莢膜梭菌（編號：C57－10）1.5× 109CFU、B型產氣莢膜梭菌（編號：C58－5）為2×109CFU、C型產氣莢膜梭菌（編號：C59－4）為1.5×108CFU、D型產氣莢膜梭菌（編號：C60－1）為1.8×109CFU。

1.2.11 疫苗免疫后小鼠體內抗體水平消長規律研究 對5只注射疫苗的對照組小鼠進行體內抗體水平消長規律檢測，自一免后開始每周采血一次，分離血清，于－80℃冰箱保存，采用間接ELISA方法檢測免疫動物抗體水平。具體步驟：用分子篩純化的α蛋白包被ELISA板，采用棋盤方陣滴定法確定蛋白最適包被濃度和最佳血清稀釋度，以不同濃度的BSA封閉酶標板確定最佳封閉液濃度，優化酶標二抗工作濃度、反應時間等條件，陽性血清與陰性血清的OD450比值（P/N）最大的孔所對應的反應條件為ELISA方法的最佳反應條件。按照上述間接ELISA方法檢測試驗小鼠初次免疫后0～12周的小鼠血清中抗體效價水平。

2 結果

2.1 重組質粒的鑒定

使用BamHⅠ和XhoⅠ內切酶對重組質粒pET30a－α進行雙酶切鑒定，結果（見圖1）表明，酶切產物于924 bp處出現一條明顯的條帶，說明目的片段成功克隆至pET30a載體中。

圖1 重組質粒的酶切鑒定圖譜

2.2 誘導表達產物的鑒定與表達形式分析

將誘導后的菌體制樣后進行SDS-PAGE電泳，結果表明在41 kD處出現一條明顯的條帶，與預期結果相符，表明成功獲得重組蛋白pET30a-α（見圖2）。將重組蛋白α與產氣莢膜梭菌陽性血清反應，結果顯示該重組蛋白可被產氣莢膜梭菌陽性血清所識別，具有良好的免疫反應性（見圖3）。通過SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達形式，結果融合蛋白均為可溶性表達。本實驗應用pET30a構建的pET30a-α載體，經過可溶性誘導表達條件的不斷優化，表達的可溶性重組蛋白占總蛋白的比例非常高。通過NanoDrop 2000超微量分光光度計（ND 2000）對得到的蛋白純度進行定量分析，并結合蛋白灰度分析軟件分析蛋白含量，結果表明，大部分α融合蛋白以可溶性的形式存在于細菌破碎菌體的上清液中，可溶性蛋白目的條帶表達明顯，上清液中雜質較少（見圖2）。

圖2 純化的目的蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜

圖3 蛋白的Western-blotting鑒定

2.3 可溶性蛋白的AKTA系統高效純化

將鎳柱接入AKTA系統，分別用10個柱體積的20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl的溶液（pH值8.0）與20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑的溶液（pH值8.0）清洗鎳柱中的雜質蛋白，并在AKTA機器上監測蛋白峰。用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑的溶液（pH值8.0）沖洗鎳柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現目的蛋白峰的洗脫樣品。通過紫外吸收可以發現，目的蛋白峰與雜質峰能夠有效分離。使用分子篩對獲得的目的蛋白進一步純化，可得到純度更高的目的蛋白，并發現該重組蛋白的結構為單體結構（見圖4）。

圖4 重組蛋白α-his的AKTA系統純化鑒定結果

2.4 產氣莢膜梭菌攻毒試驗結果

攻毒劑量組（免疫α-his）對各型產氣莢膜梭菌的攻擊均具有一定的免疫保護效果。攻毒劑量組（免疫α-his）抗A型產氣莢膜梭菌攻擊7 d內的免疫保護率為100%（20只全部存活），PBS對照組小鼠全部死亡；攻毒劑量組（免疫α-his）抗B型產氣莢膜梭菌攻擊的免疫保護率為 90%（18只存活，2只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡；攻毒劑量組（免疫α-his）抗C型產氣莢膜梭菌攻擊的免疫保護率為 85%（17只存活，3只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡；攻毒劑量組（免疫α-his）抗D型產氣莢膜梭菌攻擊的免疫保護率為90%（18只存活，2只死亡），而PBS對照組小鼠全部死亡。詳見圖5。

2.5 疫苗免疫后小鼠體內抗體水平消長規律

將純化后的α蛋白作為診斷抗原包被酶標板檢測小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗體，發現α蛋白作為診斷抗原建立的檢測方法均具有非常好的靈敏性與特異性。結果如表1所示，α蛋白質量濃度為5 μg/mL、血清稀釋倍數為1∶200時，P/N值最大（P/N值≥2.1時樣品判為陽性），因此確定抗原的最佳包被濃度為5 μg/mL，血清稀釋倍數為1∶200。同時本實驗確定HRP標記的羊抗鼠IgG按1∶20 000的比例稀釋、37℃作用1 h、加入TMB顯色液8 min后OD450值最佳。分別檢測各實驗組中小鼠首免后0～12周的血清中抗體效價水平，結果表明，α融合毒素蛋白免疫組抗體效價有明顯升高，在二免后抗體效價快速上升，小鼠三免后7～14 d抗體效價達到峰值。詳見圖6。

表1 ELISA檢測方法的反應條件優化結果

圖6 小鼠免疫血清抗體消長曲線

3 討論

產氣莢膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，種類多達13種，其中α毒素是最主要的外毒素，根據產生外毒素的種類不同，可將產氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E五個主要血清型。產氣莢膜梭菌的α毒素導致的動物傳染病是當前動物疫病防控工作的主要難題之一。傳統疫苗在治療和預防動物產氣莢膜梭菌疾病方面雖然取得了一定的效果。但這些疫苗易引起動物局部炎癥以及毒性反應等。研發能表達α外毒素抗原蛋白，并且不破壞α外毒素抗原蛋白的免疫原性，對產氣莢膜梭菌α外毒素引起的疫病起到防控作用的基因工程疫苗是急需解決的技術難題［13-16］。

α毒素是5種類型產氣莢膜梭菌共有的毒素，也是A型產氣莢膜梭菌的主要毒素，因其具有強啟動子，所以該毒素不僅可在產氣莢膜梭菌本身中高效表達，也可在大腸桿菌中得到高效表達。此外，也可將其置于其他啟動子下，轉化大腸桿菌后獲得高效表達。這一點十分有利于α毒素作為基因工程疫苗的研究［17］。林明輝等［18］在成功構建重組高效表達工程菌株pBV220cpa408的基礎上，實現了α基因在大腸桿菌中的部分可溶性表達，表達量達43.75%，用純化可溶性蛋白免疫昆明小鼠，被免疫小鼠獲得了較高的保護。許崇波等［19］克隆了第68位氨基酸殘基后面的α毒素基因片段，并將其置于T7啟動子下，轉化入BL21（DE3）中表達。結果α毒素基因得到高效表達，其表達產物喪失了α毒素本身的活性，經IPTG誘導后，其表達量占菌體總蛋白的33.21%，而且保留了α毒素絕大部分的免疫原性。Zeng等［14］構建了產氣莢膜梭菌α蛋白，并獲得了一定的免疫保護性。Bai等［20］將產氣莢膜梭菌α基因進行重組表達，表達產物具有良好的免疫原性。李娜［21］對羊源產氣莢膜梭菌進行了分離鑒定并對α毒素的原核表達和免疫原性做了研究，并設計針對a毒素成熟肽序列的引物，采用PCR方法擴增α毒素成熟肽序列，將其插入質粒pET-28b構建重組表達載體pET-28b-cpa，用重組蛋白制備亞單位疫苗免疫小鼠，結果表明，重組α毒素可以刺激產生抗α毒素抗體免疫應答反應，免疫抗體在免疫后28 d達到最高水平（1∶6 400），并能夠對免疫小鼠提供一定的免疫保護作用。但是該重組質粒表達出的蛋白為部分可溶性蛋白，可溶性蛋白表達量占菌體可溶性蛋白的34.6%。

現有技術中對產氣莢膜梭菌主要外毒素蛋白的表達與純化方法相對復雜，表達產物通常以不溶性的包涵體形式存在，可溶性蛋白表達的報道在國內外非常少。因為包涵體中的表達產物不具有生物學活性，因而需要進行變性與復性處理。蛋白的變性與復性是一個極其復雜的過程，不同蛋白的復性條件各異，復性率往往很難提高。這是限制其應用的主要制約因素。采用可溶性表達方式可克服這一問題。構建可溶性表達載體并優化可溶性蛋白的高效表達方法，是本領域長期以來一直研究的熱點課題。

本研究通過優化密碼子、切除蛋白信號肽、優化表達條件等多個環節進行反復探索，成功地在大腸桿菌中獲得了可溶性高表達抗原。大腸桿菌表達水平高，生產成本低，利用大腸桿菌獲得高表達的活性蛋白，為進一步開發基因工程亞單位疫苗奠定了良好的基礎。本研究以高效表達的α重組蛋白為基礎，研制出了抑制產氣莢膜梭菌感染的融合蛋白疫苗。該疫苗免疫動物后可使動物產生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產氣莢膜梭菌的攻擊。該疫苗在抵抗A型、B型、C型和D型產氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護率分別為100%、90%、85%和90%，最高抗體效價可達1∶128 000。綜上所述，該研究構建的α重組蛋白可以作為預防動物產氣莢膜梭菌感染疫苗研究的方向，為下一步研制產氣莢膜梭菌毒素基因工程亞單位疫苗奠定了基礎，該重組菌株有望作為產氣莢膜梭菌基因工程疫苗的候選生產菌株。

［1］ 田克恭.人與動物共患?。跰］.北京:中國農業出版社，2013.

［2］ Mueller-Spitz S R，Stewart L B，Klump J V，et al.Freshwater suspended sediments and sewage are reservoirs for enterotoxin-positive Clostridium perfringens［J］.Applied and Environmental Microbiology, 2010，76（16）:5556-5562.

［3］ Lebrun M，Mainil J G，Linden A.Cattle enterotoxaemia and Clostridium perfringens:description，diagnosis and prophylaxis［J］.Veterinary Record:Journal of the British Veterinary Association，2010，167（1）: 13-22.

［4］ Glenn Songer J，Miskimins D W.Clostridial abomasitis in calves:Case report and review of the literature ［J］.Anaerobe，2005，11（5）: 290-294.

［5］ 張紅英，楊霞，盧中華.魏氏梭菌腸毒素研究進展［J］.中國畜牧獸醫，2004，9（1）:83-85.

［6］ MorrisWE.ToxinsofClostridium perfringens［J］.RevistaArgentinade Microbiologia，2009，41（4）:251-260.

［7］ Ewoldt J M，Anderson D E.Determination of the effect of single abomasal or jejunal inoculation of Clostridium perfringens type A in dairy cows［J］.The Canadian VeterinaryJournal，2005，46（9）:821-824.

［8］ Kalender H，Kilic A，Atil E.Enterotoxemia in a cowdue to Clostridium perfringens type A［J］.Turkish Journal ofVeterinaryand Animal Sciences，2009，31（1）:83-84.

［9］ Lebrun M.The expression ofClostridium perfringens consensus beta-2 toxin is associated with bovine enterotoxemia syndrome［J］.Vet Microbiol，2007，120:151-157.

［10］ Wang G，Zhou J，Zheng F，et al.Detection of different genotypes of Clostridium perfringens in feces of healthy dairy cattle from China using real-time duplex PCR assay［J］.Pakistan Veterinary Journal， 2011，31（2）:120-124.

［11］ Savic B，Prodanovic R，Ivetic V，et al.Enteritis associated with Clostridium perfringens type A in 9 month old calves［J］.The Canadian VeterinaryJournal，2012，53（2）:174.

［12］ Muylaert A，Lebrun M，Duprez J N，et al.Enterotoxaemia-like syndrome and Clostridium perfringens in veal calves［J］.Veterinary record:Journal of the British Veterinary Association，2010，167（2）: 64-65.

［13］Pilehchian Langroudi R，Shamsara M，Aghaiypour K.Expression of Clostridium perfringens epsilon-beta fusion toxin gene in E.coli and its immunologic studies in mouse［J］.Vaccine，2013，31（32）: 3295-3299.

［14］Zeng J，Deng G，Wang J，et al.Potential protective immunogenicity of recombinant Clostridium perfringens α-α-β1fusion toxin in mice，sows and cows［J］.Vaccine，2011，29（33）:5459-5466.

［15］Miyamoto K，Li J，Sayeed S，et al.Sequencing and diversity analyses reveal extensive similarities between some epsilon-toxin-encoding plasmids and the CPF5603 Clostridium perfringens enterotoxin plasmid［J］.Journal ofBacteriology，2008，190（21）:7178-7188.

［16］Chandran D，Naidu SS，Sugumar P，et al.Development ofa recombinant epsilon toxoid vaccine against enterotoxemia and its use as a combination vaccine with live attenuated sheep pox virus against enterotoxemia and sheep pox［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2010，17（6）:1013-1016.

［17］LobatoF C F，Lima C G，Assis R A，et al.Potency against enterotoxemia of a recombinant Clostridium perfringens type D epsilon toxoid in ruminants［J］.Vaccine，2010，28（38）:6125-6127.

［18］林明輝，蔭俊，邢洪光，等.重組A型產氣莢膜梭菌毒素保護性抗原的制備及初步免疫保護作用研究［J］.生物工程學報，2004，20（1）:63-65.

［19］許崇波，朱平，姚湘燕，等.A型產氣莢膜梭菌α毒素保護性抗原基因的高效表達［J］.衛生研究，1998，27（S1）：49-52.

［20］Bai J N，Zhang Y，Zhao B H.Cloning of alpha-beta fusion gene from Clostridium perfringens and its expression［J］.World Journal of Gastroenterology，2006，12（8）:1229-1234.

［21］李娜.羊源產氣莢膜梭菌的分離鑒定與α毒素的原核表達和免疫原性研究［D］.新疆石河子：石河子大學，2013.

Efficient and Soluble Expression of α Protein of Clostridium perfringens and the Preparation of Genetic Engineering Subunit Vaccine

Sun Yu，YangLin，SongXiaohui，et al
（China Animal Disease Control Center，Beijing102600，China）

According to optimization of codon，removal of the signal peptide，selection on better hydrophilicity and antigenic sequences，and optimization of the expression conditions in this study，the soluble α fusion protein was obtained in Escherichia coli expression system.The results showed that the serum antibody level increased obviously after immuning，and it could resist the attack of Clostridium perfringens.The vaccine could resist the attack of type A，B，C and D of Clostridium perfringens，and the immune protection rate in mouse were 100%，90%，85%and 90%，respectively.After the third immune，the antibody titer in mice reached a peak at 7 to 14 days.The vaccine can be used to control the disease caused by Clostridium perfringens infection，and it has a good application prospect.

Clostridium perfringens；α protein；soluble expression and purification；genetic engineeringsubunit vaccine

S851

A

2095-3887（2017）03-0040-06

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.011

2017-04-01

十三五國家重點研發計劃（2016YFD0500901）

孫雨（1983－），男，獸醫師，博士，主要從事人畜共患病預防控制研究。

宋曉暉（1978－），女，高級獸醫師，博士，主要從事草食動物與人畜共患病預防控制研究。