糖代謝中關鍵酶果糖雙磷酸酶-1與卵巢癌化療敏感性關系的研究

李浩然，李夢嬌，劉 霏，王子良，程 璽

1.復旦大學附屬腫瘤醫院婦瘤科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；2.復旦大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

糖代謝中關鍵酶果糖雙磷酸酶-1與卵巢癌化療敏感性關系的研究

李浩然1，李夢嬌1，劉 霏1，王子良2，程 璽1

1.復旦大學附屬腫瘤醫院婦瘤科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；2.復旦大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

背景與目的：上皮性卵巢癌是女性生殖系統惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤?；熎陂g耐藥的產生是卵巢癌死亡率高的主要原因。果糖雙磷酸酶-1(fructose-1, 6-bisphosphatase，FBP1)是糖代謝過程中的關鍵酶。FBP1用于催化1,6 -二磷酸果糖水解為6-磷酸果糖和磷酸鹽，從而抑制細胞的糖酵解。該研究旨在探討FBP1與卵巢癌化療敏感性關系。方法：采用免疫組織化學方法檢測209例卵巢癌患者標本中FBP1蛋白的表達水平及其與卵巢癌患者化療敏感性的關系。結果：在209例卵巢癌組織中，FBP1的陽性表達率為49.3%(103/209)，FBP1表達陽性組患者生存期長于陰性組，二者之間差異有統計學意義(42.6個月 vs 62.1個月，P=0.003)，并且FBP1表達與化療敏感性相關(P=0.007)。結論：糖代謝中關鍵酶基因FBP1的表達可能與卵巢癌對化療的敏感性有關，可作為化療敏感性及預后判斷的重要指標。

果糖雙磷酸酶-1；卵巢癌；順鉑；化療敏感性

上皮性卵巢癌是女性生殖系統惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤。流行病學數據表明，在婦科腫瘤引起的死亡病例中，上皮性卵巢癌占52%［1］。2016年全球卵巢癌新發病例約20 000例，死亡病例約14 000例，其5年生存率只有46.2%，并且超過60%的卵巢癌患者在就診時已處于晚期［2］。2003—2007年我國卵巢癌發病率為8.28/10萬，死亡率為3.31/10萬。我國女性卵巢癌的發病率和死亡率逐年升高，卵巢癌嚴重威脅著婦女的健康［3］。

目前治療卵巢上皮性腫瘤的標準策略是細胞減滅術輔以鉑類藥物為基礎的化療［4-5］。雖然卵巢癌的診斷和治療手段不斷進步，但是晚期卵巢癌患者的5年生存率沒有明顯提高［2］。卵巢癌死亡率高的主要原因是腫瘤耐藥［6］。有研究表明，在發生耐藥的患者中，有1/3接受過鉑類藥物為基礎的化療，幾乎所有的復發性卵巢腫瘤對鉑類藥物產生耐藥［7］。由于耐藥性的產生顯著降低了卵巢癌患者的生存率，當今迫切需要發現能降低耐藥發生率的治療方法。

德國生物化學和生理學家Warburg［8］首次報道了腫瘤細胞比正常細胞有更高的葡萄糖消耗率和較少的氧氣消耗率。進一步研究表明，即使在氧氣供應充足的條件下，腫瘤細胞糖酵解代謝同樣明顯活躍。這種在腫瘤細胞中特有的有氧糖酵解現象稱之為Warburg效應［9-10］。隨著分子生物學技術的發展，研究發現腫瘤細胞葡萄糖的攝取和糖酵解維持在較高水平是腫瘤選擇性的改變。調節糖酵解途徑流量最重要的是6-磷酸果糖激酶-1的活性。6-磷酸果糖激酶-1是一個四聚體，受多種變構效應劑的影響。1,6-二磷酸果糖是6-磷酸果糖激酶-1的變構激活劑。果糖雙磷酸酶-1(fructose-1，6-bisphosphatase，FBP1)用于催化1,6 -二磷酸果糖水解為6-磷酸果糖和磷酸鹽［11］，從而抑制細胞的糖酵解。

在哺乳動物體內，FBP1廣泛表達在不同的組織中［12］。最新的研究表明，FBP1在腫瘤的發生、發展中起著關鍵作用。在胃癌、肝細胞癌、結腸癌、乳腺癌及肺癌中，FBP1普遍存在低表達，且其低表達是患者預后不良的因素［13-14］。FBP1表達下降的主要機制是啟動子區域甲基化［13-18］。FBP1表達下調可引起細胞內一系列的反應，包括引起腫瘤細胞對葡萄糖的敏感性和攝取率增強，糖酵解增加而氧化磷酸化水平下降，ROS產生增加以及引起腫瘤干細胞數量的增加［16］。除此之外，除了能直接抑制腫瘤細胞的糖酵解外，FBP1還能通過與缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1，HIF)抑制結構域直接相互作用從而抑制細胞增殖［19］。

目前，對糖代謝中的關鍵酶FBP1在卵巢癌化療中功能的研究國內外尚未見報道。本研究旨在探索FBP1的表達在卵巢癌臨床標本與化療藥物敏感性的關系，以探討糖代謝中關鍵基因FBP1在卵巢癌化療增敏中作為分子靶點的價值及其機制，為建立新的分子靶向治療聯合化療模式提供重要依據。

1 材料和方法

1.1 組織樣本及主要試劑

組織芯片取材于在2008年3月—2012年3月之間在復旦大學附屬腫瘤醫院診治的根據2014年國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期為Ⅰ～Ⅳ期209例卵巢癌標本，其中包括高級別漿液性腺癌113例以及透明細胞癌96例。所有患者均行以鉑類藥物為基礎的輔助性化療。組織標本用4%的甲醛溶液固定，常規脫水石蠟包埋后制作而成。所有涉及人類受試者的研究均在獲得復旦大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準。免疫組織化學試劑盒購自丹麥DAKO公司。

1.2 免疫組織化學檢測

對每個蠟塊進行切片和H-E染色并標記典型的腫瘤組織。10×12組織芯片(tissue microarray，TMA)是由復旦大學附屬腫瘤醫院組織庫制作，以5 μm厚度連續切片。每點組織結構完整排列整齊，無脫片、缺損現象。FBP1在組織中的表達水平是用針對FBP1的抗體(ab197777，小鼠多克隆抗體，購自英國Abcam公司，1∶200稀釋)在5 μm厚的切片上運用免疫組織化學技術檢測的。每例選取2個不同位置的組織以排除腫瘤的異質性。已知的陽性病例樣本作為陽性對照，非免疫小鼠/兔血清作為陰性對照。由兩名經驗豐富的婦科病理醫師采用雙盲法在顯微鏡下觀察免疫組織化學染色結果，根據細胞染色強度及染色細胞百分率綜合分析評定。根據染色強度分為+～+++，根據細胞核染色百分率分為+(染色細胞數小于10%)、++(染色細胞數10%～50%)和+++(染色細胞數大于50%)。綜合評分為0(+)、1(+～++)、2(++～++++)、3(++++以上)。FBP1蛋白表達為+定義為陰性，++及以上為陽性。

1.3 統計學處理

患者隨訪的時間從開始治療后計算?？偵嫫?overall survival，OS)被定義為從診斷日期開始到癌癥相關的死亡或最后訪問日期。隨訪截止時間為2016年6月。在最后隨訪日期時未進展、失訪或因其他原因死亡視為截尾?；熃Y束后至復發的時間大于6個月被定義為化療敏感，化療結束后至復發的時間小于6個月被定義為化療抵抗。采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。FBP1表達與耐藥的關系采用χ2檢驗或Fisher確切檢驗評估。Kaplan-Meier法估計生存曲線。OS差異比較采用log-rank或者Cox單因素或雙因素回歸檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 FBP1表達與卵巢癌患者臨床病理因素的關系

209例卵巢癌患者中，其平均年齡為55歲(26～79歲)。在組織學上，113例(54%)為高級別漿液性腺癌，96例(46%)為卵巢透明細胞癌(表1)。所有的患者均采用卵巢癌標準治療方案：腫瘤細胞減滅術聯合鉑類和紫杉醇化療。免疫組織化學檢測結果顯示，FBP1在卵巢癌組織中的陽性表達率為49.3%(103/209)(圖1)。采用Cox比例風險模型同時進行單因素及多因素分析評估卵巢癌的預后因素，結果發現殘余腫瘤大小，是否耐藥以及FBP1表達水平是卵巢癌存活的預后因素(表1，圖2，P<0.05)。

表1 卵巢癌患者臨床病理因素、復發與預后的關系Tab. 1 The association between clinicopathological characteristics, recurrence and survival in ovarian cancer patient

2.2 卵巢癌組織中FBP1表達水平與耐藥的關系

采用χ2檢驗或Fisher確切檢驗評估FBP1蛋白表達強度與化療敏感性的關系。結果發現，低表達FBP1的患者比高表達FBP1的患者對鉑類更為耐藥，差異有統計學意義(表2，P<0.05)。以上結果表明，FBP1的表達可能與卵巢癌對化療的敏感性有關，可作為化療敏感性判斷的重要指標。

圖1 FBP1在卵巢癌組織中的表達Fig. 1 FBP1 expressions in ovarian cancer tissues

圖2 通過Kaplan-Meier曲線和對數秩檢驗對FBP1高表達(免疫組織化學評分≥ 2)以及低表達患者生存情況進行分析Fig. 2 Survival curves of patients were analyzed by Kaplan-Meier plots and log-rank tests

表2 FBP1表達與卵巢癌患者臨床病理因素的關系Tab. 2 The relationship between clinicopathological characteristics and FBP1 expression in ovarian cancer patients

3 討 論

FBP1是糖代謝過程中的關鍵酶。近年來，其在腫瘤中的作用越來越受到人們的重視。在多種腫瘤包括結腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌及胃癌中存在FBP1基因的表達缺失，且與腫瘤患者不良的預后有關。造成這種現象的原因是FBP1與腫瘤細胞的Warburg效應有關。Warburg效應是惡性腫瘤的一個常見的代謝特征。然而這種惡性腫瘤細胞對糖酵解的依賴性也成為治療癌癥的機制之一。FBP1可以抑制細胞的糖酵解，從而抑制腫瘤細胞的生長。本研究在卵巢癌組織中探討了FBP1表達與化療敏感性的關系，發現FBP1的表達可能與卵巢癌對化療的敏感性有關，可作為化療敏感性判斷的重要分子。

鉑類藥物耐藥一直是卵巢癌患者治療中存在的問題。目前，尋求一個可以提高鉑類藥物的細胞毒作用的潛在靶點是迫切的。此前，順鉑引起腫瘤細胞死亡的主要機制為細胞內無法修復的斷裂的DNA雙鏈(double-strand break，DSBs)持續積累。然而，最近的研究表明順鉑可發揮抑制腫瘤細胞糖酵解作用。在此基礎上，聯合靶向糖酵解途徑中的分子可以使化療更為有效［20］。在卵巢癌、肺癌，越來越多的證據表明抑制糖酵解可以增強順鉑引起的腫瘤細胞的凋亡［21-22］。本研究發現，FBP1表達相對高的組織和細胞系對鉑類藥物的敏感性更高。因此，在傳統的化療基礎上增強FBP1的表達，可增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷效應，從而提高卵巢癌的治療療效。后續的實驗可以將卵巢癌細胞株FBP1基因沉默或過表達后，觀察卵巢癌細胞對順鉑敏感性的變化，以探討FBP1在卵巢癌化療增敏中作為分子靶點的價值及其機制，為建立新的分子靶向治療聯合化療模式提供重要依據。

［1］ CANNISTRA S A. Cancer of the ovary［J］. N Engl J Med, 2004, 351(24): 2519-2529.

［2］ SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2016［J］. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1): 7-30.

［3］ 楊念念, 嚴亞瓊, 龔 潔, 等. 中國2003—2007年卵巢癌發病與死亡分析［J］. 中國腫瘤, 2012, 21(6): 401-405.

［4］ MCGUIRE W P, HOSKINS W J, BRADY M F, et al. Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage Ⅲ and stage Ⅳ ovarian cancer［J］. N Engl J Med, 1996, 334(1): 1-6.

［5］ PICCART M J, BERTELSEN K, JAMES K, et al. Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatincyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results［J］. J Natl Cancer Inst, 2000, 92(9): 699-708.

［6］ KUMAR S, KUMAR A, SHAH P P, et al. MicroRNA signature of cisplatin resistant vs cisplatin sensitive ovarian cancer cell lines［J］. J Ovarian Res, 2011, 4(1): 17.

［7］ ZAMBLE D B, LIPPARD S J. Cisplatin and DNA repair in cancer chemotherapy［J］. Trends Biochem Sci, 1995, 20(10): 435-439.

［8］ WARBURG O. On the origin of cancer cells［J］. Science, 1956, 123(3191): 309-314.

［9］ VANDER H M, CANTLEY L C, THOMPSON C B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation［J］. Science, 2009, 324(5930): 1029-1033.

［10］ DEBERARDINIS R J. Is cancer a disease of abnormal cellular metabolism? New angles on an old idea［J］. Genet Med, 2008, 10(11): 767-777.

［11］ JURICA M S, MESECAR A, HEATH P J, et al. The allosteric regulation of pyruvate kinase by fructose-1, 6-bisphosphate［J］. Structure, 1998, 6(2): 195-210.

［12］ MARIN-HERNANDEZ A, RODRIGUEZ-ENRIQUEZ S, VITAL-GONZALEZ P A, et al. Determining and understanding the control of glycolysis in fast-growth tumor cells. Flux control by an over-expressed but strongly productinhibited hexokinase［J］. 2006.

［13］ SHENG H, YING L, ZHENG L, et al. Down expression of FBP1 is a negative prognostic factor for non-small cell lung cancer［J］. Cancer Invest, 2015, 33(5): 197-204.

［14］ ZHANG J, WANG J, XING H, et al. Down-regulation of FBP1 by ZEB1-mediated repression confers to growth and invasion in lung cancer cells［J］. Mol Cell Biochem, 2016, 411(1-2): 331-340.

［15］ BIGL M, JANDRIG B, HORN L C, et al. Aberrant methylation of human L- and M-fructose 1,6-bisphosphatase genes in cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 377(2): 720-724.

［16］ DONG C, YUAN T, WU Y, et al. Loss of FBP1 by Snailmediated repression provides metabolic advantages in basallike breast cancer［J］. Cancer Cell, 2013, 23(3): 316-331.

［17］ CHEN M, ZHANG J, LI N, et al. Promoter hypermethylation mediated downregulation of FBP1 in human hepatocellular carcinoma and colon cancer［J］. PLoS One, 2011, 6(10): e25564.

［18］ LIU X, WANG X, ZHANG J, et al. Warburg effect revisited: an epigenetic link between glycolysis and gastric carcinogenesis［J］. Oncogene, 2010, 29(3): 442-450.

［19］ LI B, QIU B, LEE D S, et al. Fructose-1, 6-bisphosphatase opposes renal carcinoma progression［J］. Nature, 2014, 513(7517): 251-255.

［20］ AI Z, LU Y, QIU S, et al. Overcoming cisplatin resistance of ovarian cancer cells by targeting HIF-1-regulated cancer metabolism［J］. Cancer Lett, 2016, 373(1): 36-44.

［21］ LOAR P, WAHL H, KSHIRSAGAR M, et al. Inhibition of glycolysis enhances cisplatin-induced apoptosis in ovarian cancer cells［J］. Am J Obstet Gynecol, 2010, 202(4): 371.

［22］ GUO W, ZHANG Y, CHEN T, et al. Efficacy of RNAi targeting of pyruvate kinase M2 combined with cisplatin in a lung cancer model［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2011, 137(1): 65-72.

Research on the relationship between fructose-1, 6-bisphosphatase and chemosensitivity of ovarian carcinoma

LI Haoran1, LI Mengjiao1, LIU Fei1, WANG Ziliang2, CHENG Xi1

(1.Department of Gynecological Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Department of Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

CHENG Xi E-mail: cheng_xi1@hotmail.com

Background and purpose: Epithelial ovarian carcinoma is the most malignant tumor in female reproductive system because of its resistance to chemotherapy. Fructose-1, 6-bisphosphatase (FBP1) is a rate-limiting enzyme in gluconeogenesis used to catalyze the hydrolysis of fructose-1, 6-bisphosphate to fructose-6-phosphate and inorganic phosphate, thereby inhibiting the effect of glycolysis in tumor cells. This study aimed to investigate the association between the expression of FBP1 and chemosensitivity. Methods: The expression level of FBP1 in ovarian cancer patients was measured by immunohistochemistry. Results: According to the results of immunohistochemistry in 209 ovarian carcinoma specimens, the percentage of positive FBP1 expression was about 49.3% (103/209). Loss of FBP1 was a negative factor of survival (42.6 months vs 62.1 months, P=0.003). Besides, patients who were sensitive to chemotherapy displayed significantly higher scores of FBP1 expression than patients who were resistant to therapy (P=0.007). Conclusion: The rate-limiting enzyme FBP1 in gluconeogenesis can be used as a biomarker for predicting the chemoresistance and prognosis of ovarian cancer patients.

Fructose-1, 6-bisphosphatase; Ovarian neoplasms; Cisplatin; Chemosensitivity

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.05.004

R737.31

A

1007-3639(2017)05-0340-05

2016-11-29

2017-02-10）

國家自然科學基金青年科學基金項目(NSFC1212)。

程 璽 E-mail:cheng_xi1@hotmail.com