LRRC3B對食管癌細胞Eca109遷移、侵襲及PI3K/Akt信號通路的影響

曹燕飛，任 睿，楊 曄，羅向暉，王水利

1.陜西省人民醫院胸外科，陜西 西安 710068；2.陜西省新安中心醫院婦產科，陜西 西安 710048；3.陜西省人民醫院呼吸內科，陜西 西安 710068

LRRC3B對食管癌細胞Eca109遷移、侵襲及PI3K/Akt信號通路的影響

曹燕飛1，任 睿2，楊 曄1，羅向暉1，王水利3

1.陜西省人民醫院胸外科，陜西 西安 710068；2.陜西省新安中心醫院婦產科，陜西 西安 710048；3.陜西省人民醫院呼吸內科，陜西 西安 710068

背景與目的：先前的研究已經證實富含亮氨酸重復序列3B蛋白(leucine-rich repeatcontaining 3B，LRRC3B)在多種癌癥中低表達，并且與癌細胞的遷移侵襲密切相關。該研究旨在探討LRRC3B在食管癌發展中的作用機制。方法：免疫組織化學染色檢測LRRC3B在60例食管癌組織及60例癌旁組織中的表達情況，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白[質]印跡法(Western blot)分別檢測食管癌細胞Eca109和食管正常上皮細胞系HEEC中LRRC3B的mRNA和蛋白表達。處理食管癌細胞Eca109并分3組：正常對照組、陰性對照組(轉染對照空pCMV6質粒)和過表達LRRC3B組(轉染pCMV6-LRRC3B過表達質粒)。采用Transwell法檢測各組Eca109細胞遷移和侵襲的變化。采用Western blot檢測各組細胞中上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達以及p-Akt蛋白水平。結果：LRRC3B在食管癌組織和細胞中的表達明顯低于癌旁組織和食管正常上皮細胞。過表達LRRC3B明顯抑制Eca109細胞的遷移和侵襲能力，上調上皮因子E-cadherin表達，抑制間質標志物N-cadherin和Vimentin表達，同時降低細胞內p-Akt水平。結論：LRRC3B在食管癌中低表達，上調LRRC3B能夠抑制食管癌細胞的EMT過程，可能與抑制PI3K/Akt信號通路有關。

富含亮氨酸重復序列3B蛋白；食管癌；上皮間質轉化；PI3K/Akt

食管癌是世界上高發惡性腫瘤之一。在我國，食管癌發病率位居第5位，死亡率位居第4位，且呈不斷上升趨勢［1］。分子靶向治療是繼手術治療、放療和化療之后腫瘤患者的又一選擇，增強腫瘤抑制基因的表達，抑制腫瘤細胞增殖和轉移，目前已經成為國內外腫瘤研究領域的熱點。富含亮氨酸重復序列3B蛋白(leucine rich repeat-containing 3B，LRRC3B)是具有保守亮氨酸序列的跨膜蛋白，該蛋白參與動植物細胞黏附、信號轉導、基因表達調控及細胞凋亡等過程［2］。已有研究證實LRRC3B基因在非小細胞肺癌［3］、乳腺癌［4］、腎細胞癌［5］和胃癌［6］中低表達，作為腫瘤抑制基因，上調其表達能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖。但是目前LRRC3B在食管癌中的表達以及生物學作用尚不明確。本研究探索了LRRC3B在食管癌組織和食管癌細胞中的表達變化，分析其在食管癌發展中的作用機制，從而為食管癌的靶向治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 組織標本來源及處理

收集2014年10月—2015年5月期間本院消化科經手術治療的食管癌患者60例，其中女性25例、男性35例，平均年齡為(49.5+4.6)歲。所有患者均已知情同意，且術前均未行放、化療或分子靶向治療。取材部分為癌灶組織和遠端正常食管黏膜組織，癌旁組織取材于腫瘤邊緣肉眼觀察為正常黏膜組織，制備組織石蠟切片，備用。

1.2 細胞和主要試劑

人食管癌細胞系Eca109和正常食管上皮細胞系HEEC均購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。免疫組織化學染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，免疫組織化學LRRC3B抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰酶及DMEM培養液均購自美國Gibaco公司，RPMI-1640培養液購自美國Hyclone公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time f l uorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)有關試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，Matrigel基質膠購自購自美國Omega公司。LRRC3B、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin單克隆抗體均購自美國Sigma公司，p-Akt和Akt單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司，pCMV6-LRRC3B質粒和對照空pCMV6質粒購自美國Origene公司，兔抗大鼠β-actin抗體和HRP標記的山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學染色檢測組織切片中LRRC3B表達

分別隨機選取3張食管癌組織和癌旁組織石蠟切片，依次經過脫蠟、水化、抗原修復、封閉內源性過氧化物酶，滴加一抗，4 ℃溫育過夜，滴加山羊抗鼠的二抗，37 ℃溫育30 min，DBA顯色、蘇木精復染、鹽酸分化、脫水封片，每張切片隨機選取5個以上高倍鏡視野，觀察LRRC3B陽性表達的情況。LRRC3B在食管癌細胞的陽性表達為細胞質中出現棕黃色顆粒，因此按陽性細胞占細胞總數的百分比對組織進行染色分級：0～10%的細胞質染色為陰性(-)，10%～50%的細胞質染色為陽性(+)，大于50%的細胞質染色為強陽性(++)。以上所有切片染色均與正常食管組織陽性對照樣品相對比。

1.4 采用RTFQ-PCR檢測Eca109和HEEC細胞中LRRC3B的mRNA表達

分別提取正常培養的食管癌細胞Eca109和正常試管上皮細胞HEEC中的總RNA，嚴格按照Prime ScriptRTreagent kit反轉錄試劑盒合成cDNA，采用cDNA的第1鏈作為模板進行PCR擴增。使用ABI7500快速RTFQ-PCR系統，用2-ΔΔCt法分析待測基因的相對表達水平。目的基因LRRC3B的mRNA表達量檢測是以β-actin為內參基因。上海英駿生物技術有限公司合成擴增目的基因LRRC3B，其上游引物為：5’-TCCAATCATGAGACAGCCCAC-3’，下游引物為：5’-TCTGCCAGCATGTTCATCCAA-3’；內參基因β-actin上游引物為：5’-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3’，下游引物為：5’-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3’。

1.5 食管癌細胞Eca109轉染與分組

將Eca109細胞接種于含有10%的胎牛血清及青霉素100 U/mL和鏈霉素100 g/mL的RPMI-1640培養液中，置于37 ℃，CO2體積分數為5%培養箱常規培養。當細胞處于對數期時根據LipofectamineTM2000試劑盒說明書轉染不同質粒。根據不同處理，細胞分為3組：正常對照組(不作任何處理，正常培養)、陰性對照組(轉染對照空質粒pCMV6)和過表達LRRC5B組(轉染過表達質粒pCMV6-LRRC3B)。轉染48 h后收集細胞用于后續試驗。

1.6 采用Transwell遷移實驗檢測各組Eca109細胞的遷移能力

用無血清DMEM培養液調整各組細胞濃度為1×105個/mL，在Transwell下室加入1 mL含有5%FBS的DMEM培養基，上室加入0.5 mL濃度為1×105個/mL的待測細胞。培養24 h，去除上室的細胞，用4%多聚甲醛溶液固定黏附在Transwell小室膜下表面細胞15 min，再用0.05%結晶紫染色40 min，然后使用Leica DC 300F正置顯微鏡隨機選取10個視野計數細胞個數，求其平均值。

1.7 采用Transwell侵襲實驗檢測各組Eca109細胞的侵襲能力

與遷移實驗不同的是，Transwell侵襲實驗需要在接種細胞之前，用100 μL 濃度為1 mg/mL的Matrigel包埋小室1 h，其余步驟同Transwell遷移實驗。

1.8 采用蛋白［質］印跡法(Western blot)檢測細胞中LRRC3B、EMT相關蛋白及PI3K/Akt相關蛋白的表達

消化、離心收集各組細胞，加入裂解液重懸細胞，離心，收集含有總蛋白的上清液，采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量(離心速率15 000×g，r=3 cm)。調整加樣量25 μg，10% SDS-PAGE后轉移蛋白至PVDF膜，新鮮配制的含5%BSA的TBST液室溫封閉1 h，加入一抗(LRRC3B 1∶1 000，E-cadherin 1∶ 1 500，N-cadherin 1∶2 000，Vimentin 1∶1 500，p-Akt 1∶1 000，Akt 1∶1 500)過夜，TBST液洗膜3次，每次5 min，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗溫育1 h，ECL顯影，Band Scan 5.0凝膠電泳圖像分析軟件進行條帶灰度掃描，β-actin為內參對目的蛋白進行灰度值半定量分析。每個樣本重復3次，取均值。

1.9 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料用表示，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析，組間數據兩兩比較采用 LSD-t法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 癌灶組織和癌旁組織中LRRC3B免疫組織化學染色比較

免疫組織化學染色結果顯示，60例食管癌的癌組織中，LRRC3B在細胞質中的表達不明顯，45例(90%)呈現陰性表達；60例食管癌的癌旁組織中，LRCC3B在細胞質中彌漫表達，40例(66.7%)呈現陽性表達，20例(33.3%)呈現強陽性表達(圖1)。

圖1 食管癌組織和癌旁組織中LRRC3B免疫組織化學染色Fig. 1 The immunohistochemistry of LRRC3B in cancer tissues and adjacent non-neoplastic tissues

2.2 LRRC3B在食管癌組織中的表達與患者臨床病理參數的關系

隨著臨床分期的增加，食管癌組織中LRRC3B表達降低，Ⅱ、Ⅲ期的陽性表達程度低于Ⅰ期(P<0.05)；無淋巴結轉移的組織中LRRC3B表達高于有淋巴結轉移的組織(P<0.05)。LRRC3B在不同年齡、性別患者食管癌組織中的表達差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

2.3 食管癌細胞Eca109和正常細胞HEEC中LRRC3B表達量比較

與正常食管癌上皮細胞HEEC相比，食管癌細胞Eca109中LRRC3B的mRNA相對表達和蛋白相對表達分別為(0.35+0.04)和(0.31+0.05)，分別明顯小于HEEC細胞中LRRC38的mRNA相對表達()和蛋白相對表達量()，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

2.4 轉染pCMV6-LRRC3B質粒對食管癌細胞Eca109遷移能力的影響

與正常對照組相比，過表達LRRC3B組Transwell小室膜下附著的細胞數為，明顯小于正常對照組細胞的遷移數，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

2.5 轉染pCMV6-LRRC3B質粒對食管癌細胞Eca109侵襲能力的影響

與正常對照組相比，過表達LRRC3B組細胞侵襲穿過Transwell小室底膜的數量為，明顯小于正常對照組的98.7+5.3，差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。

2.6 轉染pCMV6-LRRC3B質粒對食管癌細胞Eca109中LRRC3B以及EMT相關蛋白表達的影響

正常對照組Eca109細胞中LRRC3B、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量依次為、、和，過表達LRRC3B組細胞中LRRC3B、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量依次為、、和，與正常組相比，過表達LRRC3B組細胞中LRRC3B和E-cadherin表達量顯著增加，N-cadherin和Vimentin表達量顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05，圖5)。

表1 患者臨床病理參數與LRRC3B表達的關系Tab. 1 The relationship between patient characteristics and LRRC3B expression

2.7 轉染pCMV6-LRRC3B質粒對食管癌細胞Eca109中PI3K/Akt信號通路的影響

正常對照組Eca109細胞中p-Akt和Akt蛋白水平分別為和，過表達LRRC3B組細胞中p-Akt和Akt蛋白相對水平分別為和，與正常對照組相比，過表達LRRC3B組細胞中p-Akt蛋白相對水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而Akt總蛋白無明顯變化(圖6)。

圖2 Western blot檢測HEEC細胞和Eca109細胞中LRRC3B表達Fig. 2 The expression of LRRC3B in HEEC cells and Eca109 cells were measured by Western blot

圖3 各組細胞遷移能力比較Fig. 3 The comparison of cell migration in di ff erent groups

圖4 各組細胞侵襲能力比較Fig. 4 The comparison of invasion in di ff erent groups

圖5 Western blot檢測各組細胞LRRC3B以及EMT相關蛋白表達Fig. 5 The expression of LRRC3B and EMT related proteins in groups were measured by Western blot

圖6 Western blot檢測各組細胞PI3K/Akt相關蛋白表達Fig. 6 The related proteins of PI3K/Akt in groups were measured by Western blot

3 討 論

LRRC3B是一種具有分泌和跨膜功能并包含亮氨酸重復序列的分泌性蛋白［6］。富含亮氨酸重復序列蛋白參與動植物體內許多重要的過程，包含免疫調節、受體間相互作用、細胞黏附、信號轉導、基因表達和細胞凋亡等等［5,7］。先前研究已經在胃癌、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌及透明細胞腎細胞癌中發現LRRC3B基因由于啟動子區域DNA甲基化和組蛋白去乙?；瘜е碌氖Щ詈捅磉_下調，表明LRRC3B參與了癌癥的發生、發展過程［8-10］。本研究發現，LRRC3B在食管癌患者癌變組織部位的表達明顯低于癌旁組織，同時與正常食管上皮細胞相比，食管癌細胞Eca109中LRRC3B顯著減少。這表明LRRC3B也可能參與了食管癌的發生過程，進一步將食管癌細胞Eca109轉染過表達LRRC3B質粒，研究LRRC3B在食管癌生物學行為中的作用機制。

已有研究證實，LRRC3B能夠抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲［11］，在胃癌細胞中轉染LRRC3B能夠抑制集落形成［6］，同時LRRC3B能夠有效抑制卵巢癌細胞活性［12］。本研究通過Transwell實驗得知，過表達LRRC3B明顯抑制食管癌細胞Eca109的遷移和侵襲。EMT被認為是癌細胞遷移和侵襲過程中最關鍵的步驟［13］，一般來說，鈣黏蛋白表達的減少或缺失及間質標志物的誘導上調是EMT發生的主要標志［14］。因此，本研究采用Western blot分析轉染LRRC3B后細胞中EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達量變化。Western blot結果顯示過表達LRRC3B明顯抑制N-cadherin和Vimentin表達，同時上調E-cadherin表達。因此，LRRC3B能夠通過抑制EMT過程，從而能抑制細胞的遷移和侵襲能力。

癌細胞中調控EMT的信號通路有多種，包含有Notch信號通路、Ras/EMK信號通路、Hedgehog信號通路、Wnt信號通路及PI3K/Akt信號通路［15-17］。PI3k/Akt被認為是食管癌起始和發展過程中至關重要的一條信號通路，并且也被認為與EMT密切相關。據報道，上皮細胞中激活的Akt水平導致細胞間黏附力缺失，細胞極性的缺失并且誘導細胞運動，改變上皮細胞和間質細胞標志物的表達和分布［16，18］。本研究發現，LRRC3B明顯抑制細胞中Akt的磷酸化水平，表明LRRC3B可能通過抑制PI3K/Akt信號通路而抑制食管癌細胞的遷移和EMT轉化。

綜上可知，我們推斷LRRC3B基因在食管癌中是非常重要的腫瘤抑制基因，上調LRRC3B表達能夠有效抑制食管癌細胞的EMT發生過程，這可能與抑制PI3K/Akt信號通路有關。因此，LRRC3B可能成為食管癌預防和治療的一個新靶點。

［1］ GENG T T, XUN X J, LI S, et al. Association of colorectal cancer susceptibility variants with esophageal cancer in a Chinese population ［J］. World J Gastroenterol, 2015, 21(22): 6898-6904.

［2］ ZUNIGA-PFLUCHER J C. New role identified for LRR-containing proteins in T cell development ［J］. J Exp Med, 2014, 211(5): 746-747.

［3］ KAN L, LI H, ZHANG Y, et al. LRRC3B is downregulated in non-small cell lung cancer and inhibits cancer cell proliferation and invasion ［J］. Tumour Biol, 2016, 37(1): 1113-1120.

［4］ WANG Y, PENG Y, ZHOU Y, et al. The clinical value of LRRC3B gene expression and promoter hypermethylation in breast carcinomas ［J］. Cell Biochem Biophys, 2014, 70(2): 1035-1041.

［5］ KONDRATOV A G, STOLIAR L A, KVASHA S M, et al. Methylation pattern of the putative tumor-suppressor gene LRRC3B promoter in clear cell renal cell carcinomas ［J］. Mol Med Rep, 2012, 5(2): 509-512.

［6］ KIM M, KIM J H, JANG H R, et al. LRRC3B, encoding a leucine-rich repeat-containing protein, is a putative tumor suppressor gene in gastric cancer ［J］. Cancer Res, 2008, 68(17): 7147-7155.

［7］ TIAN X Q, ZHANG Y, SUN D, et al. Epigenetic silencing of LRRC3B in colorectal cancer ［J］. Scand J Gastroenterol, 2009, 44(1): 79-84.

［8］ CHEN X, LEUNG S Y, YUEN S T, et al. Variation in gene expression patterns in human gastric cancers ［J］. Mol Biol Cell, 2003, 14(8): 3208-3215.

［9］ RICHARDSO A L, WANG Z C, DE NICOLO A, et al. X chromosomal abnormalities in basal-like human breast cancer［J］. Cancer Cell, 2006, 9(2): 121-132.

［10］ KORKOLA J E, HOULDSWORTH J, CHADALAVADA R S, et al. Down-regulation of stem cell genes, including those in a 200-kb gene cluster at 12p13.31, is associated with in vivo differentiation of human male germ cell tumors ［J］. Cancer Res, 2006, 66(2): 820-827.

［11］ 闞 亮, 張 萌, 何 平. LRRC3B在非小細胞肺癌中下調并與肺癌細胞增殖和侵襲能力相關［J］. 中國肺癌雜志, 2016, 19(4): 177-183.

［12］ KASHUBA V, DMITRIEV A A, KRASNOV G S, et al. NotI microarrays: novel epigenetic markers for early detection and prognosis of high grade serous ovarian cancer ［J］. Int J Mol Sci, 2012, 13(10): 13352-13377.

［13］ CHEN Q Y, JIAO D M, WANG J, et al. miR-206 regulates cisplatin resistance and EMT in human lung adenocarcinomacells partly by targeting MET ［J］. Oncotarget, 2016, 7(17): 24510-24526.

［14］ LIU Z, LONG J, DU R, et al. miR-204 regulates the EMT by targeting snai1 to suppress the invasion and migration of gastric cancer ［J］. Tumour Biol, 2016, 37(6): 8327-8335.

［15］ GUO L, PENG W, TAO J, et al. Hydrogen sulfide inhibits transforming growth factor-beta1-induced EMT via Wnt/ Catenin pathway ［J］. PLoS One, 2016, 11(1): e0147018.

［16］ YANG J, QIN G, LUO M, et al. Reciprocal positive regulation between Cx26 and PI3K/Akt pathway confers acquired gefitinib resistance in NSCLC cells via GJIC-independent induction of EMT ［J］. Cell Death Dis, 2015, 6: e1829.

［17］ ISLAM S S, MOKHTAriR B, NOMAN A S, et al. Sonic hedgehog (Shh) signaling promotes tumorigenicity and stemness via activation of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in bladder cancer ［J］. Mol Carcinog, 2016, 55(5): 537-551.

［18］ KAUSHIK N K, KAUSHIK N, YOO K C, et al. Low doses of PEG-coated gold nanoparticles sensitize solid tumors to cold plasma by blocking the PI3K/AKT-driven signaling axis to suppress cellular transformation by inhibiting growth and EMT［J］. Biomaterials, 2016, 87: 118-130.

The influence of LRRC3B on esophageal cancer cell Eca109 migration, invasion and PI3K/Akt signaling pathway

CAO Yanfei1, REN Rui2, YANG Ye1, LUO Xianghui1, WANG Shuili3

(1. Department of Thoracic Surgery, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, Shaanxi Province, China; 2 Department of Obstetrics and Gynecology, Shaanxi Xin’an Central Hospital, Xi’an 710048, Shaanxi Province, China; 3. Department of respiratory internal, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, Shaanxi Province, China)

REN Rui E-mail: huiqingguohn@163.com

Background and purpose: Previous studies have confirmed that the expression of leucine-rich repeat-containing 3B (CLRRC3B) was significantly decreased in different human cancers, which was also associated with the migration and invasion of cancer cells. The aim of this study was to explore the potential mechanism of LRRC3B in the development of esophageal cancer. Methods: The LRRC3B expression was detected in 60 cancer tissues and 60 adjacent non-neoplastic tissues by immunohistochemistry. The mRNA and protein expression of LRRC3B in Eca109 and HEECs were detected using real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) and Western blot, respectively. Eca109 cells with different treatments were divided into three groups: normal group, negative control group (transfected with pCMV6 plasmid), overexpression LRRC3B group (transfected with pCMV6-LRRC3B plasmid). Transwell assay was used to measure the migration and invasion of Eca109 cells in different groups. The protein levels of E-cadherin, N-cadherin, Vimentin and p-Akt were determined by Westernblot. Results: The expression of LRRC3B in esophageal cancer tissues was lower than that of non-cancerous tissues, as well as the expression of LRRC3B in Eca109 was decreased compared with that of normal esophageal epithelial cell line HEEC. Overexpression of LRRC3B significantly inhibited Eca109 cells migration and invasion, upregulated the expression of E-cadherin and decreased the expression of N-cadherin and Vimentin. Moreover, overexpression of LRRC3B significantly inhibited the phosphorylation of Akt in Eca109 cells. Conclusion: The expression of LRRC3B was decreased in esophageal cancer. Overexpression of LRRC3B can efficiently inhibit the EMT progression in esophageal cancer cells by suppressing PI3K/Akt signaling pathway.

Leucine-rich repeat-containing 3B; Esophageal cancer; Epithelial-mesenchymal transition; PI3K/ Akt

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.05.005

R735.1

A

1007-3639(2017)05-0345-08

2016-11-05

2016-12-20）

陜西省自然科學基金面上項目(2014JM2-8166)。

任 睿 E-mail：huiqingguohn@163.com