超高效液相色譜法測定五子衍宗丸中五味子甲素的含量

孫 琳,梁 銳,嚴維花,張 娜,柴 智

(山西中醫學院中藥學院,晉中 030619;*通訊作者,E-mail:chaizhi008@126.com)

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超高效液相色譜法測定五子衍宗丸中五味子甲素的含量

孫 琳,梁 銳,嚴維花,張 娜,柴 智*

(山西中醫學院中藥學院,晉中 030619;*通訊作者,E-mail:chaizhi008@126.com)

目的 建立五子衍宗丸中五味子甲素含量測定的超高效液相色譜法(UPLC),并比較不同溶劑對五味子甲素的提取效果。 方法 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相ACN ∶0.2%HAc=49 ∶51;流速0.4 ml/min,柱溫30 ℃,進樣體積1 μl,檢測波長250 nm。 結果 五味子甲素在0.001 3-0.05 μg范圍內具有良好的線性關系(r=0.999 9);平均回收率為101.73%,RSD 為2.29%;70 ℃蒸餾水、常溫蒸餾水、70%乙醇、無水乙醇和DMSO 5種溶劑提取五味子甲素得率分別為,0.013%,0.012%,0.008%,0%和0%。 結論 UPLC簡便、準確、重現性好,可用于五子衍宗丸中五味子甲素的含量測定。

五味子甲素; 五子衍宗丸; 超高效液相色譜法

五子衍宗丸是由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子和車前子經炮制加工制成的水蜜丸,是中醫臨床常用的補腎益精類經典方藥[1]?，F代醫學研究結果顯示,五子衍宗丸不僅對男性生殖系統疾病有較好的療效,且對阿爾茨海默病[2]和Leber遺傳性視神經病變[3]也有一定的治療作用,同時還具有增強免疫力[4]、抗衰老[5]和降血糖血脂[6,7]等作用。五子衍宗丸中的化學成分以金絲桃苷、五味子甲素、五味子醇甲、山柰素等為主[8],2010版《中國藥典》一部收載的五子衍宗丸質量標準中僅有枸杞子和五味子甲素的TLC鑒別方法,未見含量測定方法。目前文獻報道的五子衍宗丸含量測定多以HPLC為主,本文以五味子甲素為指標成分,建立了五子衍宗丸中五味子甲素的UPLC測定方法,為五子衍宗丸的質量控制提供了評價方法。

1 材料

1.1 實驗儀器

Waters UPLC;千分之一電子分析天平(上海精科天美科學儀器有限公司);TD6M離心機(湖南湘式科學儀器有限公司);HH-2水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司);KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥材

五味子甲素標準品(中國食品藥品檢定研究院);五子衍宗丸(規格:10 g/100粒,北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠);無水乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司);DMSO(Sigma);乙腈(Merke);冰乙酸(天津市光復科技發展有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相為ACN ∶0.2%HAc=49 ∶51;流速0.4 ml/min,柱溫30 ℃,進樣體積1 μl,檢測波長250 nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取五味子甲素對照品0.50 mg,置于10 ml容量瓶中,加入乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,得50 μg/ml的五味子甲素對照品溶液,作為母液備用。將母液分別稀釋至25，12.5，5，2.5，1.25 μg/ml。經0.22 μm微孔濾膜過濾后,作為對照品溶液備用。

2.3 供試品溶液的制備

稱取五子衍宗丸粉末約0.4 g放入15 ml EP管中,加入10 ml提取溶劑,稱重,超聲提取20 min,取出,冷卻至室溫,補足減失的重量。將補重后的EP管置離心機以6 000 r/min離心20 min,取上清液,經0.22 μm微孔濾膜過濾后,作為供試品溶液備用。

2.4 線性關系考察

精密吸取對照品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行測定,記錄色譜圖。以樣品濃度(μg/ml)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),制備標準曲線。計算五味子甲素的回歸方程為Y五味子甲素=0.000 2X+0.008 7(r=0.999 9),線性范圍0.001 3-0.05 μg。

圖1 五味子甲素標準品UPLC圖譜Figure 1 Chromatograms of deoxyschizandrin

2.5 精密度試驗

精密吸取高、中、低3個濃度的對照品溶液,連續進樣測定6次,以色譜峰的峰面積計算得五味子甲素的RSD均小于1%(見表1),表明儀器精密度良好。

表1 五味子甲素精密度試驗結果

Table 1 Results of precision test

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一對照品溶液,分別于0,1,2,4,8,16,24 h 進行測定,記錄峰面積,計算表明供試品在24 h內穩定(見表2)。

表2 五味子甲素穩定性試驗結果

Table 2 Results of stability test

時間峰面積50μg/ml125μg/ml125μg/ml0h2969327534472511h2985517562971132h2973907663970994h2954377623771858h29504475670723316h29487075251720024h295950754297207RSD(%)046067080

2.7 重復性試驗

取五子衍宗丸粉末6份,每份約0.4 g,精密稱定,以70%乙醇為溶劑,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行測定,得五味子甲素RSD均小于2%(見表3),表明方法重復性良好。

表3 五味子甲素重復性試驗結果

Table 3 Results of repeatability test

批次峰面積70%乙醇無水乙醇70℃蒸餾水常溫蒸餾水DMSO12625924690--1641622554224379--1653932572324695--1687842541424569--1681752579825204--1671362603124295--16504RSD(%)125124--116

2.8 回收率試驗

取五子衍宗丸粉末9份,每份約0.4 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入五味子甲素對照品溶液適量(3種水平,各3份),按“2.3”項下方法操作、測定,計算得五味子甲素的平均回收率為101.731 %(見圖4)。

表4 五味子甲加樣回收率試驗結果

Table 4 Results of sample recovery test

稱樣量(g)原有量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)04040053004000399844610173122910402005100400040100856040400520040004110165904010051005000521033930403005200500052103727040200520050005310607204040053006000601004140402005500600060996240404005200600061101390

2.9 樣品測定

平行稱取五子衍宗丸粉末5份,每份約0.4 g,精密稱定,分別加入70%乙醇、無水乙醇、DMSO、熱蒸餾水(約70 ℃)、蒸餾水(室溫)各10 ml,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行測定,結果顯示,70%乙醇對五子衍宗丸中五味子甲素的提取效率最高(見圖2,表5)。

表5 不同溶劑提取五味子甲素得率

Table 5 Extraction of deoxyschizandrin by different solvents

樣品峰面積熱水水70%乙醇無水乙醇DMSO1--2625924690164162--2554224379165393--2572324695168784--2541424569168175--257982520416713得率(%)00001300120008

圖2 樣品溶液UPLC圖譜Figure 2 Chromatograms of sample

3 討論

3.1 檢測波長的確定

取五味子甲素對照品溶液,在200-400 nm處掃描,結果表明,五味子甲素在250 nm處有最大吸收峰,在此波長下測得的色譜峰峰形對稱且無干擾峰,所以本實驗選定250 nm為五味子甲素的檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本實驗比較了乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.2%冰醋酸和乙腈-1%冰醋酸4種流動相的洗脫效果,結果選擇乙腈-0.2%冰醋酸進行洗脫,干擾峰較少且五味子甲素分離度良好。此外,隨著流動相中乙腈比例的增加,各物質的保留時間明顯縮短,但分離效果變差。以乙腈 ∶0.2%冰醋酸=41 ∶59進行洗脫,五味子甲素保留時間適中,分離度良好。

3.3 提取溶劑的選擇

本實驗考察了70%乙醇、無水乙醇、DMSO、熱蒸餾水(約70 ℃)和蒸餾水(室溫,約25 ℃)5種提取溶劑,UPLC含量測定結果顯示,熱蒸餾水和室溫蒸餾水提取液中檢測不到五味子甲素,可能是由于五味子甲素的極性較小,不溶于水,因此水提液中五味子甲素含量較低,未能被儀器檢測到;5種提取溶劑中,以70%乙醇對五味子甲素的提取效率最高。

3.4 結果分析

本研究建立了五子衍宗丸中五味子甲素的UPLC含量測定方法,并比較了不同溶劑對五味子甲素的提取效果。實驗結果表明,本方法線性關系及重現性良好,為五味子甲素提供了快速、準確、簡便的測定方法,可用于五子衍宗丸的質量控制;采用70%乙醇超聲提取五子衍宗丸所得五味子甲素的得率最高,以此提取液回收乙醇蒸干后所得浸膏能夠被細胞培養基完全溶解,為五子衍宗丸細胞干預液的制備提供了實驗基礎。

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Determination of deoxyschizandrin in the Wuzi Yanzong pill by ultra performance liquid chromatography

SUN Lin,LIANG Rui,YAN Weihua,ZHANG Na,CHAI Zhi*

(CollegeofTraditionalChineseMedicine,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinzhong030619,China;*Correspondingauthor,E-mail:chaizhi008@126.com)

ObjectiveTo establish the method for determining the content of deoxyschizandrin in Wuzi Yanzong pills by ultra performance liquid chromatography(UPLC) and compare the efficacy of extraction of deoxyschizandrin with different solvents.MethodsThe analysis was carried out on Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) with ethanol-0.2% glacial acetic acid (49∶51) as mobile phase,flow rate of 0.4 ml/min and wave length of 250 nm at 30 ℃.The 70% ethanol,100% ethanol,DMSO,70 ℃ distilled water and distilled water at room temperature were used as the solvents to extract the deoxyschizandrin.ResultsThe deoxyschizandrin showed a good linear relationship between concentration and peak area in the range of 0.001 3-0.05 μg (r=0.999 9).The recovery was 101.73% with RSD of 2.29%.The extraction rates of 70% ethanol,100% ethanol,DMSO,70 ℃ distilled water and distilled water at room temperature were 0.013%,0.012%,0.008%,0%and 0%.ConclusionThe method has good reproducibility and sensitivity to determine the content of deoxyschizandrin in Wuzi Yanzong pills.The 70% ethanol is the best extraction solvent.

deoxyschizandrin; Wuzi Yanzong pills; ultra performance liquid chromatography

國家自然科學基金資助項目(81303262,81102552);山西省中醫藥管理局科研基金資助項目(2016ZYYC28);山西中醫學院博士科研啟動基金資助項目;山西省國際科技合作項目(2014081049-4);山西中醫學院方藥藥效及其作用機制研究重點科技創新團隊(20150401)

孫琳,女,1984-01生,博士,講師,E-mail:sunlin115@aliyun.com

2017-03-16

R927.2

A

1007-6611(2017)06-0543-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.007