納米細菌大鼠腎結石模型腎臟結石形成時間的動態研究

褚 浩，王勤章，吳 雙，錢 成，王議鶴，錢 彪

·論著·

納米細菌大鼠腎結石模型腎臟結石形成時間的動態研究

褚 浩，王勤章，吳 雙，錢 成，王議鶴，錢 彪*

目的 采用微計算機斷層掃描技術(Mirco-CT)和病理組織學檢查動態觀察納米細菌誘導的大鼠腎結石模型腎臟結石形成情況。方法 2015年11月—2016年6月，將60只SPF級Wistar大鼠適應性飼養1周后，隨機分為對照組和誘石組，各30只。對照組大鼠一次性尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液1.2 ml，誘石組大鼠一次性尾靜脈注射納米細菌懸液1.2 ml。兩組大鼠注射后第1～10周每周處死3只，收集雙側腎臟待測。采用Mirco-CT檢查兩組大鼠腎臟，統計第1～10周兩組大鼠檢測到的腎臟高密度影情況。光學顯微鏡下觀察兩組大鼠腎臟晶體的形成情況,統計第1～10周兩組大鼠腎臟晶體陽性情況。結果 Mirco-CT掃描結果：第1～10周，對照組大鼠腎臟均未見高密度影；第7～10周誘石組大鼠腎臟可見白色顆粒樣高密度影。第1～10周，誘石組大鼠腎臟高密度影檢出4只(13.3%)，對照組未檢出；截至第10周末，兩組大鼠腎臟高密度影檢出率比較，差異無統計學意義(P=0.056)。病理組織學檢查結果：第1～10周，對照組大鼠腎臟內無晶體沉積。第4周及第6～10周誘石組大鼠腎臟可見灰白色晶體。第1～10周，誘石組大鼠腎臟晶體陽性11只(36.7%)，對照組均為陰性；截至第10周末，誘石組大鼠腎臟晶體陽性率高于對照組(P<0.001)。結論 納米細菌在第4周開始誘導大鼠腎臟形成結晶，這個病理過程在第6～10周持續存在，Mirco-CT檢查可見第7～10周形成高密度結石樣物質，納米細菌可能通過早期損傷腎臟誘導結晶形成并進一步產生結石。

腎結石；納米細菌；模型，動物；體層攝影術,螺旋計算機

褚浩，王勤章，吳雙，等.納米細菌大鼠腎結石模型腎臟結石形成時間的動態研究[J].中國全科醫學，2017，20(21)：2613-2618.[www.chinagp.net]

CHU H,WANG Q Z,WU S,et al.Dynamic study on the time of stone formation in rat nephrolithiasis model induced by nanobacteria[J].Chinese General Practice，2017，20(21)：2613-2618.

納米細菌自從被發現以來，其身影出現于生物體內的各種鈣化現象，且一直是泌尿系結石病因學的研究熱點。納米細菌在腎結石形成中的作用一直備受關注，國內外相關學者常通過納米細菌感染動物建立相關腎結石模型，從血尿生化檢測、病理切片觀察等方面做出針對性的探討研究[1-4]。本研究在借鑒上述經典方法的同時，參考在骨骼等高密度物質研究方面有較廣泛應用的微計算機斷層掃描技術(Mirco-CT)這一相對新穎的技術手段，首次采用Mirco-CT動態觀察感染納米細菌的大鼠腎結石形成情況，同時進行病理組織學檢查，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級雄性Wistar大鼠60只，6周齡左右，體質量(200±20)g，購自新疆醫科大學實驗動物中心〔合格證號SCXK(新) 2013- 0001〕?；撅暳嫌墒幼哟髮W實驗動物中心提供，多功能光學顯微鏡及圖像采集系統(BX40，日本Olympus公司)、Mirco-CT(Bruker Company)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腎結石模型建立及實驗取材 本課題組前期收集上尿路結石患者的尿液，過濾處理后進行細胞培養，得到的納米細菌懸液經相差顯微鏡、電鏡、鈣染色鑒定[5]。2015年11月—2016年6月，60只SPF級Wistar大鼠適應性飼養1周后，隨機分為對照組和誘石組，各30只。對照組大鼠一次性尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液1.2 ml，誘石組大鼠一次性尾靜脈注射納米細菌懸液1.2 ml。兩組大鼠注射后第1～10周每周處死3只，收集雙側腎臟,并置于10%甲醛溶液中固定。

1.2.2 Mirco-CT檢查 將大鼠腎臟固定在放射源和照相機之間，并保持在可視范圍內，沿垂直長軸做0.9°～180.0°旋轉，并同時保持在掃描視野范圍內。Mirco-CT檢查條件:功率8 W、電壓30 kV，電流300 μA，空間分辨率35 μm，Filter=0.5 mm AL，觀察大鼠腎臟是否存在高密度影，雙側腎臟同時出現高密度影時僅計1次，統計第1～10周兩組大鼠檢測到的腎臟高密度影情況。

本研究背景：

納米細菌廣泛存在于人體內，是一種具有超微結構的生物，可以在人體鈣化組織器官或體液中檢測到，并被認為與多種鈣化性疾病有關，具體到納米細菌與泌尿系結石的關聯，從納米細菌對腎小管上皮細胞水平的影響到納米細菌感染大鼠動物模型的構建，國內外學者均做出一定的探索，觀察到納米細菌與結石的形成具有一定的相關性，這種改變可能與納米細菌的細胞毒性作用或礦化能力有關，具體機制有待進一步研究。

1.2.3 病理組織學檢查 于10%甲醛溶液中取出腎臟常規脫水，石蠟包埋制片后固定于載玻片上，HE染色，光學顯微鏡下觀察晶體的形成情況,參考文獻[6]提供的腎臟判定標準進行統計，0級為陰性結果，Ⅰ～Ⅳ級為陽性結果，雙側腎臟同時出現陽性結果時，僅計1次，統計第1～10周兩組大鼠腎臟晶體陽性情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。計數資料比較采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Mirco-CT檢查結果 第1～10周，對照組大鼠腎臟大體輪廓清晰可見，邊緣無毛糙；三視圖圖像中腎皮質、腎髓質及腎盂均未見高密度影，見圖1。誘石組大鼠第7周起腎臟可見白色顆粒樣高密度影分布于腎實質中，三視圖圖像可見高亮點狀影隨機分布于腎實質的各截面中，見圖2。第1～10周，誘石組大鼠腎臟高密度影檢出4只(13.3%)，對照組未檢出(見表1)；截至第10周末，兩組大鼠腎臟高密度影檢出率比較，差異無統計學意義(P=0.056)。

2.2 病理組織學檢查結果 第1～10周，對照組大鼠腎臟內無晶體沉積，未見明顯病理學改變。誘石組大鼠第4周起腎臟石蠟切片可見灰白色晶體，主要分布于遠曲小管、近曲小管及部分腎小球，周圍形態不規則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體呈互相連接成片或成堆分布，見圖3。第1～10周，誘石組大鼠腎臟晶體陽性11只(36.7%)，對照組均為陽性(見表2)；截至第10周末，誘石組大鼠腎臟晶體陽性率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)。

3 討論

納米細菌是由Kajander發現能形成磷灰石碳酸鹽晶體的特殊生物,在人體許多器官組織及體液中廣泛存在[7-8],參與體內諸多病理性鈣化過程[1]。GARCA CUERPO等[2]應用培養的納米細菌經皮腎臟穿刺注射,初步建立了納米細菌致大鼠腎結石動物模型,解剖大鼠后發現其腎小管可見廣泛鈣化，因此提出納米細菌作為結石核心的設想。胡衛國等[3]、粟宏偉等[4]參照SHIEKH等[9]實驗大鼠尾靜脈注射納米細菌,8周后發現實驗組大鼠腎小管管腔內不規則片狀高亮晶體，主要分布于遠曲小管和近曲小管,進一步進行結晶分級計數,發現與經典的乙二醇氯化銨誘導腎結石模型相比,納米細菌誘導的大鼠腎結石模型晶體數量少,腎盂等集合系統內晶體或結石形成極少,腎小管內的晶體少有連接成片或成堆。但上述研究對于納米細菌的結石形成過程僅進行了總結性的報道，缺乏動態的觀察描述，因此，本研究建立納米細菌大鼠腎結石模型，以造模后10周為時間截點，觀察大鼠各周腎臟結石形成情況，并引入近年來發展較快的Mirco-CT，實現了對樣本的空間結構、微觀結構和重塑性的三維可視化同步呈現，同時兼有快捷方便、無創性等特點，其在觀察和測量高密度物質方面相對于傳統的組織切片技術具有明顯優勢[10-11]，因此在分析研究骨骼等高密度物質的實驗研究領域得到一定應用[12-13]。鑒于結石是高密度物質的物理特性，本實驗首次嘗試利用Mirco-CT，定性分析大鼠腎臟結石形成情況，同時分析腎臟HE染色結果，共同探討納米細菌大鼠腎結石模型結石形成的時間規律特點。

注：A為腎臟CT圖，腎盂向前：B、C、D依次為矢狀面、橫截面、冠狀面

圖1 對照組大鼠第7周腎臟Mirco-CT檢查結果

Figure 1 Results of kidney Mirco-CT examination in control group of rats for the seventh week

注：A為腎臟CT圖，腎盂向前：B、C、D依次為矢狀面、橫截面、冠狀面

圖2 誘石組組大鼠第7周腎臟Mirco-CT檢查結果

表2 兩組大鼠各周腎臟晶體陽性情況(只)

注：A為對照組大鼠腎臟，B為誘石組大鼠腎臟

圖3 兩組大鼠第6周腎臟病理組織圖(HE染色，×200)

Figure 3 Pathological structure of kidney in two groups of rats for the sixth week

本實驗發現Mirco-CT檢查和病理組織學檢查結果提示誘石組的結石檢出率較對照組高，但是Mirco-CT檢查結果無統計學差異，可能與腎結石程度較輕、個別標本未被Mirco-CT檢查檢出而呈假陰性有關。Mirco-CT檢查示，第7～10周誘石組大鼠均有腎臟高密度影檢出，對照組大鼠未檢出。病理組織學檢查結果顯示，第4周及第6～10周誘石組大鼠腎小管內發現晶體,且主要分布于遠曲小管和近曲小管,對照組大鼠未見晶體。相關研究顯示，乙二醇誘導腎結石周期普遍為4周左右[14-15]，而納米細菌誘導大鼠結石造模周期較長，這可能與納米細菌的生物學代謝特點有關。納米細菌只能在細胞培養基上生長,且生長緩慢,倍增時間平均為3～5 d，細胞培養常需要4～6周以上才能出現肉眼可見白色沉淀[7,16]。ZHOU等[17]經大鼠尿道將納米細菌逆行感染前列腺，然后分別在不同時間點處死大鼠，收集標本檢測感染率達95%，對照組無感染大鼠，組間差異明顯；光鏡下大鼠感染4周后前列腺均表現為慢性炎癥；透射電子顯微鏡下胞質內可見聚集的球狀或桿狀納米細菌存在,周圍出現空泡狀、透明樣結構,本研究觀察到的腎臟病理損害與之相印證，同時體外細胞實驗[18-19]發現納米細菌不僅通過損傷腎小管上皮細胞誘導大鼠腎小管內產生含鈣結晶，而且損傷細胞后，細胞的晶體黏附性明顯增強，隨損傷作用時間的延長，細胞與晶體的黏附量也會相應增加[20]，上述過程相互協同、共同促進腎結石的形成。鈣化和結石形成均離不開納米細菌獨特的生物礦化作用，并且均是以納米細菌為核心，通過不斷結合鈣離子，逐漸在其周圍聚集，形成沉淀并發展為鈣化、結石等[21]。

與納米細菌腎結石模型相比，傳統的乙二醇誘導草酸鈣大鼠結石模型建立后,能較快的觀察到結石出現，雖然二者的原發機制可能不盡相同，但是均出現腎臟損害及結晶形成的現象，這就有利的佐證了納米細菌對腎結石形成的促進作用，同時，納米細菌的鈣化作用受自身生理條件的影響較大，正因為如此，納米細菌誘導的成石模型在某方面可能更接近人類腎結石疾病的代謝過程，對相關研究也是一個有益的探索及嘗試。

綜上所述，納米細菌在第4周開始誘導大鼠腎臟形成結晶，這個病理過程在第6～10周持續存在，Mirco-CT檢查可見第7～10周形成高密度結石樣物質。納米細菌在利用自身礦化特性誘導結晶形成的同時損傷腎小管等腎臟結構，上述病理過程相互作用，互相協同，進一步導致腎臟結構的變化，最終導致結石的形成。作為腎結石病因學的一個研究方向，全面闡明納米細菌在整個疾病變化中的機制還需要更廣泛、更深入的研究，例如在細胞學水平上進行更多的時間點觀察并檢測更多相關蛋白及其他指標的表達，了解納米細菌對相關指標的影響情況，為腎結石的病因研究及診治預防做進一步探索。

作者貢獻：褚浩、王勤章、錢彪進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，撰寫論文，論文修訂；褚浩、吳雙、錢成、王議鶴進行數據收集與整理；褚浩進行統計學處理，結果分析與解釋，負責文章的質量控制及審校；褚浩、王勤章、錢彪對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

本研究不足之處：

目前國內納米細菌均是通過收集人體標本進行細胞培養獲得，培養周期至少6～8周，并且每個培養瓶獲得納米細菌的數量有限，而實驗造模要求納米細菌提取后要達到一定濃度，這就使最終納米細菌的數量受到限制，能被其感染的大鼠數量相應受到限制，樣本量較小，整體陽性率不高，同時微計算機斷層掃描技術(Mirco-CT)的應用尚顯粗糙，有待進一步改善和研究。

[1]KAJANDER E O,CIFTCIOGLU N.Nanobacteria:an alternative mechanism for pathogenic intra- and extracellular calcification and stone formation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(14):8274-8279.

[3]胡衛國,王曉峰,徐濤，等.納米細菌大鼠腎結石模型初步建立及成石因素分析[J].北京大學學報(醫學版),2010,42(4):433-435.DOI:10.3969/j.issn.1671-167X.2010.04.016. HU W G,WANG X F,XU T,et al.Establishment nephrolithiasis rat model induced by nanobacteria and analysis of stone formation[J].Journal of Peking University(Health Sciences),2010,42(4):433-435.DOI：10.3969/j.issn.1671-167X.2010.04.016.

[4]粟宏偉,王杰,朱永生，等.鈣化性納米微粒致大鼠腎結石模型的構建[J].重慶醫學,2016,45(3):310-312,316.DOI:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.007. SU H W,WANG J,ZHU Y S，et al.Establishment renal calculus rat model induced by calcifying nanoparticles[J].Chongqing Medicine,2016，45(3):310-312.DOI：10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.007.

[5]劉志立,王勤章,錢彪，等.上尿路結石患者原尿納米細菌的培養及鑒定[J].醫學信息,2015,28(42):70-71.DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2015.42.097. LIU Z L，WANG Q Z，QIAN B，et al.Culture and identification of primary urinary nanometer bacteria in patients with upper urinary calculi[J].Medical Information，2015,28(42):70-71.DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2015.42.097.

[6]安瑞華,馮陶,郭應祿,等.香豆素對實驗性大鼠草酸鈣結石形成的影響[J].中華泌尿外科雜志,1994,15(3):209-212. AN R H,FENG T,GUO Y L,et al.Effect of coumarin on the formation of calcium oxalate calculus in rats[J].Chinese Journal Urology,1994,15(3):209-212.

[7]任海林,顏東文,史葆光，等.上尿路結石中納米細菌的檢測[J].中華泌尿外科雜志,2006,27(9):620.DOI:10.3760/j:issn:1000-6702.2006.09.022. REN H L,YAN D W,SHI B G,et al.Detection of nanobacteria in upper urinary tract stones[J].Chinese Journal Urology,2006,27(9):620.DOI：10.3760/j:issn:1000-6702.2006.09.022.

[8]WOOD H M,SHOSKES D A.The role of nanobacteria in urologic disease[J].World Journal of Urology,2006,24(1):51-54.DOI：10.1007/s00345-005-0041-3.

[9]SHIEKH F A,KHULLAR M,SINGH S K.Lithogenesis:induction of renal calcifications by nanobacteria[J].Urolithiasis,2006,34(1):53-57.

[10]姜玲,金東春,黎衛星，等.顯微CT在口腔種植研究領域中的應用[J].中華臨床醫師雜志(電子版),2009,3(11):1888-1895.DOI:10.3969/j.issn.1674-0785.2009.11.019. JIANG L,JIN D C,LI W X,et al.Application of micro CT in dental implant research[J].Chinese Journal of Clinicians (Electronic Version),2009,3(11):1888-1895.DOI:10.3969/j.issn.1674-0785.2009.11.019.

[11]吳興,湯光宇.骨質疏松骨髓微環境的影像研究進展[J].國際醫學放射學雜志,2016,39(4):390-394.DOI:10.19300/j.2016.Z3898. WU X,TANG G Y.Advances in imaging research of bone marrow microenvironment in osteoporosis[J].Int J Med Radiol,2016,39(4):390-394.DOI:10.19300/j.2016.Z3898.

[12]RITMAN E L.Micro-computed tomography-current status and developments[J].Annu Rev Biomedl Eng,2004,6(1):185-208.

[13]SNOEKS T J,KAIJZEL E L,QUE I,et al.Normalized volume of interest selection and measurement of bone volume in micro CT scans[J].Bone,2011,49(6):1264-1269.DOI：10.1016/j.bone.2011.09.037.

[14]李笑然,岳中瑾,裴薇，等.4種大鼠腎草酸鈣結石模型的比較[J].現代泌尿外科雜志,2013,18(4):329-331,338.DOI:10.3969/j.issn.1009-8291.2013.04.006. LI X R,YUE Z J,PEI W,et al.Comparison of four renal calcium oxalate calculus rat models[J].Journal of Modern Urology,2013,18(4):329-331,338.DOI:10.3969/j.issn.1009-8291.2013.04.006.

[15]向松濤,甘澍,周建甫，等.廣金錢草水提取液對腎草酸鈣結石模型大鼠氧化應激的影響研究[J].中華泌尿外科雜志,2014,35(6):465-468.DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-6702.2014.06.018. XIANG S T,GAN S,ZHOU J F,et al.Effects of aqueous extract from Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.on oxidative stress of renal calcium oxalate rat modles[J].Chinese Journal Urology,2014,35(6):465-468.DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-6702.2014.06.018.

[16]KHULLAR M,SHARMA S K,SINGH S K,et al.Morphological and immunological characteristics of nanobacteria from human renal stones of a north Indian population[J].Urol Res,2004，32(3):190-195.

[17]ZHOU Z,HONG L,SHEN X,et al.Detection of nanobacteria infectionin type Ⅲ prostat it is[J].Urology,2008,71(6):1091-1095.DOI：10.1016/j.urology.2008.02.041.

[18]陶芝偉,黎承楊,鄧耀良，等.尿液鈣化性納米微粒與腎結石形成的關系[J].現代泌尿外科雜志,2009,14(3):235-237.DOI:10.3969/j.issn.1009-8291.2009.03.030. TAO Z W,LI C Y,DENG Y L,et al.Effect of nanobacteria on cell damage and crystal retention in renal tubular epithelial cells[J].Journal of Modern Urology,2009,14(3):235-237.DOI:10.3969/j.issn.1009-8291.2009.03.030.

[19]汪越,張力,郝宗耀,等.納米細菌及其誘發泌尿系結石形成的研究進展[J].臨床泌尿外科雜志,2015，30(7):665-668.DOI：10.13201/j.issn.1001-1420.2015.07.026. WANG Y,ZHANG L,HAO Z Y,et al.Nanobacteria and the research progress of its effect on urinary stone formation[J].Journal of Clinical Urology,2015，30(7):665-668.DOI：10.13201/j.issn.1001-1420.2015.07.026.

[20]于澄釩,黃曉波,陳亮，等.納米細菌對腎小管上皮細胞的損傷及晶體滯留的影響[J].北京大學學報(醫學版),2010,42(4):436-442.DOI:10.3969/j.issn.1671-167X.2010.04.017. YU C F,HUANG X B,CHEN L,et al.Effect of nanobacteria on cell damage and crystal retention in renal tubular epithelial cells[J].Journal of Peking University(Health Sciences),2010,42(4):436-442.DOI:10.3969/j.issn.1671-167X.2010.04.017.

[21]ZENG J,YANG F,ZHANG W,et al.Association between dental pulp stones and calcifying nanoparticles[J].Int J Nanomedicine,2011,25(12):2633-2638.DOI：10.2147/IJN.S13267.

(本文編輯：毛亞敏)

Dynamic Study on the Time of Stone Formation in Rat Nephrolithiasis Model Induced by Nanobacteria

CHUHao,WANGQin-zhang,WUShuang,QIANCheng，WANGYi-he,QIANBiao*

DepartmentofUrologySurgery，theFirstAffiliatedHospitalofMedicalSchoolofShiheziUniversity,Shihezi832000,China

Objective To dynamically observe the stone formation in rat nephrolithiasis model induced by nanobacteria by using micro computed tomography(Mirco-CT) examination and histopathological examination.Methods From November 2015 to June 2016,60 SPF class Wistar rats were adaptively fed for one week.Then the rats were randomly divided into two groups:control group and induced stone group,30 rats in each group.The rats in the control group were injected with 1.2 ml of 0.9% sodium chloride solution via the tail vein at one time,the rats in the induced stone group were injected with 1.2 ml of nanobacterial suspension at one time.Three rats in each group were sacrificed every week from the 1st to 10th week after injection,bilateral renal tissues were collected to be tested.The kidneys of the two groups of rats were examined by Mirco-CT,the detected high density shadow in the kidneys of the two groups of rats at the 1st to 10th week was statistically analyzed.The crystal formation in the renal tissues of the two groups of rats was observed under light microscope,and the positive condition in the renal of the two groups of rats at the 1st to 10th week was statistically analyzed.Results Mirco-CT scan results showed that there was no high density shadow in the kidneys of rats in the control group from the 1st to 10th week,while there were white high density granules in the kidneys of the rats in induced stone group from the 7th to 10th week.From the 1st to 10th week,high density shadow was detected in the renal tissues of 4 rats(13.3%) in induced stone group,while not in the control group.At the end of the 10th week,there was no significant difference in the detection rate of high density shadow in renal tissues between the two groups(P=0.056).Histopathological findings showed that there were no crystal deposits in the kidneys of the rats in the control group from the 1st to 10th week.At the 4th week and the 6th to 10th week,greyish white crystals were detected in the renal tissues of the rats in the induced stone group.From the 1st to 10th week,crystals were detected in the renal tissues of 11 rats(36.7%) in induced group,but not in the control group.At the end of the 10th week,the crystal detection rate by paraffin section in the renal tissues of rats in induced stone group was higher than that in the control group,the difference was statistically significant(P<0.001).Conclusion Nanobacteria begin to induce the formation of crystals in the kidneys of the rats at the 4th week.The pathological process persists at the 6th to 10th week.Finally,the Mirco-CT examination shows the formation of high density stone like substance at the 7th to 10th week.Nanobacteria may induce the formation of crystals by early renal injury and further produce stones.

Kidney calculi；Nanobacteria；Models,animal；Tomography,spiral computed

國家自然科學基金資助項目(81460140)

R 692.4

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.21.011

2017-02-23；

2017-06-06)

832000新疆石河子市，石河子大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科

*通信作者：錢彪，副教授，副主任醫師；E-mail:qb2003_2000@163.com

*Correspondingauthor:QIANBiao，Associateprofessor，Associatechiefphysician；E-mail:qb2003_2000@163.com