RP—HPLC法同時測定人血清中奧氮平和富馬酸喹硫平濃度

劉威+曹敏娟+尚翔+姚樹永?í?

【摘要】目的：建立同時測定人血清中奧氮平、富馬酸喹硫平濃度的高效液相色譜法。方法：血清樣品以乙醚進行提取并測定，Hypersil C18反相柱 （150mm×46mm， 5μm）為色譜柱，流動相為25mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH60，內含05%三乙胺）-乙腈（65∶35，V/V），流速為10mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為254nm。結果：奧氮平在100～2500μg、富馬酸喹硫平在500～10000μg范圍內峰面積與濃度呈良好線性關系；奧氮平、富馬酸喹硫平的低、中、高3種濃度相對平均回收率分別為1033%、1008%、987% 和975%、982%、1011%，日內、日間RSD均低于10% （n=5）。奧氮平和富馬酸喹硫平的檢測限均為50μg/L。結論：該方法靈敏、準確，可用于臨床奧氮平和富馬酸喹硫平的血藥濃度監測。

【關鍵詞】高效液相色譜法；奧氮平；喹硫平；血藥濃度

【中圖分類號】R9141【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）11-0036-03

RP-HPLC Method for the Determination of Human Plasma of Olanzapine and Quetiapine Concentration

LIU WeiCAO MinjuanSHANG XiangYAO Shuyong

Suzhou Psychiatric Hospital， Suzhou 215000，China

Objective To establish a method for determination olanzapine and quetiapine in human serum by RP-HPLC.Methods The analytes were extracted after serum samples had been alkalinized. The HPLC separation of the analytes was performed on a reversed-phase Hypersil C18 column，using 25mmol·L-1 phosphat buffer （pH60，containing 05% triethylamine）-acetonitrile （65∶35， V/V） as mobile phase， with a flow-rate of 10mL·min-1 anda detective wavelength of 254nm.The temperature of the column was 40℃.Results The calibration curves were linear in the ranges of 100～2500μg·L-1 for olanzapine， 500～10000μg·L-1 for quetiapine respectively. The relation of peak area and concentration showed linear in the range of the average recoveries of olanzapine and quetiapine at high，middle and low concentrations were 1033%、1008%、987% and 975%、982%、1011% respectively. The intra-day and inter-day variations RSD were less than 10% （n=5）. The minimum detectable concentration of both olanzapine and quetiapine were 50μg·L-1.Conclusion The method is accurate， sensitive and simple for routine therapeutic drug monitoring （TDM） and for the study of the pharmacokinetics of olanzapine and quetiapine.

RP-HPLC ； Olanzapine ； Quetiapine ； Serum Drug Concentration

奧氮平（Olanzapine）和富馬酸喹硫平（Quetiapine Fumarate）均為新型非典型抗精神病藥[1]。奧氮平屬于5-羥色胺（5-Hydroxy Tryptamine，5-HT）和多巴胺（Dopamine，DA）受體拮抗劑，能改善腦內多種神經通路功能，對于改善精神分裂癥的陽性和陰性癥狀均有明顯效果[2]。富馬酸喹硫平的化學結構與奧氮平相似，屬二苯二氮類衍生物，為腦內多種神經遞質受體拮抗劑，主要作用于中樞多巴胺D1、D2和5-HT1、5-HT2等受體[3]。臨床上，奧氮平和富馬酸喹硫平常聯合用于治療復雜的精神分裂癥[4-5]。由于精神藥物血藥濃度具有個體差異性大、安全范圍窄等特點，因此進行血藥濃度監測是十分必要的。近年來，檢測奧氮平與喹硫平血藥濃度的方法主要有高效液相電化學法（HPLC-ECD）、高效液相-質譜法（HPLC-MS）等[6-8]。但尚未見采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定奧氮平和喹硫平血藥濃度的文獻報道。因此，實驗建立一種同時測定奧氮平和喹硫平血藥濃度的高效液相色譜法，該方法靈敏、準確，為臨床用藥提供依據，節約分析時間。

1儀器與試劑

11儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（包括G1314F紫外檢測器、G1316A柱溫箱、G1329B自動進樣器、G1311C多元泵、G1322A真空脫氣機、Agilent Chem32化學工作站）；KS-120D型超聲波清洗機（新芝儀器廠）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；電子分析天平（美國OHAUS）。

12材料奧氮平（批號：100948-201501）、富馬酸喹硫平（批號：100815-201202）、阿米替林（批號100518-201303）對照品均源于中國食品藥品檢定研究院。奧氮平（批號：160204，江蘇豪森藥業股份有限公司）；喹硫平（批號：B151133，湖南洞庭藥業股份有限公司）。

空白血清由蘇州市廣濟醫院血站提供。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結果

21色譜條件色譜柱：Hypersil ODS柱（150mm×46mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH60，內含05%三乙胺）-乙腈（65∶35.V/V），使用045μm微孔濾膜負壓過濾；流速：10mL/min；檢測波長：254nm，柱溫：40 ℃；進樣量：20μL。

22對照品和內標溶液配制精密稱取奧氮平對照品與喹硫平對照品各1mg，分別置于10mL量瓶，加甲醇溶解并定容，得到質量濃度為 01mg/mL的對照品溶液置冰箱4℃保存。臨用時用甲醇稀釋成所需濃度的奧氮平與喹硫平對照品溶液。精密配制濃度為 2mg/L阿米替林甲醇溶液作為工作內標液。

23樣品處理方法取含奧氮平和喹硫平的血清樣品1mL，加內標10μL（2mg/L阿米替林），并加入25%維生素C溶液10μL及10mol/L氫氧化鈉溶液02mL，快速震蕩數秒。加入乙醚4mL提取，在旋渦混合器上渦旋2min，靜置1h，取出醚層，置尖底試管中，于30℃水浴至干。殘渣用100μL流動相復溶，取20μL進樣分析。

24色譜分離情況在本實驗條件下，空白血清、奧氮平與喹硫平對照品血清，以及精神病患者服藥后的血清樣品，經高效液相色譜分析法測定，得到的色譜圖見圖1。由圖1可知，奧氮平、喹硫平和阿米替林內標物的色譜峰能夠完全分離。奧氮平、阿米替林和喹硫平的保留時間為47min、58min、83min。

25標準曲線的制備在7個具塞的離心管中分別加入空白血清10mL，再分別加入不同濃度、相同體積的奧氮平和喹硫平對照品溶液和內標物阿米替林，振蕩數秒，使血清奧氮平濃度分別為10、20、40、80、100、125、250μg/L，喹硫平為50、100、200、400、500、800、1000μg/L。然后按照“23”項處理后，經高效液相色譜分析，測得奧氮平和喹硫平峰面積 （Ai）， 內標物峰面積As， 以Ai/As比值為橫坐標，以血清樣品所對應其各點濃度為縱坐標繪制標準曲線，經最小二乘法線性回歸，得到奧氮平10～250μg，喹硫平50～1000μg范圍的血清濃度標準曲線。奧氮平的標準曲線回歸方程為C=03117Ai/As-32145 （r=09972），喹硫平的標準曲線回歸方程為C=02066Ai/As+21861 （r=09995）。當信噪比（S/N）=3時，奧氮平與喹硫平的檢測定量下限可達到5μg/L。

26回收率與精密度實驗取奧氮平質量濃度為10、80、250μg/L的含藥血清樣品，喹硫平質量濃度為50、400、800μg/L的血清樣品，經色譜分析，得到的相對回收率均大于90%。同時在1d內重復5次和2周內重復5次測定濃度，計算日內、日間誤差和回收率。結果表明，該方法符合生物樣品分析要求。見表1。

27[JP+1]穩定性試驗按“23”項下方法配制奧氮平質量濃度為10、80、250μg/L，喹硫平質量濃度為 50、400、800μg/L的血清樣品共18份（1式3份），分別考察室溫放置4h、4℃冰箱放置24h、-20℃冰箱凍存1周后的穩定性，分別進行色譜分析。結果未見凍存樣品的藥物降解，RSD均<15%。[JP]

28樣品的質量控制實驗按照“23”項的方法分別配置奧氮平（10、80、250μg/L）和喹硫平（50、400、800μg/L）血清樣品共36個血清樣品（1式6份），置于-20℃凍存備用為質控樣品。每次檢測血樣時同時檢測質控樣品，如果相對回收率均落在85%～115%之內即可認為檢測正常，否則須檢查整個操作過程及儀器原因。

29患者血樣測定1例男性精神病患者，口服奧氮平15mg/d和喹硫平400mg/d。2周后早晨服藥前空腹采血檢測其血清藥物濃度。結果奧氮平為613μg/L，喹硫平為3102μg/L。

3討論

奧氮平和喹硫平結構中都有苯環，紫外吸收明顯。奧氮平與喹硫平對照品溶液在190～400nm的波長范圍內進行紫外掃描，發現喹硫平和奧氮平在254nm處均有強吸收峰，因此本實驗選擇254nm作為最佳檢測波長。

本實驗考察了不同柱溫（25～40℃）、不同流速 （08～15 mL/min）、不同pH磷酸鹽緩沖液（40、60、686）的流動相系統，結果表明柱溫為40℃、流速為10mL/min、流動相為磷酸鹽緩沖溶液（pH60）-乙腈（65∶35）時，柱效較高，主藥峰與雜質峰能夠有效地分離。實驗過程中分別使用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷為提取劑，發現乙醚的提取率最高，所取血清1mL，進樣量20μL可達到實驗要求，提高了靈敏度，避免樣品雜質的干擾，可達到分析目的。奧氮平在儲存和提取中易被空氣氧化，因此加入維生素C作為抗氧劑。

奧氮平和喹硫平血藥濃度具有治療窗窄、個體差異大等特點，因此進行血藥濃度監測是必要的[9]。單獨檢測奧氮平和喹硫平藥物血藥濃度已有報道[6-8]，但還未見使用高效液相色譜法同時測定這兩種藥物的報道。實驗建立了人血清中奧氮平和喹硫平同時測定的方法，準確、靈敏并能滿足臨床需要，可以用于臨床藥物監測。

參考文獻

[1]GOBBI G， COMAI S， DEBONNEL G.Effects of quetiapine and olanzapine in patients with psychosis and violent behavior： a pilot randomized， open-label， comparative study[J].Neuropsychiatr Dis Treat， 2014 （10）：757-765.

[2]袁道瑞，張向榮，陸蓉，等. 精神分裂癥患者血脂水平對奧氮平血漿藥物濃度的影響[J].四川精神衛生，2015（4）：310-313.

[3]PLOSKER GL.Quetiapine： a pharmacoeconomic review of its use in bipolar disorder[J].Pharmacoeconomics， 2012 ， 30（7）：611-631.

[4]張靜，閩國慶. 奧氮平聯合富馬酸喹硫平治療精神分裂癥的臨床觀察[J]. 中國藥房，2016 （9）： 1173-1176.

[5]付永強.奧氮平聯合富馬酸喹硫平治療精神分裂癥的療效觀察[J].醫學理論與實踐，2017， 30（2）.

[6]ZHENG Q， WANG F， LI H， et al.Quantitative analysis of olanzapine in rat brain microdialysates by HPLC-MS/MS coupled with column-switching technique[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2012（905）：127-132.

[7]李文標，王傳躍，翟屹民，等.國產與進口奧氮平片的人體藥動學及生物等效性[J]. 中國新藥雜志，2005，14（5）： 599-602.

[8]李坤艷，李煥德. HPLC-MS/ESI～+測定人血漿中喹硫平及其代謝產物[J]. 中南藥學，2006， 4 （2）： 88-91.

[9]HIEMKE C， BAUMANN P， BERGEMANN N， et al. AGNP Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in Psychiatry： Update 2011[J]. Pharmacopsychiatry， 2011， 44（6）： 195.

（收稿日期：2017-04-01編輯：梁志慶）