黃刺玫果實醇提物抗血栓作用及其機制研究

任 婧,王進東,*,柴秋彥,楊官娥,衛 罡

(1山西醫科大學藥學院中藥學教研室,太原 030001;2山西省醫藥與生命科學研究院;*通訊作者,E-mail:844381238@qq.com)

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黃刺玫果實醇提物抗血栓作用及其機制研究

任 婧1,王進東1,2*,柴秋彥2,楊官娥1,衛 罡2

(1山西醫科大學藥學院中藥學教研室,太原 030001;2山西省醫藥與生命科學研究院;*通訊作者,E-mail:844381238@qq.com)

目的 研究黃刺玫果實醇提物的抗血栓作用并探究其作用機制。 方法 ①將不同濃度的黃刺玫果實醇提物分別加入大鼠富血小板血漿中,用多功能血小板聚集儀測定ADP誘導血小板的最大聚集率。②將小鼠隨機分為高、中、低三個劑量組,連續給藥5 d,注射角叉菜膠誘導小鼠尾靜脈血栓,分別在24 h和48 h后測量黑尾長度。③體外測定不同濃度黃刺玫果醇提物組血漿凝血酶時間(PT)、凝血酶時間(TT)、部分凝血酶原時間(APTT)。④在0,4,8,24 h時,分別稱量黃刺玫果實醇提物高、中、低劑量(60,30,15 mg/ml)組,空白對照組和尿激酶陽性對照組的家兔全血凝塊質量,計算全血凝塊溶解率。 結果 ①與空白對照組比較,高、中、低劑量黃刺玫果醇提物組血小板最大聚集均明顯減少(P<0.01)。②與空白組比較,黃刺玫提取物高、中劑量組小鼠相對黑尾長度及相對黑尾長度抑制率明顯減少(P<0.05)。③與空白組比較,黃刺玫果醇提物組正常人血漿APTT,PT,TT時間均顯著延長(P<0.01)。④與空白組比較,在4,8，24 h時,黃刺玫果醇提取物高、中劑量組的全血凝塊溶解率均顯著增加(P<0.01)。 結論 黃刺玫果實醇提物具有抗凝和抑制實驗性血栓形成的作用。

黃刺玫果; 抗血栓; 血小板聚集; 凝血

黃刺玫果是薔薇科薔薇屬落葉灌木黃刺玫(RosaxanthinaLindl.)的干燥成熟果實,黃刺玫果廣泛分布于我國北方各省的山區和丘陵地帶[1],據記載黃刺玫果具有理氣活血、調經健脾的作用。黃刺玫果中含有大量維生素及黃酮類物質[2],具有抗衰老、抗氧化、抗疲勞等作用。據報道同種屬植物山刺玫具有良好的的抗血栓作用[3],但關于黃刺玫果實并未深入研究。本文旨在從抗血小板聚集、抗凝血和抑制小鼠體內血栓形成等多方面來探討其抗血栓作用,為黃刺玫果在心血管疾病中的合理利用提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司),92SM-202A-DR電子分析天平(瑞士Precisa),Sysmex CA-50 血凝儀,LG-PABER血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學儀器公司),PB-10型數顯PH計(德國Sartorius),Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(美國貝克庫曼爾特有限公司)。

1.1.2 試藥 黃刺玫果(采自山西省左權縣,經由王進東教授鑒定確認為黃刺玫果實)。尿激酶(南京南大藥業責任有限公司,產品批號:20160107),膠原蛋白(Sigma,生產批號:091M7675),鹽酸腎上腺素(天津金耀藥業有限公司,生產批號:20151106),阿司匹林腸溶片(山西醫科大學藥廠,生產批號:20151013),角叉菜膠(Sigma,生產批號:021M0038V),曲克蘆丁(山西亞寶藥業,生產批號:20160423),正常人血血漿(從臨床采集分離后的凍存血漿),部分凝血活酶時間測定試劑盒(上海太陽生物技術公司,生產批號:A107),凝血酶原時間測定試劑盒(北京世帝科學儀器有限公司,生產批號:STY2010-941),凝血酶時間測定試劑盒(北京世帝科學儀器有限公司,生產批號:STY20301-53),枸櫞酸鈉(市售AR級),二磷酸腺苷(ADP,美國Sigma公司)。

1.1.3 動物 大耳白家兔,普通級,雄性(2-2.5 kg);ICR小鼠,清潔級,雄性(22±2)g;SD大鼠,雄性(250±5)g,清潔級,購自中國食品藥品檢定研究院,許可證號為SCXK(京)2014-0013。

1.2 方法

1.2.1 黃刺玫果實醇提取物的制備 將黃刺玫干果粉碎后,與70% 的乙醇以1 ∶10混合,回流提取3次,每次1.5 h,提取液減壓濃縮至干燥[4],所得干燥品即為實驗所需樣品。

1.2.2 黃刺玫果實醇提取物對ADP誘導大鼠血小板聚集的影響 樣品溶液的配制:以蒸餾水為溶劑,將黃刺玫果實醇提物溶解,配制濃度為500 mg/ml的樣品溶液,并依次稀釋為250,125,62.5,31.75 mg/ml。

根據文獻[5,6]實驗方法改進。SD大鼠腹主動脈取血,3.2%枸櫞酸鈉與大鼠全血以1 ∶9抗凝,混合后所得全血以1 000 r/min,離心8 min后得富血小板血漿(PRP),將剩余的部分以3 000 r/min,離心10 min得貧血小板血漿(PPP)。設置空白對照組和樣品組,樣品組分別設置濃度為250,125,62.5,31.75 mg/ml的4個不同劑量組。以295 μl 貧血小板血漿加5 μl蒸餾水調零,樣品組中加入295 μl富血小板血漿及5 μl各劑量組樣品,空白對照組加入295 μl PRP和5 μl生理鹽水,37 ℃溫育60 s,加入15 μl誘導劑ADP溶液(0.5 mg/ml),每組6個平行樣本,用多功能血小板聚集儀測定10 min內血小板的最大聚集率,并按照下列公式計算抑制率:血小板聚集抑制率(%)=(空白組血小板聚集率-樣品組血小板聚集率)/空白組血小板聚集率×100%。

1.2.3 黃刺玫果實醇提物對角叉菜膠誘導小鼠尾靜脈血栓模型的保護作用 樣品溶液的配制:以蒸餾水為溶劑,將黃刺玫果實醇提取物溶解,配制濃度為15 mg/ml樣品溶液,倍數稀釋得到7.5,3.25 mg/ml溶液。

根據參考文獻[7,8]方法改進。50只ICR小鼠，體質量(23±1)g,雄性,隨機分為5組,每組10只,分別是空白對照組,黃刺玫果提取物高、中、低三個劑量組和曲克蘆丁陽性對照組,按千克體質量給藥,高、中、低劑量組給藥量分別為2,1,0.5 g/kg,曲克蘆丁注射液為100 mg/kg,空白對照組給予等體積生理鹽水。按小鼠體質量0.2 ml/10 g腹腔注射樣品組、陽性對照組和空白對照組,連續給藥5 d,末次給藥2 h后,按小鼠體質量0.1 ml/10 g,背部皮下注射1%角叉菜膠溶液。將小鼠置于室溫20 ℃下48 h,于24,48 h時觀察小鼠的黑尾情況,測量小鼠黑尾長度。結果以小鼠相對黑尾長度(relative black tail length,RATL)表示,按照下列公式計算相對黑尾長度及相對黑尾長度抑制率(%):RATL=每只小鼠黑尾長度/該小鼠的尾巴長度;RATL抑制率(%)=[1-(樣品組RATL/空白組RATL)]×100%。

1.2.4 黃刺玫果實醇提物對正常人血漿APTT,PT,TT時間的影響 樣品溶液的配制:以生理鹽水為溶劑,將黃刺玫果實醇提物溶解,配制初始濃度為270 mg/ml的樣品溶液。

PT時間測定:將樣品溶液分別稀釋為2.7,5.4,7.8,10.4 mg/ml,在血凝杯中加入46 μl血漿和4 μl不同濃度樣品溶液。預熱3 min后加入100 μl PT試劑,空白對照給予等量生理鹽水,經血凝儀測定凝固時間,每組重復4次。

TT時間測定:將樣品溶液分別稀釋為9,12,15,18 mg/ml,在血凝杯中加入90 μl血漿和10 μl不同濃度樣品溶液?？瞻讓φ战o予等量生理鹽水,預熱3 min后加入50 μl TT試劑,經血凝儀測定凝固時間,每組重復4次。

APTT時間測定:將樣品溶液分別稀釋為2.2,4.5,9,18 mg/ml,在血凝杯中加入44 μl血漿和6 μl不同濃度樣品溶液?？瞻讓φ战o予等量生理鹽水,預熱1 min后加入5 μl APTT試劑,溫育3 min后加入50 μl CaCl2,經血凝儀測定APTT時間,每組重復4次。

1.2.5 黃刺玫果實醇取物對家兔全血凝塊溶解率的影響 樣品溶液的配制:以生理鹽水為溶劑,將黃刺玫果實醇提物溶解,配制濃度為60,30,15 mg/ml的樣品溶液。

根據參考文獻[9]方法進行改進。家兔心臟采血,置于直徑約0.4 cm 的細長玻璃管中,37 ℃水浴鍋中放置3 h,自然凝固后取出并將其分為長約1 cm的血凝塊,生理鹽水淋洗3次待用。黃刺玫果提取物設置高、中、低3個劑量組(60,30,15 mg/ml),以生理鹽水為空白對照,尿激酶為陽性對照(1 000 U/ml)。將生理鹽水、尿激酶及不同劑量組樣品各2 ml加入玻璃試管中,每組5個平行樣本,向每個試管中分別加入1個血塊,37 ℃水浴溫育24 h,觀察血塊溶解情況,并分別于0,4,8,24 h測定血凝塊質量,按下列公式計算全血凝塊溶解率:全血凝塊溶解率(%)=(血凝塊初始質量-樣品作用后各時間點血凝塊質量)/血凝塊初始質量。

2 結果

2.1 黃刺玫果實醇提物對ADP誘導大鼠血小板聚集的影響

與空白組比較,500,250,125,62.5,31.75 mg/ml濃度的黃刺玫果實醇提物可以明顯抑制血小板聚集,差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

組別最大聚集率(%)抑制率(%)空白組3991±53-500mg/ml927±165??7638250mg/ml1632±189??5910125mg/ml2215±284??4450625mg/ml2973±446??25513175mg/ml3506±596?1215

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.2 黃刺玫果實醇提物對角叉菜膠誘導小鼠尾靜脈血栓模型的保護作用

與空白組比較,在24 h時,高劑量組未出現小鼠黑尾情況,中劑量組小鼠相對黑尾長度明顯減少。48 h時,高劑量組相對黑尾長度明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05,見表2)，表明高中劑量組黃刺玫果實提取物可以明顯抑制角叉菜膠誘導小鼠體內血栓的形成。

組別血栓發生率(%)RATLRATL抑制率(%)24h48h24h48h24h48h空白組901001766±9052953±1225-阿司匹林組601001059±4472194±122540032570高劑量組070 0??1558±177?100．004724中劑量組20100624±684?2042±153564673084低劑量組601001192±8652564±117632502069

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.3 黃刺玫果實醇提物對正常人血漿APTT,PT,TT的影響

與空白組比較,黃刺玫果實醇提物4個劑量組正常人血漿APTT,PT均顯著延長。當黃刺玫果醇提物濃度為9,18 mg/ml,正常人血漿TT時間顯著延長(P<0.01,見表3-5)，表明黃刺玫果醇提物對內源性凝血系統及外源性凝血系統均有抑制作用。2.4 黃刺玫果實醇提物對家兔全血凝塊溶解的影響

隨著給藥時間的延長,各實驗組血栓溶解率增加,血栓表面逐漸變松散,不再緊致有彈性并松散成顆粒狀,與對照組相比,各劑量組隨著給藥時間的延長,全血凝塊的溶解率逐漸增加,高、中劑量組在不同時間點均表現了較強的全血凝塊溶解能力,差異有統計學意義(P<0.01,見表6)。

組別APTT(s)終濃度(mg/ml)空白組3665±0680270mg/ml4710±190?0216540mg/ml7608±231??0432780mg/ml8747±590??0864104mg/ml 13480±1190??1728

與空白組比較,*P<0.05，**P<0.01

組別PT(s)終濃度(mg/ml)空白組1333±00609mg/ml1570±025??0912mg/ml1953±035??1215mg/ml2630±081??1518mg/ml3463±063??18

與空白組比較,*P<0.05，**P<0.01

組別TT(s)終濃度(mg/ml)空白組1828±0280225mg/ml1825±025021645mg/ml2060±066?0549mg/ml2425±088??10818mg/ml3788±088??206

與空白組比較,*P<0.05，**P<0.01

組別4h8h24h空白組161±047263±099834±179高劑量組2393±375??3330±311??4038±317??中劑量組1266±127??1966±268??3054±224??低劑量組259±079630±0991930±3054??尿激酶組462±1621969±346??4096±461??

與空白組相比,*P<0.05，**P<0.01

3 討論

血栓形成是在生理或病理狀態下,凝血系統不同程度被激活,循環血液中的有形分子在血液中形成的栓子。形成血栓的危險因素有很多,防治血栓形成必須從保護血管內皮細胞、降低血小板功能、抑制血液凝固、促進纖溶活性等多個途徑來進行[10,11]。

角叉菜膠是從海藻中提取的硫酸多糖,一種常用的血栓誘導劑,角叉菜膠通過炎癥損傷血管內皮細胞,激活外源性凝血系統形成血栓,并在血栓形成后抑制纖溶系統[12]。實驗發現,黃刺玫果醇提物高劑量組可明顯抑制小鼠尾靜脈血栓形成。

血栓形成的重要原因之一是血小板聚集,二磷酸腺苷(ADP)是常用的血小板聚集劑之一,黃刺玫果提取物明顯地抑制血小板聚集、黏附。

APTT,PT,TT是各自獨立的基礎性凝血途徑篩查指標,APTT是內源性凝血途徑篩查指標,PT是外源性凝血途徑篩查指標,TT用于凝血酶測定,檢查血漿纖維蛋白原轉變為纖維蛋白能力。黃刺玫果實醇取物可以明顯延長APTT,TT,表明其可以抑制內源性凝血途徑;明顯延長PT,表明其可以抑制外源性凝血途徑?？赏茰y黃刺玫果實醇提物能夠抑制外源性和內源性凝血途徑,從而抑制凝血酶的表達,最終達到抗血栓目的,但對于黃刺玫果提取物是否可以直接抑制凝血酶作用仍待研究。

體外抗血栓實驗通過觀察黃刺玫果提取物對體外血塊的溶解能力,表明黃刺玫果提取物對已凝聚的血栓塊也有一定的作用,推測其可能與激活血凝塊中的纖溶酶有關。

通過以上實驗研究表明黃刺玫果實醇提物具有良好的抗血栓作用。在對其抗血栓機制作用的實驗研究中,黃刺玫果實醇提物體現了廣泛的抗血栓作用。黃刺玫果作為一種天然產物,良好的抗血栓作用對于開發抗血栓藥物有很大的前景及價值。但該實驗并未對其具體的抗血栓作用機制探討清楚,所以對于黃刺玫果抗血栓作用機制仍有待于繼續研究。

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Study on antithrombotic effects ofRosaxanthinaLindl.fruit and its mechanism

REN Jing1,WANG Jindong1,2*,CHAI Qiuyan2,YANG Guan’e1,WEI Gang2

(1DepartmentofChineseTraditionalMedicine,CollegeofPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2ShanxiInstituteofMedicineandLifeScience;*Correspondingauthor,E-mail:844381238@qq.com)

ObjectiveTo explore the antithrombotic effect ofRosaxanthinaLindl.fruit alcohol extract and its possible mechanism.Methods①The ADP-induced platelet aggregation was measured using multifunctional platelet aggregometer after the different concentrations of the alcohol extract of Rosa xanthina Lindl.fruit were added into rat platelet rich plasma,respectively.②The mice were randomly allocated into five groups: blank group,positive control group,low-dose group,medium-dose group and high-dose group.The tail-thrombus models were established by carrageenan after the mice were fed for 5 d.The length of dark tails was observed after the models were established for 24 h and 48 h.③The prothrombin time(PT),thrombin time(TT) and activated partial thermoplastic time(APTT) of human plasma were determined in different dose groups.④At 0,4,8,24 h,the blood clots were weighed in different dose groups,and the blood clot dissolution was calculated.Results①Compared with control group,the platelet maximum aggregation was significantly reduced in high-dose group,medium-dose group and low-dose group(P<0.01).②Compare with control group,the relative black tail length and relative black tail length inhibition rate were significantly reduced in high-dose group and medium-dose group(P<0.01).③Compared with control group,APTT,TT,PT were prolonged inRosaxanthinaLindl.fruit alcohol extract groups(P<0.01).④At 4,8,24 h,the blood clots dissolution were significantly increased by extract ofRosaxanthinaLindl.fruit in high-dose and medium-dose groups(P<0.01).ConclusionThe extract ofRosaxanthinaLindl.fruit may have good anticoagulation and antithrombotic effects.

RosaxanthinaLindl.fruit; anti-thrombosis; platelet aggregation; thrombin

山西省國際科技合作項目(2014081049-2)

任婧,女,1991-02生,在讀碩士,E-mail:renjing0209@163.com

2017-02-22

R965

A

1007-6611(2017)06-0539-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.006