脂肪酸單甘油酯的酶催化合成及其表征

王楠，吳望波，張桂菊，王瑞，徐寶財

(北京工商大學 食品學院，北京市食品風味化學重點實驗室,北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京, 100048)

脂肪酸單甘油酯的酶催化合成及其表征

王楠，吳望波，張桂菊*，王瑞，徐寶財*

(北京工商大學 食品學院，北京市食品風味化學重點實驗室,北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京, 100048)

以癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯為原料，與甘油進行脂肪酶催化酯交換反應制備脂肪酸單甘油酯，產物為脂肪酸單甘油酯和少量脂肪酸雙甘油酯的混合物，其中脂肪酸單甘油酯的質量分數均在91%以上，最高可達95.9%。隨著碳鏈長度的增加，脂肪酸甲酯的轉化率降低，脂肪酸單甘油酯的質量分數也降低。采用氣相色譜-質譜聯機、核磁共振氫譜和紅外光譜，對柱層析分離后的脂肪酸單甘油酯進行了結構表征。

脂肪酸單甘油酯；脂肪酸甲酯；酶催化合成；酯交換反應

脂肪酸單甘油酯是全球需求量最大的非離子乳化劑，主要應用于食品、化妝品及制藥工業，其中70%用于食品工業。脂肪酸單甘油酯的制備方法主要有化學法和酶催化法?；瘜W法是在高溫(220～260 ℃)及堿催化劑條件下，由動植物油脂經甘油解反應制得[1]。該方法反應溫度高、能耗大，而且副反應多，產品的質量差、顏色深，所得產物為脂肪酸單甘油酯、雙甘油酯和三甘油酯的混合物，單甘油酯的純度一般為45%～55%[2]。酶催化法制備脂肪酸單甘油酯，反應條件溫和、選擇性高、產品質量好，是科學家們廣泛關注的研究熱點。酶催化法合成脂肪酸單甘油酯主要有酯化法、甘油解法、水解法和酯交換法等，其中甘油解法由于原子經濟性高備受關注[3-4]，所得產物中脂肪酸單甘油酯的純度可達65%～80%[5-8]。這可以滿足一般實際應用的需求，但是在人造黃油、起酥油、冰淇淋和奶油等食品加工中，要求脂肪酸單甘油酯的純度達到90%以上，因此需要通過高能耗、高成本的分子蒸餾進行分離提純，以獲得高純度的脂肪酸單甘油酯[9-12]。此外，可采用基團保護法制備高純度脂肪酸單甘油酯，即選用丙酮、硼酸等基團保護劑將甘油的其中兩個羥基保護起來，剩余1個羥基與脂肪酸及其衍生物發生反應，可制備純度高于90%的脂肪酸單甘油酯[13-16]。但這種方法額外增加了保護與脫除保護的過程，無疑會增加成本。

采用脂肪酸甲酯與甘油的酶催化酯交換反應，選擇性高，可獲得高純度的脂肪酸單甘油酯[17]。本研究分別以癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯及硬脂酸甲酯為原料，叔丁醇作為反應溶劑，在固定化脂肪酶催化作用下與甘油進行酯交換反應制備脂肪酸單甘油酯，并對5種脂肪酸單甘油酯進行了提純和結構表征。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯(純度>99%，百靈威科技有限公司)；叔丁醇、甘油(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈、丙酮(色譜純，北京迪馬歐泰科技發展中心)；固定化脂肪酶(Novozyme 435，丹麥諾維信生物技術有限公司)。

立式恒溫振蕩器(IS-RSV1)，蘇州精騏有限公司；高效液相色譜(Agilent1200)，安捷倫科技有限公司；電子天平(BSA423S)，賽多利斯科學儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS10)，賽默飛世爾科技有限公司)；核磁共振儀(AV300 MHz，德國 Bruker 公司)；三重四極桿氣質聯用儀(GC7890/7000B，安捷倫科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酸單甘油酯的合成

50 mL具塞錐形瓶中，依次加入5 g脂肪酸甲酯和一定量的甘油、叔丁醇，其中底物質量分數(脂肪酸甲酯相對于叔丁醇的質量分數)為30%，底物摩爾比(脂肪酸甲酯與甘油的摩爾比)為1∶5，再加入Novozyme 435脂肪酶，酶添加量(相對于脂肪酸甲酯的質量分數)為7%，待體系混合均勻，置于立式恒溫振蕩器，設置反應溫度55 ℃、振蕩器轉速220 r/min，開始反應，并分別于反應開始后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h取樣進行液相色譜分析。

反應結束后，過濾，回收脂肪酶，濾液中加入50 mL乙醇/蒸餾水(40∶10，v/v)，用30 mL正己烷萃取3次，合并正己烷相，旋蒸除去溶劑，回收未反應的脂肪酸甲酯。乙醇/水相用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機相，旋蒸，得白色粉末狀固體，用液相色譜(HPLC)分析脂肪酸單甘油酯和脂肪酸雙甘油酯的質量分數。

1.2.2 脂肪酸單甘油酯的提純

柱層析分離方法參照文獻[18-19]。稱取30 g硅膠加入100 mL石油醚中，然后裝入玻璃層析柱(φ3 cm×40 cm)，稱取2 g脂肪酸單甘油酯樣品溶于石油醚，并加入層析柱中。先后采用不同比例的石油醚∶乙酸乙酯(體積比分別為5∶1, 1∶1)進行梯度洗脫，依次得到脂肪酸雙甘油酯和脂肪酸單甘油酯，旋蒸除去溶劑，待分析。

1.2.3 脂肪酸單甘油酯的液相色譜分析

采用高效液相色譜-示差折光檢測器(HPLC-RID)對原料脂肪酸甲酯及反應中生成的脂肪酸單甘油酯、脂肪酸雙甘油酯進行分析，外標法定量。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；分析條件：柱溫為35 ℃，流動相為乙腈/丙酮(1∶1，v/v)，流速為1 mL/min，進樣量20 μL，檢測器溫度為40 ℃。

1.2.4 脂肪酸單甘油酯的表征

氣相色譜-質譜聯機(GC-MS)分析：EI全掃描，He作為載氣。進樣器溫度50 ℃，檢測器溫度250 ℃，總流量22 mL/min，進樣量為1.0 μL，分流比20∶1，隔墊吹掃流量3 mL/min，離子源溫度230 ℃。溶劑延遲時間4 min；掃描范圍40～500 amu。升溫程序：從50 ℃以30 ℃/min的速度升到220 ℃，再以2 ℃/min升到250 ℃保持5 min，再以15 ℃/min升溫到290 ℃。

核磁共振氫譜(1H-NMR)分析：將5種脂肪酸單甘油酯樣品用氘代氯仿配成相應的溶液，采用Bruker AV300MHz核磁共振譜分析儀進行數據采集。

紅外光譜(IR)分析：采取KBr壓片法，取脂肪酸單甘油酯樣品與KBr混勻壓成薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行紅外光譜分析，測試波數范圍4 000～400 cm-1。

2 結果和討論

2.1 脂肪酸單甘油酯的合成

癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯分別與甘油進行酶催化反應合成脂肪酸單甘油酯，反應體系中原料脂肪酸甲酯及生成的脂肪酸單甘油酯和脂肪酸雙甘油酯的質量分數隨反應時間的變化如圖1～圖5所示。

圖1 癸酸單甘油酯的合成Fig.1 The synthesis of glycerol monocaprate

圖2 月桂酸單甘油酯的合成Fig.2 The synthesis of glycerol monolaurate

圖3 肉豆蔻酸單甘油酯的合成Fig.3 The synthesis of glycerol monomyristate

圖4 棕櫚酸單甘油酯的合成Fig.4 The synthesis of glycerol monopalmitate

圖5 硬脂酸單甘油酯的合成Fig.5 The synthesis of glycerol monostearate

從圖1-圖5可以看出，反應剛開始時脂肪酸甲酯和甘油的反應速率很快，30 min時反應體系中脂肪酸單甘油酯的質量分數即可達50%左右。之后反應速率降低，1 h后反應達到平衡，脂肪酸甲酯、脂肪酸單甘油酯及脂肪酸雙甘油酯的質量分數基本保持不變。反應達到平衡后反應體系中脂肪酸甲酯的轉化率及脂肪酸單甘油酯和雙甘油酯的質量分數見表1。經過后處理回收未反應的脂肪酸甲酯，產物中脂肪酸單甘油酯的質量分數也見表1。

表1 脂肪酸甲酯的轉化率及脂肪酸單甘油酯和雙甘油酯的質量分數

從表1中可知，癸酸甲酯的轉化率最高，達到了76.2%，硬脂酸甲酯的轉化率最低為69.3%。反應達到平衡后，體系中癸酸單甘油酯的質量分數最高為73.1%，而癸酸雙甘油酯的質量分數最低為3.1%；硬脂酸單甘油酯的質量分數最低為63.3%，而硬脂酸雙甘油酯的質量分數為6.1%。以上數據表明，在脂肪酸甲酯與甘油的酶催化酯交換反應中，選擇性高，脂肪酸單甘油酯的質量分數均可達91%以上，其中癸酸單甘油酯的質量分數最高為95.9%。不同的碳鏈長度對脂肪酸甲酯的轉化率及反應的選擇性均有一定的影響，碳鏈越長，脂肪酸甲酯的轉化率越低，所得的脂肪酸單甘油酯的質量分數也越低[20]。

2.2 脂肪酸單甘油酯的表征

酶催化反應結束后，經后處理回收未反應的月桂酸甲酯，所得產物為脂肪酸單甘油酯和少量脂肪酸雙甘油酯的混合物。按照1.2.2部分的方法經柱層析分離提純，除去脂肪酸雙甘油酯，得脂肪酸單甘油酯純品，采用GC-MS和1HNMR、IR進行結構表征。

2.2.1 GC-MS分析

5種脂肪酸單甘油酯的GC-MS分析結果如圖6所示。

A-癸酸單甘油酯；B-月桂酸單甘油酯；C-肉豆蔻酸單甘油酯；D-棕櫚酸單甘油酯；E-硬脂酸單甘油酯圖6 脂肪酸單甘油酯的GC-MS總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion chromatorgraphy of fatty acid monoglycerides

從圖6可以看出，癸酸單甘油酯的保留時間為7.77 min，峰面積百分比為99.6%；月桂酸單甘油酯的保留時間為9.53 min，峰面積百分比為99.6%；肉豆酸單甘油酯的保留時間為12.20 min，峰面積百分比為99.7%；棕櫚酸單甘油酯的保留時間為16.09 min，峰面積百分比為99.7%；硬脂酸單甘油酯的保留時間為20.66 min，峰面積百分比為99.3%。

癸酸單甘油酯(EI-MSm/z)：215.1，173.1，155.1，134，98；月桂酸單甘油酯(EI-MSm/z)：243.1，201.1，183.1，134，98；肉豆酸單甘油酯(EI-MSm/z)：271，229.1，211.1，134，98；棕櫚酸單甘油酯(EI-MSm/z)：299.1，257.1，239.2，134，98；硬脂酸單甘油酯(EI-MSm/z)：327.1，285.1，267.2，134，98。EI-MS碎片離子峰符合脂肪酸單甘油酯的化學結構，與文獻報道一致[21]。

2.2.21H-NMR分析

5種脂肪酸單甘油酯樣品的1H-NMR分析結果如圖7所示。

A-癸酸單甘油酯；B-月桂酸單甘油酯；C-肉豆蔻酸單甘油酯；D-棕櫚酸單甘油酯；E-硬脂酸單甘油酯圖7 脂肪酸單甘油酯的1H-NMR圖Fig.7 1H-NMR spectra of fatty acid monoglycerides

癸酸單甘油酯 (CDCl3，300 MHz)，δ：0.884 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.268 (m，12H， 6CH2)，1.632 (m，2H，CH2)，2.356 (t，J = 15.3 Hz，2H，CH2CO)，3.602 (dd，J = 6.0，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.705 (dd，J = 3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.938 (m，1H，CHOH)，4.179 (m，2H，CH2OCO)。

月桂酸單甘油酯 (CDCl3，300MHz)，δ：0.886 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.264 (m，16H，8CH2)，1.634 (m，2H，CH2)，2.357 (t，J = 15.0 Hz，2H，CH2CO)，3.604 (dd，J = 5.7，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.707 (dd，J = 3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.940 (m，1H，CHOH)，4.181 (m，2H，CH2OCO)。

肉豆蔻酸單甘油酯 (CDCl3，300MHz)，δ：0.882 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.258 (m，20H，10CH2)，1.627 (m，2H，CH2)，2.351 (t，J = 15.0 Hz，2H，CH2CO)，2.566 (bs，2H，OH)，3.596 (dd， J=6.0，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.700 (dd，J=3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.933 (m，1H，CHOH)，4.171 (m，2H，CH2OCO)。

棕櫚酸單甘油酯 (CDCl3，300MHz)，δ：0.888 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.263 (m，24H，12CH2)，1.637 (m，2H，CH2)，2.205 (bs，2H，OH)，2.361 (t，J = 15.0 Hz，2H，CH2CO)，3.609 (dd，J=6.0，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.689 (dd，J = 3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.944 (m，1H，CHOH)，4.185 (m，2H，CH2OCO)。

硬脂酸單甘油酯 (CDCl3，300MHz)，δ：0.890 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.264 (m，28H，14CH2)，1.639 (m，2H，CH2)，2.362 (t，J = 15.0 Hz，2H，CH2CO)，3.612 (dd， J = 5.7，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.714 (dd，J = 3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.947 (m，1H，CHOH)， 4.188 (m，2H，CH2OCO)。

從圖7可以看出，5種脂肪酸單甘油酯的1H NMR譜非常相似，這是因為它們的化學結構相似，由長碳鏈的?；透视蛢刹糠纸M成，如圖8所示。?；兼溕腺|子的化學位移位于0.882～2.362 ppm之間，而甘油部分質子的化學位移位于3.596～4.188 ppm之間。其中甘油部分2號碳原子為手性碳， 1和3號碳原子上的2個質子不等價，因此3號碳原子上的2個質子分別表現出兩個二重峰(dd)，但是1號碳原子上的2個質子表現出多重峰(m)。甘油部分的2個游離羥基為活潑氫，存在質子交換反應，肉豆蔻酸單甘油酯和棕櫚酸單甘油酯的譜圖中出現羥基質子的寬峰，而其他3種脂肪酸單甘油酯的譜圖中沒有觀察到明顯的羥基質子峰，可能是與羰基附近的亞甲基質子峰發生了重疊。上述結果與文獻報道一致[13, 15]。

癸酸單甘油酯n=6，月桂酸單甘油酯n=8，肉豆蔻酸單甘油酯n=10，棕櫚酸單甘油酯n=12，硬脂酸單甘油酯n=14圖8 脂肪酸單甘油酯的結構式Fig.8 Structure of fatty acid monoglycerides

2.2.3 紅外光譜分析

A-癸酸單甘油酯；B-月桂酸單甘油酯；C-肉豆蔻酸單甘油酯；D-棕櫚酸單甘油酯；E-硬脂酸單甘油酯圖9 脂肪酸單甘油酯紅外光譜圖Fig.9 IR spectra of fatty acid monoglycerides

3 結論

以脂肪酶Novozyme 435為催化劑，采用癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯等脂肪酸甲酯為原料，與甘油進行酶催化酯交換反應制備相應的脂肪酸單甘油酯。原料脂肪酸甲酯的轉化率69.2%～76.2%，隨著碳鏈長度的增加，轉化率降低，即反應活性降低。生成物為脂肪酸單甘油酯和少量脂肪酸雙甘油酯的混合物，其中脂肪酸單甘油酯的質量分數均在91%以上，最高可達95.9%。經柱層析分離得到的五種脂肪酸單甘油酯純品，采用氣相色譜-質譜聯機、核磁共振氫譜及紅外光譜對其進行純度分析和結構表征。

脂肪酸甲酯與甘油的酶催化酯交換反應，速率快，反應1h就達到平衡；另外反應選擇性高，生成脂肪酸單甘油酯的選擇性高于90%，不經分子蒸餾提純即可獲得高純度的脂肪酸單甘油酯。但是，目前脂肪酸甲酯的轉化率較低，是下一步研究工作亟待解決的問題。

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Enzymatic synthesis and characterization of monoglycerides

WANG Nan, WU Wang-bo, ZHANG Gui-ju*, WANG Rui, XU Bao-cai*

(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Monoglycerides were prepared by the transesterification of fatty acid methyl esters such as methyl caprate, methyl laurate, methyl myristate, methyl palmitate and methyl stearate with glycerol in the presence of Novozyme 435 lipase as catalyst. The product is a mixture of monoglycerides and a small amount of diglycerides, which contained monoglycerides above 91%, and up to 95.9%. With the increase of carbon chain length, the conversion of fatty acid methyl esters decreased, and the content of monoglycerides in the products also decreased. After being purified by column chromatography, the final products was characterized by Gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS), H nuclear magnetic resonance (1H NMR) and infrared spectra (IR).

fatty acid monoglycerides; fatty acid methyl ester; enzymatic synthesis; transesterification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705001

碩士研究生，助理實驗師(張桂菊副教授和徐寶財教授為通訊作者,E-mail：zhangguiju@th.btbu.edu.cn；xubaoc@btbu.edu.cn)。

國家自然科學基金(21676003，21403010)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2014BAE03B01)；北京市教委科技計劃重點項目(KZ201510011010)；北京市教委市屬高校創新能力提升計劃項目(TJSHG201510011020)

2016-12-06，改回日期：2017-01-06