術中快速預測乳腺癌非前哨淋巴結轉移模型的建立與驗證研究

張 燕，孫 曉，趙 桐，劉雁冰，邱鵬飛，李盼盼，田崇麟，王永勝,3

1．濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東 濟南 250200；2．山東大學附屬山東省腫瘤醫院乳腺病中心，山東 濟南 250117；3.山東省醫學科學院，山東 濟南 250062

術中快速預測乳腺癌非前哨淋巴結轉移模型的建立與驗證研究

張 燕1,2，孫 曉2，趙 桐2，劉雁冰2，邱鵬飛2，李盼盼1,2，田崇麟1,2，王永勝2,3

1．濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東 濟南 250200；2．山東大學附屬山東省腫瘤醫院乳腺病中心，山東 濟南 250117；3.山東省醫學科學院，山東 濟南 250062

背景與目的：大部分前哨淋巴結(sentinel lymph node，SLN)陽性而接受腋窩淋巴結清掃術(axillary lymph node dissection，ALND)的患者，腋窩非前哨淋巴結(non-sentinel lymph node，nSLN)并沒有發生轉移，因此準確預測nSLN轉移至關重要。該研究將建立基于分子診斷一步核酸擴增法(onestep nucleic acid amplification，OSNA)的術中快速預測乳腺癌nSLN轉移的模型，以期有效指導乳腺癌后續治療。方法：利用2010年OSNA臨床試驗入組的552例患者中SLN陽性、并接受ALND的103例患者數據，建立基于分子診斷的乳腺癌NSLN轉移的預測模型，并利用2015年OSNA臨床試驗入組的327例患者中61例符合相同條件的患者數據進行驗證。結果：原發腫瘤大小、SLN總腫瘤負荷、SLN陽性數及陰性數是NSLN轉移的四個獨立相關因素，利用這四個因素建立預測列線圖，得出建模組患者的受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線的曲線下面積(area under the ROC curve，AUC)為0.814，驗證組患者的AUC為0.842。利用驗證組61例患者影像學評估的腫瘤大小替代病理大小對本模型進行了驗證，得出AUC為0.838，與模型驗證性AUC相比差異無統計學意義(P=0.740 6)。結論：基于分子診斷的乳腺癌預測nSLN轉移的模型既可以術中快速預測腋窩淋巴結轉移風險，也可以術后常規預測，明顯優于其他預測模型，對后續腋窩的處理及放療靶區勾畫具有更好的指導價值。

乳腺腫瘤；前哨淋巴結活組織檢查；分子診斷技術

前哨淋巴結活檢術(sentinel lymph node biopsy，SLNB)已迅速替代腋窩淋巴結清掃術(axillary lymph node dissection，ALND)，成為臨床腋淋巴結陰性早期乳腺癌的標準處理模式［1-2］。前哨淋巴結(sentinel lymph node，SLN)陽性而接受ALND的患者中，大部分患者腋窩非前哨淋巴結(non-sentinel lymph node，nSLN)并沒有發生轉移，因此，準確預測nSLN轉移風險至關重要。當SLN 1～2枚轉移時，ACOSOG Z0011試驗證實接受保乳手術及全乳房放療的患者可以避免ALND，AMAROS試驗則顯示，腋窩放療與ALND具有相似的區域控制和生存率及更低的上肢水腫發生率［3-4］。臨床實踐中，采取高切線野或者腋窩單獨設野照射主要依據nSLN轉移的概率［5］，因此，對于SLN低腫瘤負荷轉移患者，預測nSLN轉移的風險及其概率對指導后續放療靶區的勾畫同樣極為重要。傳統基于臨床病理指標的nSLN預測模型的預測效能較低，不能滿足臨床的需要。

近年來，敏感性更高的分子診斷優勢逐漸顯現。一步核酸擴增法(one-step nucleic acid amplification，OSNA)采用反轉錄-環狀介導等溫擴增(reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技術進行特定基因細胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)的擴增檢測判定淋巴結是否轉移。本研究將分析OSNA檢測法對nSLN轉移的預測能力，建立乳腺癌術中快速預測NSLN轉移的預測模型，以期有效指導乳腺癌后續治療。

1 資料和方法

1.1 受試者入選條件

已經確診為乳腺癌的女性患者，符合SLNB適應證。本研究已得到醫院倫理委員會的批準和患者的知情同意。

1.2 SLN的處理

本研究采用聯合99mTc標記的硫膠體和亞甲藍的方法進SLNB。若SLN質量為100～ 1 200 mg，則垂直于短軸進行切分：短軸長度小于等于4.0 mm時，切分為2枚組織塊，1枚組織塊術中行OSNA檢測，另l枚術后行病理檢測；短軸長度大于4.0 mm時，切分為4枚組織塊，奇數組織塊術中行OSNA檢測，偶數組織塊術后行病理檢測。

1.3 OSNA檢測

對同一淋巴結的送檢組織塊進行勻漿，應用樣本處理液(Lynorhag)從組織勻漿液中進行RNA提取，應用CK19核酸檢測試劑盒(Lynoamp BC)在基因擴增分析儀RD-100i(購自日本Sysmex公司)中進行檢測，且每次檢測均包括嚴格的質控。檢測結果++、+均判定為SLN陽性(分別代表CK19 mRNA擴增量大于等于5 000個/μL，拷貝數為250～5 000個/μL。CK19 mRNA擴增量小于250個/μL則被判定為SLN陰性。每例患者的總腫瘤負荷(total tumor load，TTL)為所有陽性淋巴結的CK19 mRNA拷貝值之和。

1.4 病理檢測

采用間隔為200 μm逐層切片H-E染色，切片的厚度為4～6 μm，每個組織塊取3張切片。采用的標準為第7版美國癌癥聯合委員會(American Joint of Cancer Conference，AJCC)腫瘤分期［6］的診斷標準，大于等于2.0 mm的轉移灶定義為宏轉移，0.2～2.0 mm的轉移灶定義為微轉移，以上轉移灶定義為SLN陽性。

1.5 預測NSLN轉移模型的指標選擇

綜合傳統模型［7-13］，選取年齡、原發腫瘤大小、脈管浸潤、組織學分類、腫瘤分級、SLN陽性數/SLN總數、最大轉移灶大小、SLN陽性數、SLN陰性數、ER、PR及HER-2等因素，并將本研究中的SLN TTL作為指標之一，建立后續預測模型。

1.6 統計學處理

應用SPSS 17.0進行統計分析。通過單因素相關分析及Logistic多因素回歸分析得出與nSLN轉移相關的獨立因素(為避免統計過程中數據非線性因素的影響，TTL數據取Log形式進行分析)，α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。參照紀念斯隆-凱特琳癌癥中心 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，MSKCC)模型建立方法［7］，建立預測nSLN轉移的列線圖，利用ROC曲線評估該列線圖預測nSLN轉移的靈敏度與特異度，并應用MedCalc 15.8軟件進行ROC曲線分析。其中，依據Logistic多因素回歸分析結果，建立預測nSLN轉移發生風險概率的Logistic回歸模型，Logistic回歸方程為Logit(P)=1/1+exp［-(-4.89+0.48X1+0.567X2+1.081 X3-0.661X4)］(其中P表示nSLN轉移發生風險的預測值，X1表示Log(TTL)，X2表示腫瘤大小(cm)，X3表示SLN陽性數目，X4表示SLN陰性數目)，依據回歸方程公式應用Rstat 3.3.3軟件，建立列線圖模型。

2 結 果

2.1 臨床病理特征

本研究入組患者的臨床病理學特征見表1。2010年OSNA臨床試驗(注冊號：NCT01136369)共入組患者552例，103例患者SLN陽性并接受ALND納入本次研究的建模數據組。因國家食品藥品監督管理總局要求該臨床試驗入組患者需足1 000例，于2015年準予再次開展OSNA臨床試驗，目前本中心共入組患者327例，61例患者SLN陽性并接受ALND納入本次研究的驗證數據組。本研究中術中快速冰凍病理及印片細胞學檢查，二者或任一陽性即作為SLN陽性并行ALND。入組患者均為OSNA結果陽性，且術中冰凍或印片結果陽性的患者。

表1 入組患者臨床及病理特征Tab. 1 Clinicopathologic characteristics of the enrolled patient

續表

2.2 建立基于分子診斷預測nSLN轉移的列線圖模型

按照本預測模型選取的指標，對建模組103例患者進行單因素分析，發現原發腫瘤大小(P=0.001)、脈管浸潤(P=0.007)、TTL(P=0.000)、最大轉移灶大小(P=0.000)、SLN陽性數(P=0.000)、SLN陰性數(P=0.000)及SLN陽性數/SLN總數(P=0.000)均與nSLN轉移相關，而年齡(P=0.940)、組織學分類(P=0.993)、腫瘤分級(P=0.300)、ER(P=0.074)、PR(P=0.073)及HER-2(P=0.695)均與nSLN轉移無關。對有統計學意義的因素進一步行Logistic多因素回歸分析，發現TTL(P=0.002)、原發腫瘤大小(P=0.013)、SLN陽性數(P=0.000)及SLN陰性數(P=0.001)是nSLN轉移的獨立相關因素，依據MSKCC列線圖建立方法，利用TTL、原發腫瘤大小、SLN陽性數及SLN陰性數建立預測乳腺癌nSLN轉移的列線圖模型(圖1)。并利用所建模型得出建模組患者NSLN轉移預測值的ROC曲線的AUC為0.814(圖2)。

2.3 本模型的預測性驗證研究

為了進一步驗證本模型的準確性，我們利用驗證組61例符合本研究條件的患者對建立的預測模型進行了驗證，得出ROC曲線的AUC為0.842(圖2)。

圖1 基于術中分子診斷預測NSLN轉移列線圖Fig.1 Nomogram to predict likelihood of NSLN metastases based on intraoperative molecular diagnosis

圖2 本模型建模組及驗證組患者NSLN轉移預測值的ROC曲線Fig.2 ROC curve of the prediction model for the training cohort and the validation cohort

2.4 影像學評估的腫瘤大小與原發腫瘤大小對模型預測性差異的比較

本模型的四個建模因素除原發腫瘤大小外其余數據均可在術中獲取，為實現術中快速預測nSLN轉移風險，本研究利用驗證組61例患者影像學(超聲、鉬靶、乳腺磁共振)評估的腫瘤大小數據替代術后病理評估的原發腫瘤大小數據，對模型進行了驗證，得出ROC曲線的AUC為0.838，與前述驗證性ROC曲線的AUC相比差異并無統計學意義(P=0.740 6)。

2.5 本模型對腋窩淋巴結分期為pN1、pN2及以上患者的預測性研究

本研究共入組164例患者，其中121例患者腋窩淋巴結分期pN1，43例患者腋窩淋巴結分期大于等于pN2，為探究本模型對患者腋窩淋巴結1～3枚轉移及大于等于4枚淋巴結轉移的預測能力，利用本模型得出患者pN1及大于等于pN2的預測風險臨界值為45.4%，ROC曲線的AUC為0.861(P<0.000 1)。另外，為探究術中利用影像學腫瘤大小快速預測腋窩淋巴結分期情況，利用本模型得出驗證組61例患者中pN1及大于等于pN2的預測風險臨界值為33.5%，AUC為0.839(P<0.000 1)。

2.6 本模型與傳統預測模型的驗證性比較

我們將本模型與傳統的預測模型進行了比較，傳統模型以MDA及Tenon模型為代表，利用建模組及驗證組的164例患者分別對其進行了驗證，得出AUC分別為0.745及0.623(圖3)。

圖3 本模型及傳統模型的驗證性ROC曲線Fig. 3 ROC curve of our model and the traditional models

3 討 論

以往認為，SLN陰性時，不必行ALND，SLN陽性時，ALND仍是標準處理模式。近期發表的兩項前瞻性研究的結果在一定程度上改變了這一觀點，目前認為，臨床腋淋巴結陽性患者或者SLN轉移超過2枚時，無論接受保乳手術還是乳房切除手術，仍應進行ALND。而對于腋窩低腫瘤負荷轉移的接受保乳手術的乳腺癌患者，不需要進一步的腋窩處理，對于接受乳房切除術患者，腋窩放療是ALND可以接受的優選替代。因此，ALND是上述兩項研究標準(Z0011+AMAROS)之外的SLN轉移患者的標準治療方案，對于SLN轉移(更重要的是Z0011+AMAROS研究標準之外SLN轉移)患者，預測nSLN是否轉移，從而避免ALND的預測模型具有十分重要的臨床意義。然而，有20%～60%的患者腋窩nSLN并沒有發生轉移，這部分患者接受了過度治療，并沒有從ALND中獲益［14-18］。因此，外科醫師對nSLN轉移預測模型的需求較大，需要通過模型的預測情況指導后續腋窩手術治療。

放療科醫師也越來越看重nSLN預測模型的應用價值。2016年乳腺癌NCCN指南指出［19］，接受乳房切除術和保乳手術的乳腺癌患者，腋窩淋巴結1～3枚轉移時推薦行胸壁+鎖骨上下區域放療，強烈建議內乳區淋巴結放療(ⅡA類證據)，腋窩淋巴結4枚以上轉移時推薦行胸壁+鎖骨上下區域+內乳區淋巴結放療(Ⅰ類證據)。因此，腋窩淋巴結分期pN1及大于等于pN2患者的局部區域治療是不同的，nSLN預測模型的應用可以指導放療醫師更精確的勾畫放療靶區。因此，對于SLN低腫瘤負荷轉移患者，預測NSLN轉移的風險對指導后續放療靶區的勾畫同樣極為重要。

世界各地的研究者均在不斷探索預測nSLN轉移的風險的模型，已經建立的模型包括MSKCC、Tenon、MD Anderson(MDA)、Mayo、Cambridge、Stanford、Helsinki等，各模型特征見表2。其中一些模型已應用于臨床［20］。一項薈萃分析結果顯示，Tenon及Stanford模型的預測準確性受SLN腫瘤負荷的影響較大，而MSKCC及Cambridge模型預測nSLN轉移的穩定性較好［21］。2015年圣安東尼奧乳腺癌大會上，Jay Harris教授指出雖然MA20和EORTC22922/10925研究結果都證實了區域淋巴結放療對中等復發風險者可顯著改善無病生存，但考慮到區域淋巴結放療帶來包括放射性肺炎和上肢淋巴水腫的損傷顯著增加，對低負荷SLN陽性者，推薦采用MDA列線圖來評估nSLN陽性概率，若不超過25%～30%，推薦采用高位切線野，若高于此概率，則考慮采用腋窩放療［22］。但傳統預測模型存在以下缺陷：① 均采用SLN病理診斷方法，但不同機構SLN病理診斷的方法存在很大差異，缺乏統一標準。② 術中快速冰凍病理檢測只取淋巴結的單層或有限幾個層面進行檢測，存在嚴重取樣誤差。術后對復雜的三維腫瘤進行二維切片常規病理檢測也很難獲得SLN最大轉移灶大小的準確診斷。③ 傳統模型的建立基于術后病理信息，包括原發腫瘤大小、多灶性和脈管浸潤等因素，因此無法做到術中應用傳統模型指導后續的腋窩手術方式，只能依據術后病理情況再評估腋窩淋巴結狀況。這些缺陷大大限制了傳統腋窩nSLN轉移預測模型的臨床應用。

表2 各傳統預測模型的特征Tab. 2 Characteristics of different traditional models

OSNA技術是基于RT-LAMP原理檢測CK19在SLN中的表達。CK19是上皮性細胞的標志基因，可作為乳腺癌在淋巴結、外周血等間葉組織轉移的標志物，此法利用半定量結果檢測并區分淋巴結的微轉移灶及宏轉移灶。傳統的病理診斷只能評估小于5%的淋巴結組織，而OSNA可對100%的淋巴結組織進行檢測，顯著降低了取樣誤差，并且普通實驗室人員可以在40 min內完成檢測［23］。OSNA作為一種客觀標準化技術，可以術中快速、準確的診斷SLN，顯著降低了病理醫師的主觀性和工作負擔。建立基于術中分子診斷預測nSLN轉移的模型，可彌補傳統預測模型的不足。

綜上所述，基于術中分子診斷技術的nSLN轉移預測模型既可以術中進行快速預測，及時指導后續腋窩手術方式，也可以依據術后病理結果進行預測，有助于臨床中明確患者放療靶區勾畫，加強區域控制。

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A nomogram for the intraoperative prediction of non-sentinel lymph node metastasis in breast cancer patients

ZHANG Yan1,2, SUN Xiao2, ZHAO Tong2, LIU Yanbing2, QIU Pengfei2, LI Panpan1,2,TIAN Chonglin1,2, WANG Yongsheng2,3
(1. School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan and Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250200, Shandong Province, China; 2. Breast Cancer Center, Shandong Cancer Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250117, Shandong Province, China; 3. Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, Shandong Province, China)

WANG Yongsheng E-mail: wangysh2008@ aliyun.com

Background and purpose: When patients have positive sentinel lymph node (SLN), axillary lymph node dissection (ALND) is usually performed, but most of them have no metastasis in the non-sentinel lymph node (nSLN). It is of great significance to predict metastasis of nSLN precisely. The aim of the study was to establish a nomogram for the intraoperative prediction of nSLN metastasis in breast cancer patients using one-step nucleic acid amplification (OSNA) techniques and to direct the subsequent therapy for breast cancer effectively. Methods: Of 552 breast cancer patients who underwent SLN biopsy in the 2010 OSNA clinical trial, 103 with SLN metastasis treated with ALND were assessed to establish a nomogram for intraoperative prediction of nSLN based on the moleculardiagnosis. A validation cohort of 61 patients who met the similar criteria in the 2015 OSNA clinical trial subsequently validated it. Results: Primary tumor size, total tumor load, the number of positive SLNs and negative SLNs were associated with the presence of nSLN metastasis based on the multivariable logistic regression results, and a nomogram was established with these variables. Its area under the ROC curve was 0.814 for the predictive model and it was 0.842 in the re-validation cohort. The tumor size assessed by the postoperative histological examination was replaced by the size evaluated by the imaging examination, and the area under the ROC curve was 0.838. There was no statistically significant difference in the accuracy compared with the former validation data (P=0.740 6). Conclusion: The predictive nomogram based on the molecular diagnosis can predict the nSLN metastases intra/post-operatively. It appears to be obviously superior to other predictive models and may help to guide the axillary management and to make decisions about radiation target region.

Breast cancer; Sentinel lymph node; Molecular diagnostic techniques

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.05.008

R737.9

A

1007-3639(2017)05-0368-08

2017-01-10

2017-03-30）

國家自然科學基金(81502314)；國家自然科學基金(81672638)。

王永勝 E-mail：wangysh2008@ aliyun.com