紅肉桃兩類花色素苷積累模式與相關基因表達差異

丁體玉，曹珂，方偉超，朱更瑞，陳昌文，王新衛，王力榮

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紅肉桃兩類花色素苷積累模式與相關基因表達差異

丁體玉，曹珂，方偉超，朱更瑞，陳昌文，王新衛，王力榮

（中國農業科學院鄭州果樹研究所，鄭州 450009）

【目的】分析中國主要紅肉桃種質呈色類型及分子機理，為紅肉桃種質優異基因發掘和分子標記輔助選擇育種奠定理論基礎?！痉椒ā窟x擇8份紅肉桃種質和1份白肉桃種質為試材，分別在花后一個月開始采集樣品，以后每隔10 d左右采集一次，至果實成熟期為止；用2%甲酸甲醇提取不同種質果肉的花色素苷，分別測定其在510 nm和700 nm的吸光值；利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法，測定與花色素苷合成相關的13個關鍵結構基因和調節基因的表達水平?！窘Y果】根據果實發育中后期花色素苷含量的變化趨勢可將8份紅肉桃種質分為2類，一類種質的花色素苷合成高峰出現在果實成熟期（成熟期積累型），如‘鄭引82-9’‘大紅袍’‘黑布袋’‘紅桃’和‘天津水蜜’；另一類種質的花色素苷合成高峰出現在果實發育中期，在成熟期花色素苷含量有所下降（發育中期積累型），如‘哈露紅’‘大果黑桃’和‘烏黑雞肉桃’。在與花色素苷合成相關的結構基因中，和的表達量與成熟期積累型種質的花色素苷含量的變化趨勢一致；而發育中期積累型種質，果肉中花色素苷的大量積累與所有結構基因的表達趨勢一致。在4個調控基因中，只有的表達水平較高，且表達模式同紅肉桃種質兩類花色素苷積累模式相似?！窘Y論】根據桃果肉著色規律和花色素苷積累模式，8份紅肉桃可以分為成熟期積累型和發育中期積累型種質。和是成熟期積累型種質的關鍵結構基因，而在供試的所有紅肉桃種質花色素苷合成中起關鍵作用。

紅肉桃；花色素苷；花色素苷合成相關基因

0 引言

【研究意義】花色素苷是植物體內的一類次生代謝物質，不僅能夠幫助植物自身免受紫外線灼傷和抵御病蟲害，還可以吸引昆蟲為其授粉。同時，食用富含花色素苷物質的果實對人體健康也有保護和促進作用[1-2]，大量的體外研究表明，花色素苷通過其較強的自由基清除作用，而表現出抗炎[3]、保護心血管[4]、抗腫瘤[5]等多種生物活性。紅肉桃是桃中富含花色素苷的一種重要類型，其花色素苷含量遠高于白肉桃和黃肉桃[6]。Cevallos-Casals等[7]研究發現，紅肉桃種質的抗氧化能力與花色素苷含量的相關性達到顯著水平。沈志軍等[8]通過相關性分析發現，抗氧化能力指標（relative antiradical capacity，RAC；ferric reducing ability of plasma，FRAP）在果皮、果肉和全果中與花色素苷含量的相關性均達到顯著水平。因此，隨著消費者對果品類型多樣化和保健功能關注度的不斷增強，富含花色素苷的紅肉桃逐漸成為當前國內外功能性水果開發研究的熱點[9-10]?！厩叭搜芯窟M展】人們普遍認為紅肉桃的果實在成熟期時才大量積累紅色素[11-13]。但CHAPARRO等[14]和WERNER等[15]在研究加拿大紅肉種質‘Harrow Blood’時發現其果實花色素苷是在花后45—50 d開始積累，而成熟前有所下降。SHEN等[16]研究了中國紅肉品種‘WuYueXian’，認為‘WuYueXian’的紅肉性狀確實不同于‘Harrow Blood’等資源，其花色素苷含量在果實成熟前迅速增加。ZHOU[17]等研究紅肉品種‘大紅袍’時，同樣得出花色素苷是在成熟前10 d開始積累，成熟時達到最大?；ㄉ剀盏纳锖铣墒侵参镱慄S酮合成途徑的一個重要分支，在擬南芥、矮牽牛、玉米等模式植物中該合成通路已研究的較為清楚。對于該過程中調節結構基因的關鍵酶，研究者[18-19]認為苯丙氨酸解氨酶（PAL）只是催化合成花色素苷的前提物質，當前體物質充足時，花色素苷的積累將不隨PAL活性的變化而變化。LISTER等[20]報道則指出苯基苯乙烯酮黃烷酮異構酶（CHI）活性的上升與蘋果果皮中花色素苷含量的增加相一致，然而也有學者認為CHI在著色初期保持高活性，催化生成黃烷酮，在為花色素苷合成提供足夠的底物后，其活性逐漸下降，并沒有隨花色素苷的積累而保持在較高水平[21]。部分學者[22-23]的研究表明，只是在果實接近成熟的轉色期表達，表達的強度與花色素苷合成呈正相關，且該基因只在紅色果皮中特異表達，在根、芽、種子等部位不表達[24]，以上研究結果說明是蘋果果皮紅色的關鍵基因之一。除了結構基因外，也有研究表明植物器官的紅色發育及花色素苷代謝與MYB轉錄因子有關，蘋果方面的研究[25]認為MYB10轉錄因子通過調控和的轉錄進而調控花色素苷的合成，而且MYB10具有與bHLH互作的結構功能域，兩者形成轉錄蛋白復合體共同調控花色素苷的代謝[26]。因此，花色素苷合成的調控通路是十分復雜的，不同植株甚至是果實的不同發育階段、不同組織部位，其調控花色素苷合成的能力存在差異?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于紅肉桃種質的花色素苷積累模式的研究主要集中在‘Harrrow Blood’[15]和‘WuYueXian’[16]兩個紅肉桃品種，對中國其他的紅肉桃資源[27-30]研究較少?！緮M解決的關鍵問題】利用pH示差法和qRT-PCR技術分別檢測中國紅肉桃發育過程中花色素苷積累動態和相關基因的表達變化，明確中國紅肉桃種質資源花色素苷的積累類型，并從花色素苷積累與合成相關基因的表達層面解析不同類型的調控模式，為紅肉桃基因發掘和新品種培育提供參考。

1 材料與方法

試驗于2016年在中國農業科學院鄭州果樹研究所進行。

1.1 試材及其取樣

以中國農業科學院鄭州果樹研究所國家果樹種質資源鄭州桃圃的8份紅肉桃和1份白肉桃作為試驗材料（表1）。

選取樹勢一致的植株，于2016年4—8月期間，選擇大小均勻、果形正常、無病蟲害的果實，分別在盛花后一個月開始樣品的采集，以后每隔10 d左右采集一次（果實轉色時期密集采樣）。每份種質隨機采取5個果實，削去表皮，取中果皮果肉，液氮速凍，保存至-80℃冰箱備用。9份種質果實采樣時期見表1。

表1 9份桃種質果實的采樣時期

S1—S15代表桃果實采樣時期（圖1）

S1 to S15 represents the sampling dates (Fig. 1)

1.2 總花色素苷提取及測定

取冷凍保存的果肉樣品加液氮并用冷凍研磨機研磨成均勻的粉末，然后取5 g研磨好的果肉粉末，分3次加入8 mL 2%甲酸甲醇，充分混勻后，超聲儀提取20 min（常溫，40 Hz，100 W），搖床振蕩20 min（常溫，250 r/min），離心8 min（常溫，9 600 r/min），將上清液轉到50 mL離心管內，重復提取3次，合并提取液，再次離心（常溫，9 600 r/min），最后將所有上清液轉到25 mL棕色容量瓶并用2%甲酸甲醇定容，待測。每個樣品重復3次。

參照孫婧超等[31]的方法并加以改良，取1 mL上述提取液于兩支10 mL試管中，分別加入9 mL 0.2 mol?L-1KCl（pH 1.0）和0.2 mol?L-1CH3CO2Na·3H2O（pH 4.5）緩沖液避光平衡20 min后，以2%甲酸甲醇為空白對照，分別于分光光度計510 nm和700 nm下在30 min內測定所有樣品吸光度A。

稀釋后樣品吸光度ΔA按下式進行計算：

ΔA=(A510-A700) pH 1.0–(A510-A700) pH 4.5。

樣品花色素苷含量按下式計算：

提取液花色素苷濃度W (mg?L-1) = [(ΔA× MW) / (ε × 1)] × Df × 1000；

果肉樣品花色素苷含量 (mg?kg-1) = W × 25 / 5。

式中，MW：矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量（449 mg?mol-1）；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數（29 600 L·mol-1·cm-1）；Df：稀釋因子（樣品總的稀釋倍數）。

1.3 總RNA的提取及qRT- PCR檢測

分別取若干樣品，研磨成粉末狀，用改良的CTAB法提取樣品的總RNA，參照TaKaRa公司DNaseⅠ操作說明消化DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用核酸蛋白儀檢測RNA濃度和純度。采用ReverTra qPCR RT（TOYOBO，上海）試劑盒進行反轉錄，用ddH2O稀釋5倍，保存于 -20℃冰箱，備用。引物（表2）由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，qRT-PCR反應采用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix在ViiATM7 Real-time PCR System（Roche，China）上進行。反應體系20 μL，包括：10 μL的SYBR Green PCR Master Mix、2 μL稀釋的cDNA、0.3 μL上游引物（10 μmoL?L-1）、0.3 μL下游引物（10 μmoL?L-1），ddH2O補至20 μL。每個樣品3個重復，反應程序如下：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，40個循環。

1.4 統計分析

以2為內參基因[32]，采用2-△△CT法[33]計算花色素苷合成酶基因的相對表達量[17,34]，使用Excel 2010進行數據統計，并制作趨勢圖。利用R 3.3.1中的‘ggplot’軟件繪制熱圖。

表2 熒光定量PCR所用基因的引物序列

PAL：苯丙氨酸解氨酶；CHS：查爾酮合成酶；CHI：苯基苯乙烯酮黃烷酮異構酶；F3H：黃烷酮-3-羥化酶；F3’H：類黃酮-3’-羥化酶；DFR：二氫黃酮醇-4-還原酶；LDOX：花色素合成酶；UFGT：UDP-葡萄糖類黃酮3-O-糖基轉移酶；GST：谷胱甘肽-S-轉移酶；：內參基因；：MYB家族轉錄因子；：bHLH家族轉錄因子；：WD40家族轉錄因子；：NAC家族轉錄因子

PAL: Phenylalanine ammonia lyase ; CHS:Chalcone synthase; CHI: Chalcone isomeras; F3H: Flavanone 3-hydroxylas; F3’H : Flavonoid 3’-hydroxylase; DFR: Dihydroflavonol-4-reductas; LDOX: Leucoanthocyanidin dioxygenase; UFGT: UDPG-flavonoid glucosyltransferase; GST: Glutathione-S-Transferase;: Reference gene;: MYB family transcription factors;: bHLH family transcription factor;: WD40 family transcription factor;: NAC family transcription factor

2 結果

2.1 桃種質果實發育期果肉顏色和總花色素苷含量

從圖1可以看出，在整個發育階段白肉桃‘鄭白5-2’果肉顏色由青變白，至成熟時果實也未著色；而所有紅肉桃果肉顏色都呈現由綠逐漸轉紅，但不同品種的轉色期則存在差異，如‘鄭引82-9’‘天津水蜜’‘紅桃’‘大紅袍’和‘黑布袋’在果實臨近成熟時紅色逐漸加深至成熟時達到最紅，在著色部位上表現為果肉全紅或近表皮果肉呈圈紅。而‘大果黑桃’‘哈露紅’和‘烏黑雞肉桃’的果肉顏色在花后60—120 d（即硬核期）時逐漸變紅至黑紅色，隨著果實成熟色澤又變淺，果肉的著色部位集中在中果皮和近表皮果肉上，而近核處果肉不著色。

由于桃果肉的紅色主要決定于果實中花色素苷的含量[35]，因此，本研究采用pH示差法測定了桃不同發育階段果肉中花色素苷的含量，作為果肉顏色變化的參考。由圖1可知，8份紅肉桃種質的花色素苷在整個生育期有2個合成高峰，第1個高峰均開始于盛花期后，盛花后約30 d達最大值，第2個高峰則在不同的紅肉桃種質中出現的時期不同。具體為：‘鄭引82-9’‘天津水蜜’‘紅桃’‘大紅袍’和‘黑布袋’分別在其盛花后65 d、98 d、89 d、89 d和89 d花色素苷含量逐漸上升，至成熟時達到第2個合成高峰；‘大果黑桃’‘哈露紅’和‘烏黑雞肉桃’的果肉花色素苷分別在盛花后61 d、61 d和51 d開始升高，至盛花后79 d、89 d和72 d達到第2個合成高峰，之后，隨著果實成熟其花色素苷含量有所下降。

綜上所述，根據不同紅肉桃花色素苷含量在第1個合成高峰后的趨勢與果肉著紅色的動態變化可以把紅肉桃分為兩類：一類是成熟期積累型，具體表現為在果實接近成熟時果肉開始著紅色，至成熟時花色素苷含量達到最大；二是發育中期積累型，該類果實在盛花后約50 d開始著紅色并不斷加深，接近成熟時又變淺，花色素苷含量也呈下降的趨勢。

2.2 桃種質果實發育期果肉花色素苷合成結構基因的表達分析

由圖2可知，對照‘鄭白5-2’的、、、、、和在果實發育前期表達量較高，這與其花后51 d前果實中較高的花色素苷含量是一致的（圖1-a）；在‘鄭白5-2’的果實發育中期表達，而在整個果實發育期均不表達。對于成熟期積累型的5份種質來說，基因、、和在除‘天津水蜜’之外的4份種質的果實發育后期表達逐漸升高；而和只在‘鄭引82-9’‘大紅袍’和‘黑布袋’的果實發育后期有高的表達；僅有基因、和的表達模式與5份紅肉桃種質的果實著色規律和花色素苷積累基本一致，即在果實成熟期表達量較高，是該類紅肉桃種質花色素苷合成的關鍵結構基因。而在屬于發育中期積累型的3份種質中，9個結構基因均在果實發育的中前期表達水平最高，隨后呈下降趨勢。

a：鄭白5-2；b：鄭引82-9；c：天津水蜜；d：紅桃；e：大紅袍；f：黑布袋；g：大果黑桃；h：哈露紅；i：烏黑雞肉桃 a: Zheng Bai 5-2; b: Zheng Yin 82-9; c: Tianjin Shui Mi; d: Hong Tao; e: Da Hong Pao; f: Hei Bu Dai; g: Da Guo Hei Tao; h: Harrow Blood; i: Wu Hei Ji Rou Tao. 誤差用標準差表示 Earror bars show the SE of the mean

圖2 兩種紅肉桃類型關鍵基因的相對表達量

2.3 桃種質果實發育期果肉花色素苷合成調節基因的表達分析

為鑒定不同紅肉桃種質的花色素苷合成是否受到轉錄調節，選擇在桃上已有報道的花色素苷合成調控轉錄因子[17]、[36]、[34]和[17]，測定其在果實發育過程中的表達變化。由圖2可知，在5份成熟期積累型紅肉桃種質中，只有的表達與、和的表達趨勢一致，而、和僅在‘天津水蜜’‘大紅袍’和‘紅桃’果實發育前期的某個時期有高表達，與關鍵結構基因的表達相關性不強。

在3份發育中期積累型種質中，同樣只有與關鍵結構基因表達一致，而在‘大果黑桃’的后期、‘烏黑雞肉桃’和‘哈露紅’的前期表達量較高，在‘烏黑雞肉桃’和‘哈露紅’的果實發育前期同樣高表達，在3份紅肉桃種質果肉中均未檢測到表達。

2.4 不同類型紅肉桃花色素苷含量及其相關基因表達量的比較

為了比較不同紅肉桃類型種質花色素苷和關鍵基因絕對含量的差異，如圖3所示，選擇‘天津水蜜’和‘大果黑桃’分別作為成熟時期積累型和發育中期積累型的代表品種，仍選擇‘鄭白5-2’為對照種質，其中S1—S3為3個品種的果實發育前期，S4—S6、S4—S10和S4—S7分別為‘天津水蜜’‘大果黑桃’和‘鄭白5-2’的果實發育中期（硬核期），S7—S10、S11—S15和S8—S11分別為‘天津水蜜’‘大果黑桃’和‘鄭白5-2’的果實發育后期。結果顯示，中期積累型種質‘大果黑桃’在花色素苷合成達到峰值時的含量為690.76 mg·kg-1，而成熟期積累型種質‘天津水蜜’在果實發育后期花色素苷合成達到峰值時的含量為216.07 mg·kg-1，僅相當于‘大果黑桃’花色素苷峰值的1/3。在果實發育后期，雖然‘大果黑桃’花色素苷含量下降至79.40 mg·kg-1，低于同期的‘天津水蜜’，但仍高于白肉桃‘鄭白5-2’。關鍵基因、和在中期積累型種質‘大果黑桃’花后61 d高表達，而成熟期積累型種質‘天津水蜜’在果實發育后期表達量同樣達到最大。并且在果實發育后期，雖然‘大果黑桃’、和表達量下降，并低于同期的‘天津水蜜’，但仍高于白肉桃‘鄭白5-2’。說明‘天津水蜜’和‘大果黑桃’關鍵基因的表達量規律與其花色素苷合成規律具有一致性。

圖3 兩種紅肉類型代表品種花色素苷合成關鍵基因的表達量與其果實花色素苷含量關系的比較

3 討論

3.1 紅肉桃果肉花色素苷積累的動態變化

CHAPARRO等[14]和WERNER等[15]研究了法國品種‘Harrow Blood’的果肉花色素苷合成規律，認為它與果實發育后期迅速積累花色素苷的種質‘Red English’和‘Indian Blood’不一樣，屬于發育中期積累型（花后45—50 d）。SHEN等[16]對中國古老的紅肉桃資源‘WuYueXian’果肉花色素苷進行測定，發現其花色素苷在果實成熟前期大量積累，屬于成熟期積累型。在本研究中，選取了8份具有代表性的紅肉桃種質探索紅肉桃資源的著色類型，檢測結果發現紅肉桃果肉花色素苷合成有2個高峰，第1個出現在幼果期，第2個高峰期出現在果實發育中期或者成熟期，該時期隨紅肉桃種質的不同而不同。根據第2個時期出現的早晚將8份種質分為成熟期積累型（如‘鄭引82-9’‘天津水蜜’‘大紅袍’‘黑布袋’和‘紅桃’）和發育中期積累型（如‘大果黑桃’‘烏黑雞肉桃’和‘哈露紅’）。雖然發育中期積累型種質花色素苷含量在果實成熟期下降，但果肉仍為紅色，仍屬于紅肉桃類型。

在對本研究供試材料的花色素苷進行測定時，發現幼果期花色素苷合成也有1個高峰，該結果與章秋平等[37]在紅肉桃品種‘天津水蜜’盛花后25 d果肉中發現的花色素苷合成高峰是一致的。在蘋果上，鞠志國等[38]同樣認為，蘋果果皮中花色素苷在幼果期和成熟期各有1個合成高峰，然而，通過直接觀察果肉橫切面，筆者卻并未在幼果期的果肉中看到明顯的紅色。分析原因，可能與果實發育早期果肉中存在大量的多酚物質從而干擾了花色素苷的測定有關。在果實發育早期，酚酸類、黃烷3-醇和黃酮醇大量積累，隨著果實成熟期含量不斷下降[39-40]，其對花色素苷測定的影響也將逐漸降低。

3.2和是桃果肉花色素苷合成的關鍵結構基因

在桃果肉花色素苷代謝通路中，JIAO等[41]通過對紅肉桃‘Beijingyixianhong’和‘Heiyoutao’果實進行套袋試驗發現，和的表達在去袋后的第3天上調，認為這2個基因是調控花色素苷合成的關鍵基因。而RAVAGLIA[34]的研究卻發現，在油桃‘Stark Red Gold’果肉中僅的表達與花色素苷的積累相關，與BOSS等[42]和KOBAYASHI等[43]研究結果一致。在本研究中，從8份花色素苷積累模型不同的紅肉桃中發現、和與果肉花色素苷的積累相關性較強，即這3種基因可能是紅肉桃種質花色素苷合成的關鍵基因。其中，雖然與紅色形成有關，但由于其與花色素苷的轉運有關，因此并不是嚴格意義上的花色素苷合成結構基因[44]。

3.3在桃果肉花色素苷合成中起到重要作用

對紅肉性狀進行連鎖分析從而定位數量性狀位點（Quantitative trait locus，QTLs），是準確鑒定不同紅肉品種花色素苷合成關鍵調節基因的基礎。LIN- WANG等[45]根據蘋果克隆了桃，認為第3 連鎖群上紅肉性狀QTLs區段的主效基因就是。GILLEN等[46]利用加拿大的一份紅肉桃品種‘Harrow Blood’（在本研究中為‘哈露紅’）的雜交群體，將紅肉隱性基因定位在第4連鎖群頂端，但未進行關鍵基因的預測。ZHOU等[17]利用‘大紅袍’的雜交群體，將第5 連鎖群紅肉性狀QTLs加密到200 kb 的范圍內；并在該區間中發現一個（命名為）在紅肉和白肉品種中表達差異顯著，認為是控制紅肉性狀的候選基因；隨后的瞬時轉化煙草和桃果肉試驗證實該基因可通過調控位于第3連鎖群上的影響花色素苷的合成。綜上所述，在不同來源的紅肉種質中均有作用，有時是直接有時是間接。在本研究中，也發現僅的表達與8份紅肉種質花色素苷的積累趨勢一致，而僅在‘鄭引82-9’和‘黑布袋’這2份成熟期積累型種質的發育后期有表達，而發育中期積累型的種質中，未檢測到的表達。該結果同樣說明在調控花色素苷合成的通路中起到了直接或間接的作用。然而，通過表達分析僅能說明該基因是重要的，究竟該基因是否為導致表型出現差異的直接原因，仍需要結合連鎖分析和DNA序列差異進行解析。

3.4 兩類紅肉桃品種的遺傳背景分析

為了探究兩類紅肉桃種質花色素苷合成通路的差異是否與其具有不同的遺傳背景有關，查閱了前人對供試紅肉桃品種遺傳背景分析的有關文獻。CAO等[47]基于53對全基因組簡單重復序列（simple sequence repeat, SSR）標記對來自6個不同區域的104份種質構建系統發育樹，分析中國桃種質的多樣性，可將104份種質分為5個群，在本研究所用的8份紅肉桃僅有5份種質包含其中，分別為‘天津水蜜’‘黑布袋’‘大果黑桃’‘烏黑雞肉桃’和‘大紅袍’，前4份種質親緣關系較近，‘大紅袍’與它們親緣關系較遠。LI等[48]基于48個多態性高的SSR標記對來自東方和西方的653份種質構建系統發育樹，發現‘天津水蜜’與‘烏黑雞肉桃’親緣關系較近，其次是‘哈露紅’，它們與‘大紅袍’的親緣關系較遠，本研究所用的其他種質未知。MICHELETTI 等[49]收集了來自世界各地共1 580份桃種質，基于4 271個單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）構建系統發育樹，發現‘天津水蜜’與‘烏黑雞肉桃’親緣關系較近，其次是‘大紅袍’，它們與‘哈露紅’的親緣關系較遠，本研究中的其他種質也未涉及到。綜上所述，在已有遺傳多樣性或群體結構分析的研究中，‘天津水蜜’與‘烏黑雞肉桃’親緣關系較近，而與‘大紅袍’親緣關系較遠。然而，在本研究中，‘天津水蜜’與‘大紅袍’表現為花色素苷成熟期積累型，‘烏黑雞肉桃’卻表現為發育中期積累型。因此，通過全基因組分析的遺傳多樣性或種群結構與通過特定性狀調控通路的相似性分析結果間并無絕對的聯系。

4 結論

根據桃果肉著色和花色素苷含量的動態變化，8份紅肉桃可分為兩類：一類為成熟期積累型，如‘鄭引82-9’‘大紅袍’‘黑布袋’‘紅桃’和‘天津水蜜’；一類為發育中期積累型，如‘哈露紅’‘大果黑桃’和‘烏黑雞肉桃’。和是花色素苷成熟期積累型種質的關鍵結構基因，而在供試的所有紅肉桃種質花色素苷合成中起到關鍵調控作用。

References

[1] KONG J M, CHIA L S, GOH N K, CHIA T F, BROUILLAR D R. Analysis and biological activities of anthocyanins., 2003, 64(5): 923-933.

[2] MARTIN C, BUTELLI E, PETRONI K, TONELLI C. How can research on plants contribute to promoting human health?, 2011, 29(3): 1685-1699.

[3] WANG J, MAZZA G. Inhibitory effects of anthocyanins and other phenolic compounds on nitric oxide production in LPS/IFN activated RAW 264.7 macrophages., 2002, 50(4): 850-857.

[4] XIA X D, LING W H, MA J, XIA M, HOU M J, WANG Q, ZHU H L, TANG Z H. An anthocyanin-rich extract from black rice enhances atherosclerotic plaque stabilization in apolipoprotein E-deficient mice, 2006, 136(8): 2220-2225.

[5] KANG S Y, SEERAM N P, NAIR M G, BOURQUIN L D. Tart cherry anthocyanins inhibit tumor development in ApcMinmice and reduce proliferation of human colon cancer cells., 2003, 94(1): 13-19.

[6] WU X L., PRIOR R L. Systematic identification and characterization of anthocvanins by HPLC -ESI-MS/MS in common foods in the united states: Fruits and Berries., 2005, 53(7): 2589-2599.

[7] CEVALLOS-CASALS B A, BYRNE D, OKIE W R, CISNEROS- ZEVALLOS L. Selecting new peach and plum genotypes rich in phenolic compounds and enhanced functional properties., 2006, 96(2): 273-280.

[8] 沈志軍, 馬瑞娟, 俞明亮, 許建蘭, 蔡志翔, 倪林箭, 顏少賓. 桃三種肉色類型果實抗氧化因子的比較評價. 中國農業科學, 2012, 45(11): 2232-2241.

SHEN Z J, MA R J, YU M L, XU J L, CAI Z X, NI L J, YAN S B. Evaluation of anti-oxidant factors in peach with three types of flesh color., 2012, 45(11): 2232-2241. (in Chinese)

[9] KRIS-ETHERTON P, HECKER K, BONANOME A, COVAL S, BINKOSKI A, KIRSTEN H, GRIEL A, ETHERTON T. Bioactive compounds in foods: Their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer., 2002, 113(9): 71-88.

[10] WINKEL-SHIRLEY B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology., 2001, 126(2): 485-493.

[11] BLAKE J S. Progress in peach breeding., 1937, 35: 49-53.

[12] HSIA C L, LUH B S, CHICHESTER C O. Anthocyanin in freestone peaches., 1965, 30(1): 5-12.

[13] VAN BLARICOM L, SENN T. Anthocyanin pigments in freestone peaches grown in the Southeast., 1967, 90(6): 541-545.

[14] CHAPARRO J, WERNER D, WHETTEN R, O’MALLEY D M. Inheritance, genetic interaction, and biochemical characterization of anthocyanin phenotypes in peach., 1995,86(1): 32-38.

[15] WERNER D J, CRELLER M A, CHAPARRO J X. Inheritance of the blood-fleshtrait in peach., 1998, 33(7): 1243-1246.

[16] SHEN Z, CONFOLENT C, LAMBERT P, PO?SSEL J, QUILOT- TURION B, YU M, MA R, PASCAL T. Characterization and genetic mapping of a new blood-?esh trait controlled by the single dominant locusin peach., 2013(9): 1435-1446.

[17] ZHOU H, WANG K L, WANG H L, GU C, ANDREW P D, RICHARD V E, HE Y P, Andrew C, Han Y P. Molecular genetics of blood-fleshed peach reveals activation of anthocyanin biosynthesis bytranscription factors., 2015, 82(1): 105-121.

[18] 原永兵, 劉成連, 鞠志國. 蘋果果皮紅色形成的機制//園藝學年評. 北京: 科學出版社, 1995: 12-13.

YUAN X B, LIU C L, JU Z G. Mechanism of red formation in apple peel//. Beijing: Science Press, 1995: 12-13. (in Chinese)

[19] JU Z G, YUAN Y B, LIU C L, XIN S H. Relationship among phenylalanine ammonia-lyase activity, simple phenol concentrations and anthocyanin accumulation in apple., 1995, 61: 215-226.

[20] LISTER C E, LANCASTER J E. Developmental changes in enzymes of flavonoid biosynthesis in the skins of red and green apple cultivars., 1996, 71(3): 313-320.

[21] 張學英. 李果實著色與花色素苷合成機理研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2008.

ZHANG X Y. Study on the mechanism of fruit coloring and anthocyanin biosynthesis [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2008. (in Chinese)

[22] JU Z G, LIU C L, YUAN Y B. Activities of chalcone synthase and UDPGaI: Flavonoid-3-O-glycosyl transferase in relation to anthocyanin synthesis in apple., 1995, 63: 175-185.

[23] HONDA C, KOTADA N, WADA M, KONDO S, KOBAYASHI S, SOEJIMA J, ZHANG Z, TSUDA T, MORIGUCHI T. Anthocyanin biosynthetic genes are coordinately expressed during red coloration in apple skin., 2002, 40(11): 955-962.

[24] KIM S H, LEE J R, HONG S T, YOO Y K, AN G, KIM S R. Molecular cloning and analysis of anthocyanin biosynthesis genes preferentially expressed in apple skin., 2003, 165(2): 403-413.

[25] ESPLEY R V, HELLENS R P, ALLAN A C. An R2R3 MYB transcription factor associated with regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae., 2010, 10(50): 1471-1488.

[26] 王延玲, 張艷敏, 馮守千, 田長平, 王海波, 劉遵春, 宋楊, 陳學森. 新疆紅肉蘋果轉錄因子基因的克隆、序列分析及原核表達. 中國農業科學, 2010, 43(13): 2735-2743.

WANG Y L, ZHANG Y M, FENG S Q, TIAN Z P, WANG H B, LIU Z C, SONG Y, CHEN X S. Cloning, sequence analysis and prokaryotic expression of transcription factorgene in Xinjiang red-meat apple., 2010, 43(13): 2735-2743. (in Chinese)

[27] 汪祖華, 莊恩及. 中國果樹志(桃卷). 北京: 中國林業出版社, 2001.

Wang Z H, Zhuang E J.. Beijing: Chinese Forest Press, 2001.(in Chinese)

[28] 王富榮, 何華平, 龔林忠, 王會良, 顧霞, 諸小敏. 湖北地方紅肉桃種質資源收集、評價及利用. 湖北農業科學, 2013, 52(15): 3562-3565.

WANG F R, HE H P, GONG L Z, WANG H L, GU X, ZHU X M. Collection, evaluation and breeding utilization of red-flesh peach germplasm resources in Hubei province., 2013, 52(15): 3562-3565. (in Chinese)

[29] 王富榮, 何華平, 龔林忠, 顧霞. 紅肉桃種質資源的AFLP分析. 湖北農業科學, 2008, 47(2): 138-141.

WANG F R, HE H P, GONG L Z, GU X. Analysis of genetic relationship of red-flesh peach germplasm resource by AFLP markers., 2008, 47(2): 138-141. (in Chinese)

[30] 賈敬賢. 果樹種質資源目錄. 北京: 中國農業出版社, 1993.

Jia J X.. Beijing: China Agriculture Press, 1993. (in Chinese)

[31] 孫婧超, 劉玉田, 趙玉平, 歐燕, 龐少華. pH示差法測定藍莓酒中花色素苷條件的優化. 中國釀造, 2011(11): 171-174.

SUN J C, LIU T Y, ZHAO Y P, OU Y, PANG S H. Determination of anthocyanin in blueberry wine by pH differential method., 2011(11): 171-174. (in Chinese)

[32] TONG Z G, GAO Z H, WANG F, ZHOU J, ZHANG Z. Selection of reliable reference genes for gene expression studies in peach using real-time PCR., 2009, 10(1): 71.

[33] LIVAK K J., SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod., 2001, 25(4): 402-408.

[34] RAVAGLIA D, ESPLEY RV, HENRY-KIRK R A, ANDREOTTI C, ZIOSI V, HELLENS R P, COSTA G, ALLAN A C. Transcriptional regulation of ?avonoid biosynthesis in nectarine () by a set of R2R3 MYB transcription factors., 2013, 13(68): 1-14.

[35] FRANCIS F J. Food colorants: Anthocyanins., 1989, 28(4): 273-314.

[36] RAHIM M A, BUSATTO N, TRAINOTTI L. Regulation of anthocyanin biosynthesis in peach fruits., 2014, 240(5): 913-929.

[37] 章秋平, 李疆, 王力榮, 朱更瑞, 方偉超, 曹珂, 陳昌文, 馮義彬. 紅肉桃果實發育過程中色素和糖酸含量的變化. 果樹學報, 2008, 25(3): 312-315.

ZHANG Q P, LI J, WANG L R, ZHU G R, FANG W C, CAO K, CHEN C W, FENG Y B. Study on the changes of contents of pigments, sugar and acid of blood flesh peach cultivar during fruit development., 2008, 25(3): 312-315. (in Chinese)

[38] 鞠志國, 原永兵, 劉成連, 戴洪義, 戰淑敏. 蘋果果皮中酚類物質合成規律的研究. 萊陽農學院學報, 1992, 9(3): 222-225.

JU Z G, YUAN Y B, LIU C L, DAI H Y, ZHAN S M. Study on synthesis of phenolic compounds in apple peel., 1992, 9(3): 222-225. (in Chinese)

[39] 周君, 陳宗玲, 張瓊, 王紅清. 套袋對桃果實成熟過程中酚酸類和類黃酮類物質積累的影響. 園藝學報, 2009, 36(12): 1717-1724.

ZHOU J, CHEN Z L, ZHANG Q, WANG H Q. Effects of bagging on the accumulation of phenolic acids and flavonoids in peach fruits during maturation., 2009, 36(12): 1717-1724. (in Chinese)

[40] Andreotti C, Ravaglia D, Ragaini A, Costa G. Phenolic compounds in peach [(L.) Batsch] cultivars at harvest and during fruit maturation., 2008, 153(1): 11-23.

[41] JIAO Y, MA R J, SHEN Z J, YAN J, YU M L. Gene regulation of anthocyanin biosynthesis in two blood-flesh peach ((L.) Batsch) cultivars during fruit development., 2014, 15(9): 809-819.

[42] BOSS P K, DAVIES C, ROBINSON S P. Expression of anthocyanin biosynthesis pathway genes in red and white grapes., 1996, 32(3): 565-569.

[43] KOBAYASHI S, ISHIMARU M, DING C K, YAKUSHIJI H, GOTO N. Comparison of UDP-glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase () gene sequences between white grapes () and their sports with red skin., 2001, 160(3): 543-550.

[44] MUELLER L A, GOODMAN C D, SILADY R A, WALBOT V. AN9, a petunia glutathione S-transferase required for anthocyanin sequestration, is a flavonoid-binding protein.,2000, 123(4): 1561-1570.

[45] LIN-WANG K, BOLITHO K, GRAFTON K, KORTSTEE A, KARUNAIRETNAM S, MCGHIE T, ESPLEY R, HELLENS R, ALLAN A. An R2R3 MYB transcription factor associated with regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae., 2010, 10: 50.

[46] GILLEN A M, BLISS F A. Identification and mapping of markers linked to thegene for root-knot nematode resistance in peach., 2005, 130(1): 24-33.

[47] CAO K, WANG L R, ZHU G R, FANG W C, CHEN C W, LUO J. Genetic diversity, linkage disequilibrium, and association mapping analyses of peach () landraces in China.2012, 8(5): 975-990.

[48] LI X W, MENG X Q, JIA H J, YU M L, MA R J, WNAG L R, CAO K, SHEN Z J, NIU L, TIAN J B, CHEN M J, XIE M, ARUS P, GAO Z S, ARANZANA M J. Peach genetic resources: diversity, population structure and linkage disequilibrium., 2013, 14: 84.

[49] MICHELETTI D, DETTORI M T, MICALI S, ARAMINI V, PACHECO I, LINGE C D S, FOSCHI S, BANCHI E, BARRENECHE T, QUILOT-TURION B, LAMBERT P, PASCAL T, IGLESIAS L, CARBó J, WANG L R, MA R J, LI X W, GAO Z S, NAZZICARI N, TROGGIO M, BASSI D, ROSSINI L, VERDE I, LAURENS F, ARúS P, ARANZANA M J. Whole-genome analysis of diversity and SNP-major gene association in peach germplasm., 2015, 10(9): e0136803.

（責任編輯 趙伶俐）

The Difference of Anthocyanin Accumulation Pattern and Related Gene Expression in Two Kinds of Red Flesh Peach

DING TiYu, CAO Ke, FANG WeiChao, ZHU GengRui, CHEN ChangWen, WANG XinWei, WANG LiRong

(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009)

【Objective】The objective of this experiment is to investigate the coloring mechanism of Chinese red-flesh peach germplasms and lay a theoretical foundation for excellent gene identifying and molecular marker assisted breeding in blood-flesh peach accessions.【Method】Eight red flesh peaches and one white flesh peach were selected as samples. The samples were collected one month after full bloom, and then collected every 10 days until the mature period. The anthocyanin of pulp of different germplasms was extracted with 2% formic acid methanol, determining the absorbance at 510 nm and 700 nm. The expression of 13 key structural genes and regulatory genes associated with anthocyanin synthesis was determined by real-time quantitative PCR (qRT-PCR).【Result】According to the accumulation of anthocyanin at middle-late stages of fruit, eight red-flesh peaches could be divided into two categories. The peak of anthocyanin biosynthesis appeared at mature stage, which was referred to as mature period accumulation type, including Zheng Yin 82-9, Da Hong Pao, Hei Bu Dai, Hong Tao and Tianjin Shui Mi; The peak of anthocyanin synthesis occurred at the middle stage of fruit development, and the content of anthocyanin decreased at mature stage, which was referred to as the mid-developmental accumulation type, including Harrow Blood, Da Guo Hei Tao and Wu Hei Ji Rou Tao. In the structural genes associated with anthocyanin, the expression ofandwas consistent with the trend of the variation of the anthocyanin content of mature period accumulation type germplasms, which were the key speed-limiting genes of these kinds of germplasms. In the mid-developmental accumulation type, the accumulation of anthocyanin in the mesocarp was consistent with the trend of expression of all structural genes.Among the four regulatory genes, only the expression level ofwas high and the expression pattern was similar to the pattern of anthocyanin accumulation in the two types of red flesh germplasms during fruit developmental stages. 【Conclusion】According to the coloring pattern of peach fruit and the pattern of anthocyanin accumulation, eight red-flesh peaches could be divided into two types, namely mature period accumulation type and mid-developmental accumulation type. Thegenes were the key structural genes ofmature period accumulation type accessions, whileplayed a key role in the synthesis of anthocyanin in all red-flesh peach germplasms.

red flesh peach; anthocyanin; anthocyanin synthesis related genes

2017-01-03；接受日期：2017-04-13

國家“863”計劃（2013AA102606）、中國農業科學院科技創新工程[CAAS-ASTIP-2015-ZFRI-（01）]

丁體玉，Tel：13083662138；E-mail：1121326300@qq.com。通信作者王力榮，Tel：0371-55906989；E-mail：wlirong2009@sina.com