常瑞剛,劉麗霞
(西北民族大學生命科學與工程學院,蘭州 730030)
溫度對基因組DNA提取的影響
常瑞剛,劉麗霞
(西北民族大學生命科學與工程學院,蘭州 730030)
為了探討溫度對基因組DNA提取質量的影響,以荷斯坦牛血液為實驗材料,采用DNA提取試劑盒法在4℃和常溫下提取牛血液DNA。結果表明:在4℃下提取的DNA質量要明顯高于常溫下所提取的。該研究對于提高DNA提取質量具有一定的參考價值。
溫度;質量;DNA提取
隨著分子生物學技術的快速發展,在動物遺傳育種 研究以及基因工程等分子水平的操作均需從生物體中提取基因組DNA。提取基因組DNA的方法種類繁多,目前主要分成兩種,一是經典的酚-氯仿抽提法,二是試劑盒法。酚-氯仿抽提法價格便宜,但操作繁瑣,而且獲得基因組DNA質量欠佳;試劑盒法的優點是簡便、快捷,且DNA提取效率較高[1]。目前試劑盒法應用十分廣泛,在提取基因組DNA的過程中,DNA的質量受多種因素的影響,提取的DNA質量會影響后續實驗結果的可靠性,其中溫度是影響其質量的一個重要因素。因此,本實驗采用DNA提取試劑盒法在4℃和常溫下提取牛血液DNA,旨在探討溫度對DNA提取質量的影響。
1.1 材料
1.1.1 實驗樣本 本實驗以寧夏賀蘭山奶業有限公司同一奶牛場荷斯坦牛為實驗動物。用醫用采血管經尾靜脈采血10 mL,-20℃凍存備用。
1.1.2 實驗設備 自動平衡離心機Labofuge 200和高速冷凍離心機D-37520(德國Eppendorf公司),低溫冰箱MDF-U541(日本SANYO電子有限公司),凝膠數字成像系統BiO-BEST 140E(美國西蒙子公司)等。
1.2 方法
采用DNA試劑盒法分別在4℃和常溫條件下提取牛血液DNA,操作步驟如下。
(1)取牛血液20 μL,不足200 μL可加緩沖液GA補足。
(2)加入20 μL蛋白酶K溶液,混勻。
(3)加入200 μL緩沖液GB,充分顛倒混勻,70℃放置10 min,溶液應變清亮,簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
(4)加入200 μL無水乙醇,充分振蕩混勻15 s,此時可能會出現絮狀沉淀,簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12 000 r/min離心30 s,倒掉廢液,將吸附柱CB3放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD,12 000 r/min離心30 s,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入700 μL漂洗液PW,12 000 r/min離心30 s,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入500 μL漂洗液PW,12 000 r/min離心30 s,倒掉廢液。
(9)將吸附柱CB3放回收集管中,12 000 r/min離心2 min,倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
(10)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加25 μL ddH2O(預熱),室溫放置2~5 min,12 000 r/min離心2 min,將溶液收集到離心管中。
本實驗研究結果顯示,采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析所提取的DNA含量均較高。但相比之下4℃所提取的DNA含量更高,濃度更大,除樣品條帶外未出現其他條帶,表明所提取的DNA未受外源核酸和蛋白質的污染,無斷裂,且分子大小相同。6個試驗樣品遷移率幾乎相同。見圖1。
圖1 不同溫度條件下提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖
從動物血液中獲得高質量的DNA是進行分子遺傳育種研究所必需的。在血液中,DNA與蛋白質結合形成染色體,存在于細胞核中,因此,在提取DNA時既要將蛋白質等物質除盡,又要盡可能保持DNA分子的完整性,即DNA帶不斷裂,且無外源核酸污染。
本實驗結果表明,4℃下所提取的DNA濃度更大,含量更高;而常溫下所提取的DNA濃度雖然也較高,但條帶不整齊且點樣孔有亮度,表明有外源核酸和蛋白質的污染。本實驗采用DNA提取試劑盒法,在常溫條件下提取DNA,由于離心機高速旋轉產生大量熱量,導致部分基因組DNA降解;而在4℃條件下提取DNA,溫度低,血液細胞釋放的內源核酸酶活性較低,因此能夠保證DNA的完整性。
綜上所述,在4℃條件下提取可獲得較高質量的基因組DNA。
[1] 覃莉,江莉,李慕軍,等.人類精液DNA提取方法的探討及影響因素分析[J].廣西醫學,2013(4):406-410.
S823.2
A
2095-3887(2017)03-0073-02
10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.021
2017-03-28
西北民族大學中央高?;究蒲袠I務費專項資金項目(31920170029);西北民族大學本科生科研創新項目
常瑞剛(1995-),男,在讀本科生。
劉麗霞(1983-),女,高級實驗師,博士,主要從事動物遺傳育種與繁殖研究工作。