晚期糖基化終末產物調控平滑肌細胞鈣化的機制研究

何虎強，曾 宏，孫曉磊，張 雷，王偉明，胥雄飛，何延政，劉 勇

·論著·

晚期糖基化終末產物調控平滑肌細胞鈣化的機制研究

何虎強，曾 宏，孫曉磊，張 雷，王偉明，胥雄飛，何延政，劉 勇*

目的 探討晚期糖基化終末產物(AGEs)調控其受體促進人股動脈平滑肌細胞鈣化的機制。方法 2014年1月—2015年3月，將股動脈中膜平滑肌層剪成1～2 mm組織塊培養，選取3～8代平滑肌細胞用于實驗。將平滑肌細胞分為4組，A組單純于DMEM培養基中培養，B組于含10 mmol/L β磷酸甘油鈉的DMEM培養基中培養，C、D組分別于含10 mmol/L β磷酸甘油鈉的DMEM培養基中加入20、40 mg/L AGEs，各組平滑肌細胞干預培養96 h。合成3對隨機AGEs受體(RAGE)siRNA，以50 nmol/L轉染C組平滑肌細胞，24 h后進行siRNA沉默效果檢測，選取轉染效率較高的序列用于實驗。分別取轉染前后平滑肌細胞，采用Von Kossa染色實驗觀察平滑肌細胞內鈣沉積情況，采用Western blotting法檢測RAGE、β-catenin、骨保護素(OPG)表達水平。結果 未轉染的平滑肌細胞中，A組無鈣化斑塊形成，B組可見明顯的鈣化斑塊；C、D組細胞質、細胞核呈現粉紅色的數量增加，鈣化斑塊明顯增多。經轉染后，C組平滑肌細胞細胞質、細胞核呈現粉紅色的數量較未轉染細胞減少，鈣化斑塊形成受到抑制。未轉染的各組平滑肌細胞RAGE、β-catenin、OPG表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，C組平滑肌細胞RAGE、β-catenin、OPG表達水平高于B組，D組平滑肌細胞RAGE、β-catenin、OPG表達水平高于B、C組(P<0.05)。C組平滑肌細胞轉染后RAGE、β-catenin、OPG表達水平均低于轉染前(P<0.01)。結論 AGEs通過與其受體結合而介導平滑肌細胞鈣化，其機制可能為RAGE激活Wnt/β-catenin信號通路，使β-catenin下游蛋白OPG表達水平升高。

糖尿??；血管鈣化；晚期糖基化終末產物；骨保護素

何虎強，曾宏，孫曉磊，等.晚期糖基化終末產物調控平滑肌細胞鈣化的機制研究[J].中國全科醫學，2017，20(20)：2490-2494.[www.chinagp.net]

HE H Q，ZENG H，SUN X L，et al.Mechanism of action of advanced glycation end products in the regulation of smooth muscle cells calcification[J].Chinese General Practice，2017，20(20)：2490-2494.

糖尿病(DM)是一種高度流行的代謝性疾病，其發病率在全球范圍內呈上升趨勢[1]。大血管和外周血管鈣化是導致DM發生和患者死亡的主要原因[2]。DM患者體內晚期糖基化終末產物(AGEs)代謝增強，致使AGEs增多[3]?，F已證明，人血管平滑肌細胞存在AGEs受體(RAGE)，AGEs與RAGE結合，導致的變態反應和氧化應激，是誘發DM患者血管病變的主要原因之一[4]。AGEs通過與RAGE結合，改變細胞內信號表達，使內皮細胞功能發生紊亂，導致多種因子表達發生變化，從而刺激平滑肌細胞遷移、增殖，加快DM患者動脈粥樣硬化進一步演變[5]。AGEs在誘導平滑肌細胞向成骨細胞轉化，并促進血管鈣化的發生過程中具有重要作用[6]。既往研究發現，AGEs誘導活性氧簇(ROS)的產生，并通過脫氫酶輔酶(NADPH)氧化酶促進平滑肌細胞凋亡的同時導致鈣沉積。本研究通過對鈣化培養的平滑肌細胞采用不同濃度的AGEs干預，并檢測相關蛋白表達的差異，探討AGEs調節動脈平滑肌細胞鈣化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養基、胎牛血清(美國HyClone公司)，DAPI染液(美國Sigma公司)，肌動蛋白α(α-SMA)單克隆抗體(美國Bioworld公司)，羊抗兔異硫氰酸熒光素(FITC)標記二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，山羊封閉血清(北京博奧森生物技術有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(武漢碧云天生物技術研究所)，AGEs(日本Biovision公司)，細胞鈣離子測定試劑盒(上海杰美基因醫藥科技有限公司)，一抗RAGE、β-catenin、骨保護素(OPG，美國Cell Signaling公司)，二抗、上樣緩沖液、一抗二抗稀釋液(武漢碧云天生物技術研究所)，RAGE siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.2 人股動脈平滑肌細胞培養與鑒定 2014年1月—2015年3月，取遺體捐獻者股動脈(中山大學附屬醫院惠贈)，無菌環境下手術刀片刮除外膜和內膜,將中膜平滑肌層剪成1～2 mm組織塊。貼壁培養3周后，在倒置顯微鏡下觀察，有平滑肌細胞從組織塊周圍爬出。4周時，平滑肌細胞呈典型的“峰谷狀”生長。用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃，5%CO2培養箱中靜置培養，隨著傳代次數的增多，平滑肌細胞生長周期逐漸縮短，5代以后維持在3～5 d，8代以后維持在1～2 d。選取3～8代平滑肌細胞，用DMEM培養液制成細胞懸液，接種于24孔板，完成下述實驗。

1.3 實驗分組 將平滑肌細胞分為4組，A組單純于DMEM培養基中培養，B組于含10 mmol/L β磷酸甘油鈉的DMEM培養基中培養，C、D組分別于含10 mmol/L β磷酸甘油鈉的DMEM培養基中加入20、40 mg/L AGEs，各組細胞干預培養96 h。

1.4 RAGE siRNA轉染 根據Gene Bank數據人工合成3對隨機RAGE siRNA(廣州銳博生物技術有限公司)。siRNA 1靶序列：CCTCTTTCCTGGAGTAAAT，正義鏈：5′-CCUCUUUCCUGGAGUAAAU dTdT-3′,反義鏈：5′-AUUUACUCCAGGAAAGAGG dTdT-3′；siRNA 2靶序列：GCACTAATATGTAACTTA，正義鏈：5′-GCACUAAUAUGUGAACUUA dTdT-3′,反義鏈：5′-UAAGUUCACAUAUUAGUGC dTdT-3′；siRNA 3靶序列：CACCGGAACCACTCAGTAA，正義鏈：5′-CACCGGAACCACUCAGUAA dTdT-3′，反義鏈：5′-UUACUGAGUGGUUCCGGUG dTdT-3′。轉染前24 h將C組細胞以1×105個/孔鋪于24孔板,使轉染時密度能夠達到80%。以lipofectamineTM2000轉染siRNA于24孔板，轉染濃度為50 nmol/L，按照試劑盒說明完成轉染步驟。轉染完成后24 h進行siRNA沉默效果檢測，Cy3標記的RAGE siRNA模擬物轉染平滑肌細胞8 h后換液，24 h后熒光顯微鏡下觀察siRNA不同序列轉染的細胞中Cy3標記的紅色熒光表達量。通過篩選發現，siRNA 2的轉染效率較高,Cy3紅色熒光標記細胞陽性率接近100%(見圖1，本文彩圖詳見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章)，選用該轉染細胞用于實驗。

1.5 Von Kossa染色實驗 分別取轉染前后細胞，采用Von Kossa染色實驗(試劑盒購于上海杰美基因醫藥科技有限公司)觀察細胞內鈣沉積情況。6孔板中放入蓋玻片，讓細胞爬到蓋玻片上；待細胞在蓋玻片上融合度達90%時，用37 ℃磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次；加入4%多聚甲醛溶液固定30 min,將固定的蓋玻片依次加入100%、95%、80%梯度乙醇溶液后水洗；加入1%硝酸銀溶液1 ml，日光照射30 min；移棄硝酸銀溶液，加入1 ml 5%硫代硫酸鈉溶液放置1 min；核固紅復染后，用95%和無水乙醇逐級脫水兩次；天然樹脂膠封固，光鏡觀察。在光鏡下，核固紅復染后若有鈣沉積，則細胞質、細胞核均呈現紅色或淡粉色。

圖1 siRNA 2轉染后，熒光顯微鏡下可見Cy3紅色熒光標記細胞陽性率接近100%(×10)

Figure 1 siRNA transfection,under the Fluorescence microscope,Cy3 in cell positive rate close to 100%,Shows that successful transfection

1.6 Western blotting法 分別取轉染前后細胞，檢測RAGE、β-catenin、OPG表達水平。應用總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，稀釋一抗經10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中搖床37 ℃，封閉1 h，PVDF膜浸泡于稀釋好的一抗RAGE(1∶500)、β-catenin(1∶500)、OPG(1∶500)、GAPDH(1∶500)中，4 ℃孵育過夜；次日復溫1 h，TBST緩沖液洗膜5 min，洗3次。二抗孵育后加入預先稀釋好的辣根過氧化物酶(1∶3 000)標記，密封，室溫孵育1 h，洗膜，TBST緩沖液漂洗5 min，洗3次；暗室中向蛋白條帶加ECL發光液，使發光液與條帶充分混勻，放入成像儀中拍照。采用Quantity one軟件分析蛋白灰度值，以GAPDH作為內參，以目的蛋白吸光度值/GAPDH吸光度值×100%表示其相對表達水平。實驗重復3次。

2 結果

2.1VonKossa染色實驗 未轉染的細胞中，A組無鈣化斑塊形成，B組可見明顯的鈣化斑塊；C、D組細胞質、細胞核呈現粉紅色的數量增加，鈣化斑塊明顯增多(見圖2)。經轉染后，C組平滑肌細胞細胞質、細胞核呈現粉紅色的數量較未轉染細胞減少，鈣化斑塊形成受到抑制(見圖3)。

圖2 未經轉染的各組平滑肌細胞Von Kossa染色實驗結果

Figure2ExperimentalresultsofVonKossastainingofsmoothmusclecellsinnontransfectedgroups

圖3 轉染后的C組平滑肌細胞Von Kossa染色實驗結果

Figure 3 Experimental results of Von Kossa staining of the smooth muscle cells of C group after transfection

2.2 未經轉染的各組平滑肌細胞RAGE、β-catenin、OPG表達水平比較 未轉染的各組平滑肌細胞RAGE、β-catenin、OPG表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，C組平滑肌細胞RAGE、β-catenin、OPG表達水平高于B組，D組平滑肌細胞RAGE、β-catenin、OPG表達水平高于B、C組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of expression levels of RAGE，β-catenin，OPG among each group before RAGE siRNA interference

組別RAGEβ-cateninOPGB組0.141±0.0051.170±0.0390.269±0.017C組0.489±0.023a1.601±0.009a0.750±0.026aD組1.039±0.041ab1.839±0.082ab1.084±0.048abF值274.69241.176157.166P值<0.001<0.001<0.001

注：RAGE=晚期糖基化終末產物受體，OPG=骨保護素；與B組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05

2.3 C組平滑肌細胞轉染前后RAGE、β-catenin、OPG表達水平比較 C組平滑肌細胞轉染后RAGE、β-catenin、OPG表達水平均低于轉染前，差異有統計學意義(P<0.01，見表2)。

Table 2 Comparison of expression levels of RAGE，β-catenin，OPG before and after RAGE siRNA interference in group C

RAGEsiRNARAGEβ-cateninOPG轉染前1.419±0.0441.718±0.0382.327±0.037轉染后0.810±0.0050.876±0.0281.147±0.019t值13.76017.66528.610P值<0.001<0.001<0.001

3 討論

3.1 AGEs通過RAGE誘導平滑肌細胞鈣化 AGEs是與DM患者血管病變和神經系統并發癥相關的信號蛋白，對DM模型小鼠的研究證實，AGEs/RAGE在血管病變的發生及發展中具有重要作用[7]。RAGE作為當前研究最廣泛且最成熟的AGEs受體，屬于免疫球蛋白超家族成員，由細胞內區、跨膜區和細胞外區組成，其帶有高度電荷的細胞內區與細胞內信號傳導分子結合，在RAGE信號傳導中起核心作用。RAGE可由多種細胞表達，生理條件下低表達，但在某些病理條件下則持續表達，且配體與RAGE表達之間存在正反饋調節機制，在血管系統AGEs配體增多的病變部位常伴隨RAGE表達增加，這種正反饋調節誘導并增強RAGE與配體的致病作用。RAGE誘導巨噬細胞通過主動脈平滑肌細胞向成骨細胞分化，導致動脈粥樣硬化性血管鈣化[8]。YAMAGISHI等[9]研究發現，AGEs能誘導血管平滑肌細胞向成骨細胞轉化，并促進血管鈣化的發生。CECIL等[10]研究發現，Enpp1-/-小鼠在給予siRAGE或敲除RAGE后，動脈壁鈣化明顯受到抑制。多項研究也發現，AGEs能促進平滑肌細胞鈣化，同時誘導Runx2 mRNA的表達，促進堿性磷酸酶(ALP)活性，提高降鈣素水平；阻斷RAGE后，能抑制AGEs誘導的血管平滑肌細胞鈣化[11-12]。高血糖暴露及AGEs蓄積已被證明有助于DM的發生、發展[13]。AGEs具有誘導細胞分化的能力，從而促進血管鈣化的動脈粥樣硬化進程，激活的RAGE不僅抑制心肌素依賴的平滑肌細胞基因的表達，而且引起血管平滑肌細胞向成骨細胞分化，從而參與血管鈣化[14]。

本研究發現，隨著AGEs干預濃度的增加，平滑肌細胞內鈣沉積數量增加，同時RAGE表達增強，表明AGEs誘導的平滑肌細胞鈣化與RAGE表達有關。單純鈣化培養細胞RAGE表達減弱,進一步驗證了AGEs通過與RAGE結合誘導平滑肌細胞鈣化。給予RAGE siRNA沉默RAGE基因后,RAGE表達降低，反向證明了AGEs通過與其受體RAGE結合而促進平滑肌細胞鈣化。

3.2 HSMCs鈣化與Wnt/β-catenin信號通路的激活相關 AGEs-RAGE的相互作用決定了平滑肌細胞的增殖和活化可能與RAGE激活了某些信號通路相關。而Wnt/β-catenin信號通路通過對成骨細胞功能、分化的調節，在骨生長發育、骨量平衡、骨折愈合等過程中發揮舉足輕重的作用，Wnt/β-catenin信號的激活促進了Runx2、OPG、OSX、骨形態發生蛋白(BMP)、cyclinD1、基質金屬蛋白酶7(MMP-7)等與骨形成有關的蛋白表達。因此，Wnt/β-catenin信號通路被認為是骨形成過程中最關鍵的信號通路[15]。平滑肌細胞的鈣化模型建立后，其細胞表型由收縮型轉變為合成分泌型，并最終發展為成骨樣細胞表型。KWAN等[16]認為，Wnt/β-catenin信號通路參與成骨細胞形成過程，并且β-catenin在成骨細胞線性分化中起到關鍵作用。有實驗證明，Wnt/β-catenin信號通路參與了血管平滑肌細胞的鈣化[17]。CHENG等[18]發現，當Wnt/β-catenin信號通路抑制后，可降低DM模型小鼠主動脈鈣化，其下游與骨形成相關的蛋白Col1A1、Runx2、Nox1表達下降。本研究發現，RAGE的表達隨著AGEs濃度的增加而增強，同時伴隨AGEs濃度的增加，β-catenin的表達相應增加。進一步說明AGEs通過與RAGE結合后促進了人股動脈平滑肌細胞的鈣化，同時可能激活了Wnt/β-catenin信號通路,促使下游蛋白β-catenin的表達增強。

OPG表達于成骨細胞和破骨細胞,是β-catenin下游信號蛋白，在骨的形成、發展中扮演重要角色[19]。本研究發現，隨著AGEs濃度的增加，β-catenin及其下游蛋白OPG表達升高，提示Wnt/β-catenin信號通路在AGEs促進平滑肌細胞鈣化中扮演了重要角色，初步提示可能是由于RAGE的介導作用引起；RAGE siRNA轉染后，平滑肌細胞鈣化明顯受到抑制，同時，β-catenin及其下游蛋白OPG的表達均降低，進一步論證AGEs促進平滑肌細胞鈣化可能是通過RAGE介導的Wnt/β-catenin信號通路完成。

近年研究發現，sRAGE作為RAGE的誘餌受體可以抑制AGEs與RAGE結合，從而防止動脈粥樣硬化的形成和發展[20]。本研究選用RAGE siRNA干預細胞后，平滑肌細胞鈣化受到抑制，RAGE、β-catenin及其下游蛋白OPG表達降低，說明siRNA對β-catenin及其下游蛋白有下調機制。

綜上所述，AGEs通過與RAGE結合而介導平滑肌細胞鈣化，其機制可能為RAGE激活Wnt/β-catenin信號通路，使β-catenin下游蛋白OPG表達水平升高。另外，本研究發現，單純鈣化培養的平滑肌細胞RAGE、OPG表達水平低于對照，推測鈣化引起了平滑肌細胞的程序性死亡，導致細胞數目降低從而使其蛋白表達降低，這也為進一步研究鈣化導致的平滑肌細胞凋亡的相關機制建立了基礎。

作者貢獻：劉勇進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校；何虎強進行研究的實施與可行性分析、數據收集，并撰寫論文；曾宏進行數據整理；孫曉磊進行統計學處理；張雷進行結果的分析與解釋；王偉明、胥雄飛進行論文的修訂；何延政對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

[1]HERMAN W H,ZIMMET P.Type 2 diabetes：an epidemic requiring global attention and urgent action[J].Diabetes Care,2012,35(5)：943-944.DOI：10.2337/dc12-0298.

[2]CALCUTT N A,COOPER M E,KERN T S,et al.Therapies for hyperglycaemia-induced diabetic complications：from animal models to clinical trials[J].Nat Rev Drug Discov,2009,8(5)：417-429.DOI：10.1038/nrd2476.

[3]NENNA A,SPADACCIO C,LUSINI M,et al.Basic and clinical research against advanced glycation end products(AGEs)：new compounds to tackle cardiovascular disease and diabetic complications[J].Recent Adv Cardiovasc Drug Discov,2015,10(1)：10-33.DOI：10.2174/1574890110666151104120039.

[4]CSISZAR A，UNGVARI Z.Endothelial dysfunction and vascular inflammation in type 2 diabetes：interaction of AGE/RAGE and TNF-alpha signaling[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008,295(2)：H475-476.DOI：10.1152/ajpheart.00644.2008.

[5]JANDELEIT-DAHM K,WATSON A,SORO-PAAVONEN A.The AGE/RAGE axis in diabetes-accelerated athemsdemsis[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35(3)：329-334.DOI：10.1111/j.1440-1681.2007.04875.x.

[6]OTT C,JACOBS K,HAUCKE E,et al.Role of advanced glycation end products in cellular signaling[J].Redox Biol,2014,2：411-429.DOI：10.1016/j.redox.2013.12.016.

[7]WANG Z,JIANG Y,LIU N,et al.Advanced glycation end-product Nε-carboxymethyl-Lysine accelerates progression ofatherosclerotic calcification in diabetes[J].Atherosclerosis,2012,221(2)：387-396.DOI：10.1016/j.atherosclerosis.2012.01.019.

[8]COUGHLAN M T,THORBURN D R,PENFOLD S A,et al.RAGE-induced cytosolic ROS promote mitochondrial superoxide generation in diabetes[J].J Am Soc Nephrol,2009,20(4)：742-752.DOI：10.1681/ASN.2008050514.

[9]YAMAGISHI S,INAGAKI Y,OKAMOTO T,et al.Advanced glycation end product-induced apoptosis and overexpression of vascular endothelial growth factor and monocyte chemoattractant protein-1 in human-cultured mesangial cells[J].J Biol Chem,2002,277(23)：20309-20315.DOI：10.1074/jbc.M202634200.

[10]CECIL D L，TERKELTAUB R A.Arterial calcification is driven by RAGE in Enpp1-/-mice[J].J Vasc Res,2011,48(3)：227-235.DOI：10.1159/000318805.

[11]TANIKAWA T,OKADA Y,TANIKAWA R,et al.Advanced glycation end products induce calcification of vascular smooth muscle cells through RAGE/p38 MAPK[J].J Vasc Res,2009,46(6)：572-580.DOI：10.1159/000226225.

[12]REN X,SHAO H,WEI Q,et al.Advanced glycation end-products enhance calcification in vascular smooth muscle cells[J].J Int Med Res,2009,37(3)：847-854.

[13]YAMAGISHI S,MATSUI T,FUKAMI K.Role of receptor for advanced glycation end products(RAGE) and its ligands in cancer risk[J].Rejuvenation Res,2015,18(1)：48-56.DOI：10.1089/rej.2014.1625.

[14]SUGA T,ISO T,SHIMIZU T,et al.Activation of receptor for advanced glycation end products induces osteogenic differentiation of vascular smooth muscle cells[J].J Atheroscler Thromb,2011,18(8)：670-683.

[15]LI G,XU J,LI Z.Receptor for advanced glycation end products inhibits proliferation in osteoblast through suppression of Wnt,PI3K and ERK signaling[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,423(4)：684-686.DOI：10.1016/j.bbrc.2012.06.015.

[16]KWAN TAT S，AMIABLE N,PELLETIER J P,et al.Modulation of OPG,RANK and RANKL by human ehondrecytes and their implication during osteoarthritis[J].Rheumatology(Oxford)，2009，48(12)：1482-1490.DOI：10.1093/rheumatology/kep300.

[17]BEAZLEY K E,DEASEY S,LIMA F,et al.Transglutaminase 2-mediated activation of β-catenin signaling has a critical role in warfarin-induced vascular calcification[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(1)：123-130.DOI：10.1161/ATVBAHA.111.237834.

[18]CHENG S L,SHAO J S,HALSTEAD L R,et al.Activation of vascular smooth muscle parathyroid hormone receptor inhibits Wnt/beta-catenin signaling and aortic fibrosis in diabetic arteriosclerosis[J].Circ Res,2010,107(2)：271-282.DOI：10.1161/CIRCRESAHA.110.219899.

[19]VAN TUYL L H,VOSKUYL A E，BOERS M,et al.Baseline RANKL：OPG ratio and marker of bone and cartilage degradation predict annual radiological progression over 11 years in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2010，69(9)：1623-1628.DOI：10.1136/ard.2009.121764.

[20]NENNA A,SPADACCIO C,LUSINI M，et al.Basic and clinical research against advanced glycation end products(AGEs)：new compounds to tackle cardiovascular disease and diabetic complications[J].Recent Adv Cardiovasc Drug Discovery,2015,10(1)：10-33.DOI：10.2174/1574890110666151104120039.

(本文編輯：吳立波)

Mechanism of Action of Advanced Glycation End Products in the Regulation of Smooth Muscle Cells Calcification

HEHu-qiang，ZENGHong，SUNXiao-lei，ZHANGLei，WANGWei-ming,XUXiong-fei,HEYan-zheng，LIUYong*

DepartmentofVascularSurgery,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China

*Correspondingauthor：LIUYong,Chiefphysician；E-mail：lyong74@163.com

Objective To investigate the mechanism of action of advanced glycation end products(AGEs) in regulating the receptor of AGEs(RAGE) for promoting calcification of human femoral arterial smooth muscle cells.Methods This study was carried out between January 2014 and March 2015.The tunica media of femoral artery was cut into tissue blocks of 1-2 mm in length for adherent culture.We selected the cultured smooth muscle cells of 3-8 generation for the experiment and divided them into 4 groups for further culture,group A with DMEM culture medium;group B using DMEM+10 mmol/L β-sodium phosphate;group C using DMEM+10 mmol/L β-sodium phosphate+AGEs 20 mg/L;and group D with DMEM+10 mmol/L β-sodium phosphate+AGEs 40 mg/L.Cells in each group were intervened for 96 hours.Three pairs of random RAGE siRNA were synthesized,and used to transfect the smooth muscle cells of group C with a concentration of 50 nmol/L.The efficacy of siRNA was measured 24 h later.The sequences with high transfection efficiency were selected for experiment.The calcium deposition in smooth muscle cells were observed by Von Kossa staining before and after RAGE-specific siRNA transfection.The expression levels of RAGE,β-catenin,and osteoprotegerin(OPG) were detected by Western blotting.Results In the non-transfected cells,there was no calcified plaque in group A,while group B showed obvious calcification plaques;in groups C and D,the number of cytoplasm and nucleus of the smooth muscle cells in red increased and calcified plaques increased significantly.After RAGE-specific siRNA transfection,the number of cytoplasm and nucleus of the smooth muscle cells in red in group C was decreased compared with that before transfection,and the formation of calcified plaque was inhibited.Before RAGE-specific siRNA transfection,the expression levels of RAGE,β-catenin,and OPG in smooth muscle cells differed significantly among the groups(P<0.05),specifically,the expression levels of RAGE,β-catenin,and OPG in smooth muscle cells were higher in group C than in group B,and they were higher in group D than in groups B and C(P<0.05).The expressions of RAGE,β-catenin,and OPG in smooth muscle cells in group C were lower after RAGE-specific siRNA transfection compared with those before transfection(P<0.01).Conclusion AGEs mediate smooth muscle cells calcification by regulating RAGE，the mechanism may be that RAGE activates the Wnt/ β-catenin signaling pathway and by which the expression level of β-catenin downstream protein OPG is increased.

Diabetes mellitus；Vascular calcification；Advanced glycation end products;Osteoprotegerin

國家自然科學基金面上項目(81270358)

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.y03

2016-08-12；

2017-02-08)

646000四川省瀘州市，西南醫科大學附屬醫院血管外科

*通信作者：劉勇,主任醫師；E-mail：lyong74@163.com