重構Ⅰ型膠原聯合聚天冬氨酸在仿骨生物礦化中的應用

張 展，張 春，郭峭峰，馬茍平，沈立峰，俞華軍，林炳遠，魯 寧，黃 凱

浙江省立同德醫院骨科，杭州 310012

?

·論 著·

重構Ⅰ型膠原聯合聚天冬氨酸在仿骨生物礦化中的應用

張 展，張 春，郭峭峰，馬茍平，沈立峰，俞華軍，林炳遠，魯 寧，黃 凱

浙江省立同德醫院骨科，杭州 310012

目的 重構Ⅰ型膠原聯合聚天冬氨酸制備仿生物骨。方法 采用酸解方法將鼠尾Ⅰ型膠原蛋白分解成原膠原纖維，然后置于鈣磷礦化液中，在戊二醛交聯下，重構組裝成膠原纖維，并將鈣磷晶體包裹在膠原纖維內部進行生物礦化。加入聚天冬氨酸，促進羥基磷灰石鈣前體滲入膠原纖維內部，模仿人體內的骨生物礦化。礦化3 d和9 d，采用透射電子顯微鏡和電子衍射觀察骨生物礦化過程。結果 透射電子顯微鏡和電子衍射結果顯示，礦化3 d，羥基磷灰石鈣前體被包裹在膠原纖維內部，膠原纖維部分礦化；礦化9 d，羥基磷灰石前體完全滲入膠原蛋白纖維內部，其無定型磷酸鈣狀態最終轉變成羥基磷灰石晶體，從而模擬完成骨生物礦化，形成Ⅰ型膠原蛋白/羥基磷灰石鈣的仿生骨材料。結論 重構Ⅰ型膠原聯合聚天冬氨酸可制備出與人類自體骨組織化學成分和分子結構接近的仿生骨材料。

Ⅰ型膠原；重構；聚天冬氨酸；生物礦化

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：318-323

隨著社會經濟的發展，高速公路車禍、廠礦重大事故等高能量損傷導致的四肢粉碎性骨折越來越多，此類患者往往伴隨骨缺損，選擇適當的骨修復材料是治療骨缺損的中心環節，目前一般采用自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨移植。由于自體骨移植和同種異體骨移植均來自人類自身骨組織，數量有限。因此，為解決這一問題，國內外學者進行了大量的骨組織工程學研究，期待通過人工骨替代人類自體骨組織，如半水硫酸鈣、磷酸三鈣等多種骨陶瓷材料[1- 2]。然而，上述人工骨材料，無論是組織相容性，還是成骨生物活性，都比不上人類自身骨組織。這是因為，人類自身天然骨組織是由有機大分子Ⅰ型膠原蛋白和無機礦物質羥基磷灰石晶體生物礦化組成[3]。而上述人工骨材料無論化學成分，還是分子結構，均與人類自身天然骨組織相去甚遠。所以，研發與人類自體骨組織化學成分、分子結構接近的骨移植材料顯得尤為重要。天然骨組織是以Ⅰ型膠原蛋白為模板，羥基磷灰石晶體沿著Ⅰ型原膠原纖維生物礦化而成[4]。但是，原膠原纖維之間的間隙非常狹小，相鄰平行排列纖維的間距只有0.24 nm[5]，羥基磷灰石晶體要鑲嵌入如此狹小的原膠原纖維間隙進行礦化非常困難。本研究擬采用酸解方法將鼠尾肌腱分解成Ⅰ型原膠原纖維，將其置于鈣磷礦化液和交聯劑戊二醛中進行交聯重構和生物礦化，Ⅰ型原膠原纖維在重構組裝成Ⅰ型膠原纖維的同時，將羥基磷灰石鈣前體包裹在重構后的Ⅰ型膠原纖維內部，并加入聚天冬氨酸，通過聚天冬氨酸促進羥基磷灰石鈣前體再滲入膠原纖維內部，模仿骨生物礦化，以期制備一種與人類自體骨組織化學成分和分子結構接近的仿生骨材料。

材料和方法

主要材料和試劑 鼠尾、鹽酸、1.67 mmol/L CaCl2溶液25 ml、9.5 mmol/L Na2HPO4溶液25 ml、400 mg/ml谷氨酸、0.05%戊二醛均購自上海阿拉丁科技股份有限公司，10 mg/ml聚天冬氨酸[(C4H5NO3)N：相對分子質量9 000～11 000]購自成都艾科達化學試劑有限公司。

酸解鼠尾Ⅰ型膠原的制備和檢測 超凈臺操作取大鼠鼠尾洗凈，75%酒精浸泡5 min；剪開，去掉皮毛，剪成小段，抽出銀色肌腱，置于平皿中，滅菌生理鹽水浸泡；在平皿中剪碎，按每克尾鍵50 ml比例加入0.1%醋酸溶液，搖晃，將尾腱分散于醋酸溶液中，4℃放置1周；4000 r/min(r=8 cm)離心20 min，在醋酸溶液的酸解下，尾腱可水解成膠凍狀凝膠。取酸解膠原蛋白上清液20 μl加入4 ml 6×SDS上樣緩沖液，95℃靜置5 min，取10 μl進行SDS-PAGE電泳，檢測酸解鼠尾Ⅰ型膠原的相對分子質量，并檢測膠原蛋白濃度。

Ⅰ型膠原重構及檢測 吸取制備的Ⅰ型膠原10 μl至小培養皿中，滴入0.05%戊二醛2 ml至小培養皿中浸泡膠原進行交聯，將小培養皿置于恒溫箱中靜置24 h。Ⅰ型膠原可在交聯劑戊二醛作用下進行重構，觀察其宏觀形態。

吸取制備的Ⅰ型膠原3 μl滴至鎳網上；在小培養皿中放置合適大小濾紙，用水濕透后，將滴上膠原的鎳網放置在濾紙上；吸取0.05%戊二醛0.5 ml滴至鎳網膠原上，蓋好蓋子，在恒溫箱中靜置24 h。接著將鎳網撈起，放在濾紙上干燥備用。然后將加載膠原的鎳網，經去離子水、50%乙醇、100%乙醇依次漂洗后，放置在透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)下觀察。

仿生骨生物礦化

鈣磷礦化液的配制：取1.67 mmol/L CaCl2溶液5 ml倒入玻璃瓶中，滴加10 mg/ml聚天冬氨酸0.25 ml，再滴加400 mg/ml谷氨酸0.25 ml，然后緩慢倒入9.5 mmol/L Na2HPO4溶液5 ml，形成鈣磷低過飽和溶液，pH值8.5。

膠原纖維重構和生物礦化：取原膠原纖維10 μl浸泡在10 ml鈣磷礦化液中，隨后滴入0.05%戊二醛2 ml進行膠原纖維重構同時進行生物礦化。每隔3 d換液1次，每次都先將舊的礦化液吸出，然后倒入新配置的礦化液。分別靜置3、9 d，使重構膠原蛋白生物礦化，然后觀察其宏觀形態。

TEM觀測和電子衍射：吸取3 μl膠原滴至鎳網上，將加載膠原的鎳網懸浮在10 ml礦化液上，然后滴入0.05%戊二醛2 ml。每隔3 d換液1次，每次都先將舊的礦化液吸出，然后倒入新配置的礦化液。分別靜置3、9 d，采用TEM觀測鎳網上的礦化膠原并進行電子衍射。

結 果

鼠尾Ⅰ型膠原制備情況 鼠尾肌腱在醋酸溶液酸解下，腱性組織被水解成膠凍狀溶液，分解為鼠尾Ⅰ型原膠原蛋白纖維。SDS-PAGE電泳檢測結果顯示，Ⅰ型原膠原蛋白纖維的相對分子質量在130 000～200 000間。膠原蛋白濃度為2.0 mg/ml，pH值為5。

原膠原纖維的重構情況 將酸解鼠尾Ⅰ型原膠原纖維進行重構組裝，原膠原纖維重構成Ⅰ型膠原蛋白纖維，宏觀表現為半透明果凍樣膠體，具有一定生物力學強度，可用鑷子夾起(圖1)。將鎳網上的重構膠原經乙酰雙氧鈾染色30 s，TEM下可見Ⅰ型原膠原纖維重構成的膠原纖維具有特征性明暗間隔周期性條紋結構，即D-Bank結構(圖2)。

圖 1 Ⅰ型原膠原纖維重構成膠原纖維，形成半透明果凍樣膠體

Fig 1 Type Ⅰ collagen fibers constitute the collagen fibers，forming a translucent jelly-like gel

生物礦化情況

生物礦化3 d：膠體顏色逐漸加深至乳白色(圖3)。鎳網上的重構膠原礦化3 d后，TEM下可見Ⅰ型膠原纖維的明暗相隔周期性條紋結構，逐漸模糊；羥基磷灰石鈣前體包裹在膠原纖維內部，膠原纖維部分礦化，羥基磷灰石鈣晶核沿著膠原纖維礦化生長，鼠尾Ⅰ型膠原蛋白纖維忖度變深(圖4)。電子衍射圖結果顯示，礦化早期，膠原纖維內部有磷酸鈣納米顆粒，從圖中衍射環判斷主要是無定型態(圖5)。

TEM：透射電子顯微鏡

TEM：transmission electron microscope

圖 2 TEM下可見，Ⅰ型膠原蛋白重構成膠原纖維，重構后的膠原纖維具有特征性D-Bank結構(×25 000)

Fig 2 TEM shows that typeⅠcollagen fibers constitute the collagen fibers with typical D-Bank structure(×25 000)

圖 3 礦化3 d后，膠體呈微白色

Fig 3 Three days after mineralization，the colloid was slightly white

圖 4 TEM下可見Ⅰ型膠原纖維的D-Bank結構模糊，忖度變深，部分礦化(×10 000)

Fig 4 TEM displays that the type Ⅰ collagen fiber has fuzzy structure and deeper contrast，along with partial mineralization(×10 000)

圖 5 礦化早期，磷酸鈣納米顆粒包裹在膠原纖維內部，從圖中衍射環判斷主要是無定型態

Fig 5 In the early stage of mineralization，calcium phosphate nanoparticles were encapsulated in the inner side of the collagen fiber，the diffraction ring in the graph is mainly in the amorphous state

生物礦化9 d：膠體顏色加深至乳白色(圖6)。鎳網上的重構膠原礦化9 d后，TEM下可見Ⅰ型膠原纖維的明暗相隔D-Bank結構完全消失，鼠尾膠原蛋白纖維內部可見黑色羥基磷灰石晶體，嵌入膠原纖維縱向生長。當鼠尾Ⅰ型膠原纖維完全礦化時，由于整條膠原蛋白纖維都被羥基磷灰石晶體占據，膠原纖維呈現黑色(圖7)。電子衍射圖像結果顯示，膠原礦化已經完成。強的衍射環提示，羥基磷灰石鈣前體已經全部從無定型轉化為結晶態，每個亮環對應1個晶面，依次是002、211、004(圖8)。

圖 6 膠原纖維礦化9 d后，顏色加深至乳白色

Fig 6 After 9 days of mineralization，the color is deepened to milky white

A. 礦化膠原放大20k倍的TEM圖像；B. 礦化膠原放大80k倍的TEM圖像

A. mineralized collagen (×20 000)；B. mineralized collagen (×80 000)

圖 7 TEM下可見Ⅰ型膠原纖維的 D-Bank結構完全消失，羥基磷灰石晶體嵌入膠原蛋白纖維內部縱向生長，忖度加深至黑色

Fig 7 TEM reveals that the D-Bank structure of typeⅠcollagen fibers completely disappeared，the hydroxyapatite crystals were embedded into the collagen fibers and showed longitudinal growth，and the contrast became black

圖 8 膠原的選區電子衍射圖像顯示，礦化9 d后，膠原礦化已經完成；強衍射環結果顯示，磷酸鈣礦物已經從無定型轉化為結晶態，每個亮環對應1個晶面，依次是002、211、004

Fig 8 Selected area of the electron diffraction pattern of collagen reveals that：after 9 days of mineralization，the collagen mineralization was the strong diffraction ring shows that the amorphous calcium phosphate mineral has been transformed into crystalline state；each bright ring corresponds to one crystal plane，which is 002，211，and 004，respectively

討 論

從天然骨組織的生物多級結構來看，它由Ⅰ型膠原蛋白和羥基磷灰石晶體生物礦化而成，其中Ⅰ型膠原蛋白最基本的單位為原膠原纖維，每條原膠原纖維是由3條α多肽鏈組成，相對分子質量為100 000～300 000，每5條原膠原纖維平行排列，組裝成1根膠原微纖維，長300 nm，寬1.1 nm。在同一水平面上，每2條原膠原纖維首尾相接，首尾之間間距40 nm，形成了膠原纖維的空腔區；而上下每2條原膠原纖維錯位1/4.5分子長度，其原膠原纖維重疊的區域形成了重疊區，長度約27 nm，從而形成67 nm具有周期性橫紋的膠原微纖維[6- 7]；在重疊區，相鄰的兩條平行排列原膠原纖維的間距非常小，只有0.24 nm。

增加原膠原纖維間空隙最直接的方法是打開原膠原纖維間的化學鍵聯系，將膠原微纖維水解成原膠原纖維。在這種水解狀態下，原膠原纖維間沒有空間限制，鈣磷礦化液可以肆意地在原膠原纖維上形成羥基磷灰石晶體的晶核。然后再重構膠原蛋白，原膠原纖維一邊組裝成膠原微纖維，一邊將羥基磷灰石晶體前體以及晶核包裹在膠原纖維間隙。接著再進行礦化，羥基磷灰石晶體就能在膠原纖維內充分生長。但是打開原膠原纖維間的化學鍵聯系時，一定要在保持膠原分子三螺旋結構穩定性的前提下進行；因為只有具有三螺旋穩定結構的膠原蛋白分子，才可以通過其α1鏈在N末端肽的第9位置處的醛基與相鄰α2鏈的第930位置處的羥賴氨酸殘基形成Aldol醇醛鍵[9]，從而重疊組裝成Ⅰ型膠原蛋白纖維。故本研究采取的方法是酸解膠原，利用低濃度酸性條件分解膠原分子間的希夫堿鍵和鹽鍵，將失去交聯的原膠原纖維溶解出來提取膠原[10]。因為醋酸可水解膠原分子間的希夫堿鍵和鹽鍵，而且不會破壞Ⅰ型膠原分子的三螺旋結構，可保持Ⅰ型膠原分子的結構穩定性。只要Ⅰ型膠原分子的三螺旋結構仍然存在，原膠原纖維分子經過重構組裝，仍然可以組裝成膠原纖維。本研究結果顯示，經酸解提取的鼠尾Ⅰ型膠原蛋白的相對分子質量在130 000～200 000間，而具有三螺旋結構的Ⅰ型膠原蛋白相對分子質量也在100 000～300 000間，提示本研究酸解的Ⅰ型膠原是符合具有三螺旋結構的Ⅰ型膠原蛋白。此外，TEM下可見經過重構組裝后的酸解Ⅰ型膠原所形成的膠原纖維具有膠原蛋白纖維所特有的D-Bank結構，也從另一個角度證實酸解鼠尾Ⅰ型膠原不影響膠原分子的三螺旋結構，保持了分子結構的穩定性，所以膠原蛋白分子可以重構成Ⅰ型膠原特有的D-Bank結構纖維。

本研究將鼠尾Ⅰ型膠原酸解成原膠原纖維分子后，置于鈣磷礦化液中，然后加入戊二醛交聯進行生物礦化，結果顯示，在礦化早期，TEM下可見羥基磷灰石鈣前體被包裹在膠原纖維內部，膠原纖維部分礦化，羥基磷灰石鈣晶核沿著膠原纖維礦化生長，鼠尾Ⅰ型膠原蛋白纖維忖度變深，膠體的顏色逐漸加深至乳白色。由于在游離的原膠原纖維分子重構組裝成膠原纖維時，隨著原膠原纖維分子間的間隙變小，部分羥基磷灰石前體可被擠出膠原纖維內部。因此為使羥基磷灰石能夠充分礦化到膠原纖維內部，本研究還在鈣磷礦化液中加入高分子聚合物聚天冬氨酸。根據聚合物誘導液晶前體理論，羥基磷灰石晶體最初并不是以固體形成，而是先在膠原蛋白纖維表面形成羥基磷灰石前體，即無定型磷酸鈣(amorphous-calciumphosphate，ACP)。而聚天冬氨酸則可以將ACP穩定在飽含水分子的無定型狀態，由于ACP含有大量水分子，以至于其無定型狀態類似液晶態。類液晶態的ACP能通過毛細管作用，滲入至膠原纖維內部，轉化為沿膠原纖維長軸平行排列的羥基磷灰石晶體[11]。Beniash等[12]通過拉曼光譜也證實，在小鼠牙釉質的生物礦化過程中存在著磷酸鈣晶體的前體，即ACP狀態。同樣，在小鼠顱骨和長骨生物礦化過程中，也發現了ACP；即在骨生長過程中，成骨細胞先釋放出ACP，ACP再透入膠原內部，然后轉化為羥基磷灰石[13]。所以本研究就是通過加入聚天冬氨酸化模仿了天然骨組織的生物礦化。

本研究TEM和電子衍射結果顯示，在剛開始礦化3 d時，膠原纖維是部分礦化的，磷酸鈣礦物以無定型狀態存在。隨著時間推移，生物礦化繼續深入，ACP礦物持續滲入膠原纖維內部；當膠原礦化到第9天時，膠原纖維基本已全部礦化，ACP已經轉化為羥基磷灰石晶體。而羥基磷灰石晶體與膠原纖維之間的生物礦化結合，正是仿生了人類自身骨組織的化學成分和分子結構。

綜上，本研究通過酸解鼠尾膠原，在保證其三螺旋結構穩定性的情況下，打開原膠原纖維之間的分子間隙；一邊將原膠原纖維重構組裝成Ⅰ型膠原蛋白，一邊將鈣磷晶核包裹在膠原內部生物礦化。而且通過加入聚天冬氨酸，將羥基磷灰石晶體穩定在ACP鈣狀態，滲入膠原纖維間隙內部，模擬了人體內骨生物礦化，最后形成Ⅰ型膠原蛋白/羥基磷灰石仿生骨材料。由于此仿生骨材料在化學成分和分子結構接近天然骨組織，有望取代自體骨移植，為其在臨床上進一步應用研究打下基礎。

[1]張展，張春，郭峭峰，等. 載萬古霉素硫酸鈣治療骨髓炎的臨床研究[J].中國醫學科學院學報， 2013，35(3)：337- 342.

[2]王文波，陳中偉，陳統一，等. 自固化磷酸鈣人工骨的最新研究進展[J]. 中國生物醫學工程學報，2001，20(5)：473- 477.

[3]Olszta MJ，Cheng X，Jee SS，et al. Bone structure and formation：A new perspective[J]. Mater Sci Eng R Rep，2007，58(3)：77- 116.

[4]Nudelman F，Lausch AJ，Sommerdijk NA，et al.Invitromodels of collagen biomineralization[J]. J Struct Biol，2013，183(2)：258- 269.

[5]Habraken WJ，Tao J，Brylka LJ，et al. Ion-association complexes unite classical and non-classical theories for the biomimetic nucleation of calcium phosphate[J]. Nat Commun，2013，4(2)：1507- 1518.

[6]Liu Y，Kim YK，Dai L，et al. Hierarchical and non-hierarchical mineralisation of collagen[J]. Biomaterials，2011，32(5)：1291- 1300.

[7]Toroian D，Lim JE，Price PA. The size exclusion characteristics of type Ⅰ collagen：implications for the role of noncollagenous bone constituents in mineralization[J]. J Biol Chem，2007，282(31)：22437- 22447.

[8]Deshpande AS，Beniash E. Bio-inspired synthesis of mineralized collagen fibrils[J]. Cryst Growth Des，2008，8(8)：3084- 3090.

[9]Noitup P，Morrissey MT，Garnjanagoonchorn W.Invitroself-assembly of silver line grunt type Ⅰ collagen：effect of collagen concentrations，pH and temperatures on collagen self-assembly[J]. J Food Biochem，2006，30(5)：547- 555.

[10]Zhang JJ，Duan R，Tian Y，et al. Characterisation of acid-soluble collagen from skin of silver carp[J]. Food Chem，2009，116(1)：318- 322.

[11]Gower LB，Odom DJ. Deposition of calcium carbonate films by a polymer-induced liquid-precursor (PILP) process[J]. J Crystal Growth，2000，210(4)：719- 734.

[12]Beniash E，Metzler RA，Lam RS，et al. Transient amorphous calcium phosphate in forming enamel[J]. J Struct Biol，2009，166(2)：133- 143.

[13]Mahamid J，Sharir A，Gur D，et al. Bone mineralization proceeds through intracellular calcium phosphate loaded vesicles：a cryo-electron microscopy study[J]. J Struct Biol，2011，174(3)：527- 535.

Application of Recombinant Collagen Type Ⅰ Combined with PolyasparticAcid in Biomimetic Biomineralization

ZHANG Zhan，ZHANG Chun，GUO Qiaofeng，MA Gouping，SHEN Lifeng，YU Huajun，LIN Bingyuan，LU Ning，HUANG Kai

Department of Orthopedics，Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310012，ChinaCorresponding author：GUO Qiaofeng Tel：0571- 89972356，E-mail：hzgqf@hotmail.com

Objective To prepare biomimetic bone material by reconstructing type Ⅰ collagen combined with polyaspartic acid. Methods By acid hydrolysis，rat tail type Ⅰ collagen was decomposed into collagen fibers，which were then placed in the calcium phosphate mineralization solution. Under the cross-linking of glutaraldehyde，the collagen fibers were reconstructed and assembled into collagen fibers，and the calcium phosphate crystals were wrapped in the inner side of the collagen fibers for biomineralizationin. After poly aspartate acid was added，calcium hydroxyapatite calcium precursor was added into the collagen fibers to simulate thebiomimetic biomineralizationin the human body. After mineralization for 3- 9 days，the bone mineralization process was observed by transmission electron microscopy and electron diffraction. Results Transmission electron microscopy and electron diffraction displayed that，after 3 days of mineralization，calcium hydroxyapatite precursor was wrapped in the collagen fiber gap，and the collagen fiber was partially mineralized. After 9 days of mineralization，calcium hydroxyapatite precursor completely infiltrated into the collagen fiber，and the amorphous calcium phosphate was transformed into hydroxyapatite calcium crystal. Thus，the simulation of bone mineralization was completed，and collagen type Ⅰ collagen/hydroxyapatite calcium biomimetic bone material was formed. Conclusion Reconstruction of type Ⅰ collagen combined with polyaspartic acid can prepare biomimetic bone material that has close chemical composition and molecular structure to the human bone tissue.

typeⅠcollagen；reconstruction；polyaspartic acid；biomineralization

浙江省科技廳院所專項基金項目(2013F50006)、浙江省科技廳公益技術研究社會發展項目(2014C33207)和浙江省醫藥衛生科技計劃項目(2014KYA030) Supported by the Special Fund of the Science and Technology Department of Zhejiang Province (2013F50006)，the Public Welfare Project of the Science and Technology Department of Zhejiang Province (2014C33207)，and the Medical and Health Science and Technology Program of Zhejiang Province (2014KYA030)

郭峭峰 電話：0571- 89972356，電子郵件：hzgqf@hotmail.com

R318.08

A

1000- 503X(2017)03- 0318- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.004

2016- 11- 21)