腺病毒介導的色素上皮衍生因子對小鼠黑色素瘤肺轉移的抑制作用

陳巧玲,白亦光,付 曦,何 朗,馮 剛

(1川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院腫瘤科,南充 637000;2川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院骨科;3川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所;*通訊作者,E-mail:lssmd18@gmail.com)

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腺病毒介導的色素上皮衍生因子對小鼠黑色素瘤肺轉移的抑制作用

陳巧玲1,白亦光2,付 曦1,何 朗1,馮 剛3*

(1川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院腫瘤科,南充 637000;2川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院骨科;3川北醫學院第二臨床醫學院,南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所;*通訊作者,E-mail:lssmd18@gmail.com)

目的 探討腺病毒介導的色素上皮衍生因子(Ad-PEDF)對小鼠B16F10黑色素瘤肺轉移模型的治療作用。 方法 在體外用MTT實驗測定Ad-PEDF感染復數(multiplicity of infection,MOI)為50,100,150,200,250時對B16F10細胞增殖的抑制作用,Transwell實驗檢測Ad-PEDF對B16F10細胞侵襲的抑制作用,以PBS和空載腺病毒(Ad-null)作為對照。在體內通過尾靜脈接種小鼠B16F10細胞建立肺轉移模型,將小鼠隨機分為3組,分別經尾靜脈注射100 μl PBS、100 μl Ad-null(1×108PFU)和100 μl Ad-PEDF(1×108PFU)。隔日注射1次,共5次。觀察靜脈注射Ad-PEDF對黑色素瘤肺轉移結節數量以及肺濕重的影響。對肺轉移灶進行TUNEL染色檢測腫瘤細胞的凋亡情況。 結果 MTT實驗顯示,Ad-PEDF在不同的MOI值下均能對B16F10細胞產生作用,并隨著MOI值的增加抑制率逐漸升高,與Ad-null組相比,差異有統計學意義(P<0.01)。Transwell實驗顯示,Ad-PEDF組與PBS組和Ad-null組相比,穿膜的腫瘤細胞數明顯下降,侵襲能力受到顯著抑制(123.3±21.9vs220.3±26.8,213.5±35.5,P<0.01)。體內實驗結果提示,Ad-PEDF組小鼠的肺部轉移灶較PBS組和Ad-null組明顯減少(47.7±14.1vs75.1±20.9,73.3±17.3,P<0.05)。而Ad-PEDF組的小鼠肺濕重[(0.26±0.06)g]也明顯低于PBS組[(0.39±0.05)g]和Ad-null組[(0.37±0.07)g],差異有統計學意義(均P<0.05)。TUNEL實驗顯示,Ad-PEDF組肺轉移灶腫瘤細胞凋亡率較PBS組和Ad-null組增多(25.3%±3.3%vs3.9%±1.2%,4.1%±1.4%,P<0.01)。 結論 腺病毒介導的PEDF能夠顯著抑制小鼠黑色素瘤肺轉移灶的形成,其作用機制可能為抑制腫瘤細胞增殖和侵襲,以及誘導腫瘤細胞凋亡。

色素上皮衍生因子; 腺病毒載體; 黑色素瘤; 肺轉移

皮膚黑色素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤,侵襲性強,極易復發和轉移,而一旦出現轉移則臨床預后極差,因此抑制其侵襲和轉移是臨床治療的重點[1]。色素上皮衍生因子(PEDF)是一種50 kDa的分泌型糖蛋白,在胎兒及成人組織內廣泛表達,被認為是最有潛力的內源性血管生成抑制因子[2]。近來研究發現PEDF還具有直接的抗腫瘤作用:如抑制腫瘤細胞增殖和轉移、促進腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞分化等[2]。研究顯示,PEDF在多種腫瘤中呈低表達,而低表達或不表達PEDF的腫瘤具有更強的增殖能力和侵襲轉移能力[3]。本實驗利用復制缺陷型腺病毒作為PEDF基因載體,通過體內外研究觀察重組PEDF腺病毒對小鼠B16F10細胞增殖和遷移的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、腺病毒和實驗動物

小鼠黑色素瘤細胞株B16F10購自ATCC,由南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所保存;細胞培養使用DMEM培養基加入10%胎牛血清,2 mmol/L鏈霉素和100 μg/ml阿米卡星。攜帶PEDF基因的重組腺病毒(Ad-PEDF)由四川大學生物治療國家重點實驗室提供,腺病毒的擴增與純化方法如前所述[4];6-8周齡雌性C57BL/6小鼠,清潔級,購自四川大學華西實驗動物中心,生產許可證號:SCXK(川)2005-09。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM培養基(Gibco,USA),10%胎牛血清(FBS,Gibco,USA),MTT溶液(Sigma,USA),DMSO溶液(Sigma,USA),Transwell小室(Millipore,USA),基質膠(BD Biosciences,USA);原位凋亡檢測(TUNEL)試劑盒(Promega,USA);熒光顯微鏡(Olympus BX51,Japan)。

1.3 細胞培養

小鼠黑色素瘤B16細胞用含有10%FBS的DMEM培養基于37 ℃、5% CO2培養,用0.25%胰蛋白酶消化并傳代,每3 d傳代1次。

1.4 MTT法檢測Ad-PEDF對B16F10細胞增殖能力的影響

將對數生長期的B16F10細胞懸液按2×103個/孔接種于96孔板,每孔體積100 μl。置于37 ℃,5% CO2培養過夜。待細胞貼壁后分別加入PBS(陰性對照)以及感染復數(multiplicity of infection,MOI)分別為50,100,150,200,250的Ad-null(空載腺病毒)和Ad-PEDF,體積均為50 μl,每組設置4個復孔,繼續培養48 h。每孔加入濃度為的MTT溶液(5 mg/ml)10 μl,并繼續培養4 h。棄去上清液,加入150 μl DMSO,振蕩10 min,490 nm波長測定各孔光吸收值(OD),以不含細胞的等體積培養基作為空白對照。得到數值后按如下公式進行計算:細胞生長抑制率(%)=[1-(OD試驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%。

1.5 Transwell實驗檢測Ad-PEDF對B16F10細胞侵襲能力的影響

在Transwell小室上層底部用50 μl的基質膠覆蓋。將B16F10細胞以1×105個/孔置于Transwell遷移小室上層小室中,上室加入無血清培養基100 μl,下室加入含有10%胎牛血清的培養基600μl。分別在上室培養基中加入NS、Ad-null(MOI 200)、Ad-PEDF(MOI 200)各50 μl,每組設置2個復孔。37 ℃、5% CO2繼續培養24 h后,用棉棒擦去上室細胞,PBS清洗后用結晶紫染色,倒置顯微鏡下計數100倍下5個視野,統計細胞遷移率。

1.6 B16黑色素瘤肺轉移模型的建立

收集對數生長期、生長狀態良好的B16F10細胞,胰酶消化,離心計數,用無菌生理鹽水調整細胞濃度至5×106個/ml。將B16F10細胞沿尾靜脈注射于C57BL/6小鼠體內,5×105個/只,共30只,并隨機分為3組。于接種后第2日開始分別經尾靜脈注射100 μl PBS、100 μl Ad-null(1×108PFU)和100 μl Ad-PEDF(1×108PFU)。隔日注射1次,共5次,并定期觀察小鼠狀態和體重。于接種后第20 d,斷頸處死實驗小鼠,解剖取下肺,統計肺部轉移結節數,并稱肺組織濕重。

1.7 統計學分析

實驗數據用均數±標準差來表示,采用SPSS 17.0統計軟件來進行數據分析。多組之間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較用t檢驗進行處理。P<0.05判定差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Ad-PEDF對B16F10細胞增殖能力的影響

通過MTT法檢測Ad-PEDF對B16F10黑色素瘤細胞的增殖抑制情況,以PBS組作為陰性對照組。結果顯示,Ad-PEDF在MOI值為200時對B16F10細胞的抑制率為55.2%±0.9%,并隨著腺病毒濃度的增加抑制率逐漸升高,說明抑制率與濃度呈劑量依賴效應。Ad-null則對B16F10細胞無明顯抑制作用。Ad-PEDF組與Ad-null組相比,抑制率差異有統計學意義(圖1,P<0.01)。以上實驗結果表明,Ad-PEDF可抑制B16F10細胞增殖。

圖1 Ad-PEDF體外抑制B16F10細胞增殖Figure 1 Ad-PEDF inhibits the B16F10 cells proliferation in vitro

2.2 Ad-PEDF對B16F10細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗顯示,B16F10細胞經Ad-PEDF處理24 h后,穿膜的腫瘤細胞數明顯下降(123.3±21.9),與PBS組(220.3±26.8)和Ad-null組(213.5±35.5)相比,差異有統計學意義(P<0.01,見圖2)。而Ad-null組與PBS組差異無統計學意義。說明Ad-PEDF對小鼠黑色素瘤細胞遷移具有抑制作用。

與PBS組和Ad-null組比較，*P<0.01圖2 Ad-PEDF體外抑制B16F10細胞遷移(×100)Figure 2 Ad-PEDF inhibit the B16F10 cells migration in vitro(×100)

2.3 Ad-PEDF體內抑制黑色素瘤肺轉移

用Ad-PEDF通過尾靜脈給藥的方式治療B16F10黑色素瘤肺轉移模型,于接種第20天處死小鼠并觀察小鼠肺部腫瘤轉移情況。PBS組和Ad-null組肺部轉移灶平均值分別為(75.1±20.9)個和(73.3±17.3)個,而Ad-PEDF組的肺部轉移灶明顯減少,僅為(47.7±14.1)個,與前兩組相比,差異有統計學意義(P<0.05,見圖3)。Ad-PEDF組的小鼠肺濕重明顯低于PBS組和Ad-null組[(0.26±0.06)g,(0.39±0.05)gvs(0.37±0.07)g,差異有統計學意義(P<0.05,見圖4)。

與PBS組和Ad-null組比較,*P<0.05圖3 各組小鼠肺表面轉移結節數Figure 3 The numbers of metastatic foci on lung surface in mice

與PBS組和Ad-null組比較,*P<0.05圖4 各組小鼠肺組織濕重Figure 4 The wet weight of lungs in mice after different treatment

2.4 肺部腫瘤組織原位凋亡檢測

對肺部的腫瘤組織石蠟切片進行TUNEL染色及凋亡細胞計數。熒光顯微鏡下可觀察到,凋亡細胞的染色質呈致密濃染的塊狀或顆粒狀綠色熒光,呈散在分布。凋亡細胞計數結果顯示,Ad-PEDF組的腫瘤細胞凋亡率明顯高于PBS組及Ad-null組(P<0.01,見圖5)。

與PBS組和Ad-null組比較,*P<0.01圖5 TUNEL染色檢測腫瘤組織中腫瘤細胞凋亡率(×200)Figure 5 Apoptosis of tumor cells by TUNEL staining(×200)

3 討論

侵襲與轉移是惡性腫瘤最顯著的生物學特征,是導致腫瘤患者死亡的主要原因,抑制腫瘤的侵襲和轉移是惡性腫瘤治療成敗的關鍵因素[5]。PEDF作為一種多功能蛋白,不僅具有抗血管生成的作用,更可通過抑制腫瘤侵襲和轉移、促進腫瘤細胞凋亡等直接途徑發揮抗腫瘤作用[2,3]。PEDF在多種腫瘤中表現出抑制轉移的效應,包括黑色素瘤、骨肉瘤、前列腺癌、神經膠質瘤等[6]。有研究發現,PEDF能下調基質金屬蛋白酶MMP-9以及與膠原Ⅰ和Ⅲ結合,從而降低腫瘤細胞的侵襲性[7]。本研究通過MTT和Transwell實驗也觀察到重組PEDF腺病毒可在體外抑制B16F10黑色素瘤細胞的增殖和遷移。黑色素瘤易發生肺轉移,通過尾靜脈注射黑色素瘤細胞的方式建立肺轉移模型,能直觀反映腫瘤細胞在血管內轉移情況,可以較好地評價藥物的抗腫瘤轉移作用。本實驗結果顯示,Ad-PEDF在體內可顯著抑制小鼠肺表面的轉移灶數量,治療組小鼠的肺濕重也明顯低于PBS組及Ad-null組。Palmieri等[8]在體外實驗中發現PEDF能夠通過誘導子宮內膜癌細胞凋亡而抑制其生長,且抑制作用呈時間、劑量依賴性。很多研究也證實PEDF能對結腸癌、骨肉瘤、黑色素瘤細胞有著直接的凋亡效應[9-11]。在本研究中,TUNEL實驗顯示,Ad-PEDF組肺部腫瘤凋亡率較PBS組和Ad-null組明顯增多,提示Ad-PEDF可同時通過促進腫瘤細胞凋亡從而抑制轉移灶腫瘤生長。

基因轉運技術是腫瘤基因治療的重要環節之一,尋找合適的基因轉運載體一直是研究的重點。其中腺病毒載體因感染及表達效率高、制備方法相對簡單、可獲得高滴度純化載體且不整合入宿主細胞染色體等諸多優點,成為基因治療中應用最為廣泛的載體系統[12]。雖然重組PEDF腺病毒在本研究中表現出明顯的抗腫瘤效應,但如應用于臨床仍面臨著很多問題:腺病毒缺乏靶向性,可能會在腫瘤外的器官和組織中也高表達目的基因;腺病毒載體具有抗原性,會引起機體產生針對性抗體[13]。故需進一步觀察其遠期副作用,以及尋找更具靶向性和安全性的聯合治療方案,如聯合細胞載體、陽離子脂質體或其他靶向載體等。

本研究證實,腺病毒介導的PEDF可通過抑制黑色素瘤細胞增殖、侵襲,并誘導腫瘤細胞凋亡,從而抑制黑色素瘤肺轉移,為腫瘤基因治療研究提供了實驗基礎。

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Inhibitive effect of recombinant adenoviruses loaded with pigment epithelium-derived factor gene on pulmonary metastases of melanoma in mice

CHEN Qiaoling1,BAI Yiguang2,FU Xi1,HE Lang1,FENG Gang3*

(1DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China;2DepartmentofOrthopedics,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;3ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCell,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:lssmd18@gmail.com)

ObjectiveTo explore the inhibitive effect of recombinant adenoviruses loaded with pigment epithelium-derived factor gene on pulmonary metastases of melanoma B16F10 in mice.MethodsMTT and Transwell assays were performed to observe the inhibitive effect of Ad-PEDF on B16F10 cells proliferation and invasion ability of B16F10 cells with PBS and adenovirus vector(Ad-null) as the controls.The C57BL/6 mice pulmonary metastases models of melanoma were established by the injection of B16F10 cells via tail vein.Then 30 tumor-bearing mice were randomly divided into 3 groups:PBS group,Ad-null group and Ad-PEDF group.The mice were intravenously administrated with PBS(100 μl),adenoviruses vector(1×108PFU,100 μl) or Ad-PEDF(1×108PFU,100 μl) every other day for five times,respectively.The influence of Ad-PEDF on the pulmonary metastases nodule numbers was observed,and the wet weight of the lungs in mice was calculated.The apoptosis of the tumor cells in metastasis nodules was detected by TUNEL assay.ResultsMTT assay showed that B16F10 cells proliferation decreased in a dose-dependent manner after treatment with different multiplicity of infection(MOI)of Ad-PEDF(P<0.01).Transwell assay demonstrated that the number of B16F10 cells migrating to the other side of the membrane in Ad-PEDF group was markedly decreased compared with PBS group or Ad-null group(123.3±21.9vs220.3±26.8,213.5±35.5,P<0.01).Theinvivoresults showed that the number of pulmonary metastases nodules in Ad-PEDF group was less than in PBS group and Ad-null group(47.7±14.1vs75.1±20.9,73.3±17.3,P<0.05).And the wet weight of the lungs was reduced in Ad-PEDF group compared with PBS group and Ad-null group[(0.26±0.06)gvs(0.39±0.05)g,(0.37±0.07)g,P<0.05].The TUNEL assay showed that Ad-PEDF increased the apoptosis rate of tumor cells in lung metastasis foci compared with PBS and Ad-null(25.3%±3.3%vs3.9%±1.2%,4.1%±1.4%,P<0.01).ConclusionAd-PEDF can inhibit the pulmonary metastasis of melanomainvitroandinvivo.

pigment epithelium-derived factor; adenoviruses; melanoma; pulmonary metastases

國家自然科學基金資助項目(30872614)；四川省教育廳理科重點項目(15ZA0216，15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項目(14A0017，14A0022)；川北醫學院科研發展計劃資助項目(CBY14-A-ZD02，CBY15-A-ZD02)；四川省衛計委科研基金資助項目(16PJ202)

陳巧玲,女,1983-02生,博士,主治醫師,E-mail:cql166@163.com

2017-02-21

R739.5

A

1007-6611(2017)06-0534-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.005