新疆地區維漢民族淋巴細胞亞群和NK細胞與帕金森病的相關性

蔣 森,王鵬飛,高 華,楊新玲

(1新疆醫科大學第一附屬醫院神經內科,烏魯木齊 830054;2新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科;3新疆醫科大學第二附屬醫院；*通訊作者:E-mail:yangxinling2014@163.com)

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新疆地區維漢民族淋巴細胞亞群和NK細胞與帕金森病的相關性

蔣 森1,王鵬飛1,高 華2,楊新玲3*

(1新疆醫科大學第一附屬醫院神經內科,烏魯木齊 830054;2新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科;3新疆醫科大學第二附屬醫院；*通訊作者:E-mail:yangxinling2014@163.com)

目的 研究新疆地區帕金森病(PD)患者外周血中淋巴細胞亞群及NK細胞數量的變化,為PD發病機制研究提供新的視角。 方法 應用流式細胞儀熒光染色法測定共33例維吾爾族及漢族PD患者外周血中T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞數量,并與20例健康對照組進行比較。同時也比較了不同民族間及不同用藥人群之間各細胞亞群的差異,分析了不同病程、疾病嚴重程度及HY分級與各細胞亞群的相關性。 結果 帕金森病患者外周血中CD3+,CD4+,CD8+T淋巴細胞較對照組明顯下降(P<0.05),但B淋巴細胞較對照組無明顯變化(P>0.05),NK細胞較對照組上升(P<0.05)。維族患者與漢族患者相比,各淋巴細胞亞群及NK細胞數量無明顯變化(P>0.05)。采用美多巴或森福羅治療患者各細胞亞群無明顯改變(P>0.05),年齡與CD3+T淋巴細胞亞群、病程與B細胞亞群數量相關(P<0.05)。 結論 PD患者外周血的淋巴細胞及NK細胞比例失調。外周血淋巴細胞亞群的變化可能有助于評估PD的病情進展。

帕金森病; T淋巴細胞; B淋巴細胞; NK細胞; 流式細胞儀

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是較為常見的神經系統退行性疾病之一,其發病率僅次于阿爾茨海默病。主要病理改變為黑質紋狀體及多巴胺能神經通路多巴胺神經元的逐漸變性缺失。遺傳、環境、年齡等是其發病的部分原因。而近年來,又有研究顯示炎癥反應也在其發病過程中占有重要地位[1]。有研究者觀察到動物模型中,CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群在PD病程22個月時上升[2]。也有研究顯示,在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)制備的PD模型中T細胞缺乏可以減緩多巴胺能神經元的退變過程[3,4],又有研究提示在PD患者尸檢中發現了位于中樞神經系統中的自然殺傷細胞(natural killer cells,NK cells)。以上事實說明淋巴細胞亞群與帕金森病密切相關。而多個病例對照研究顯示,PD患者中淋巴細胞亞群及NK細胞雖然處于正常范圍內,但較正常人仍有所改變。說明PD患者存在免疫紊亂。但以上研究結果不盡相同,仍需擴大樣本容量以進一步研究,以明確淋巴細胞亞群及NK細胞在PD病理過程中的作用,尋找可能的PD標記物。本研究抽取PD患者及正常對照組外周血,測定淋巴細胞亞群及NK細胞并進行比較,同時分析在不同民族間、不同的病程中是否有變化,探討其規律性。

1 資料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組選擇 入選標準：病例組患者為2016-09～2017-01于新疆醫科大學第一附屬醫院神經內科門診及住院治療的PD患者33例,其中男性16例,女性17例,平均年齡(61.3±10.9)歲,全部病例經詳細詢問病史,體格檢查,結合頭顱MRI檢查結果,可認定符合英國帕金森病學會腦庫制定的臨床診斷標準[5],疾病分期使用Hoehn-Yahr進行評價分級[6]。

排除標準：3個月內服用過免疫抑制劑或免疫增強劑;在3個月內接受過疫苗注射者;患有神經系統進行性或其他變性疾病/惡性病變或其他免疫性疾病者;帕金森綜合征患者;不能完成外周血相關指標檢測者。

病例分組：分別根據民族、是否服用相關藥物進行如下分組。按照民族分為兩組,維族患者8例,漢族患者25例。按是否應用美多巴分為兩組：服用過美多巴治療兩周以上15例,未服用美多巴18例。按是否應用森福羅分為兩組：服用過森福羅兩周以上6例,未服用過森福羅27例。

1.1.2 對照組選擇 對照組為2016-09～2017-01新疆醫科大學第一附屬醫院體檢人群,均無明顯心腦血管疾病、糖尿病、結締組織病、肝腎疾病及血栓性疾病等。其中男性8例,女性12例。平均年齡(57.5±9.5)歲。

1.1.3受試者一般資料 所有受試者采用詳細的問卷調查、體格檢查、實驗室檢測的方法收集相關資料。病例組及對照組均記錄受試者年齡、性別、體格檢查、Hoehn-Yahr(HY)分級、用藥史及既往史等。所有患者資料的采集和分型均由神經內科?？漆t生負責。過程中患者及醫生均不知患者分組情況。

1.2 淋巴細胞及NK細胞檢測方法

外周血淋巴細胞及NK細胞檢測使用直接免疫熒光染色法。全部受檢者均于清晨空腹抽取靜脈血2 ml置于EDTA紫色抗凝管中。抽血過程中護士及患者均不知檢測目的。各取血70 μl置于4個試管中,分別加入熒光素標記抗人CD3PE/CD4APC/CD8FITC,CD3PE/CD19FITC,CD56FITC單克隆抗體(美國BD公司)各5 μl,留一個空白對照試管?；靹蚝笾糜陉幇堤?8-20 ℃孵育20 min。各加紅細胞裂解液(美國BD公司)2ml充分震蕩混勻,置于陰暗處18-20 ℃孵育10 min。待紅細胞充分溶解后加1 ml PBS洗液(美國BD公司),2 000 r/min離心5 min,棄上清液,加300 μl PBS洗液重懸。使用Epics-XL型流式細胞儀(美國Coulter公司生產)檢測,以陽性率的百分率計算結果。

1.3 統計學處理

采用SPSS15.0軟件,所有計量資料均采用均數±標準差表示。應用Kolmogorov-Smirnov非參數檢驗進行正態性分析,若符合正態,多組比較使用單因素方差分析,兩組比較使用t檢驗。若不符合正態分布,或方差不齊,或例數較少,使用秩和檢驗。計量資料兩組相關性采用Pearson直線相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 臨床資料比較

兩組在年齡、性別及民族構成方面無顯著差異(P>0.05,見表1)。病例組患者病程(2.87±2.09)年，HY分級1.85±0.60；服用美多巴15例，未服用18例；服用森福羅6例，未服用27例。

表1 病例組及對照組基本資料比較

Table 1 Characteristics of the included population

組別年齡(歲)性別(男/女)民族(漢/維) PD組61．3±10．916/1725/8 對照組57．5±9．58/1213/7 t/χ2-1．2870．3620．710 P0．2040．5470．399

2.2 淋巴細胞亞群及NK細胞結果分析

2.2.1 PD組與對照組比較 PD患者外周血CD3+,CD4+,CD8+T細胞亞群較對照組顯著降低(P<0.05),CD19+B細胞亞群較對照降低,但差異無統計學意義(P=0.345),CD56+NK細胞較對照組顯著上升(P=0.012),差異有統計學意義(見表2)。

表2 病例組及對照組各細胞亞群結果 (%)

Table 2 Comparison of lymphocytes and NK cells between PD patients and controls (%)

組別CD3+CD4+CD8+CD19+CD56+PD組5940±10583360±10441857±855913±4962000±981對照組6609±7043966±4771857±8551022±2591319±363t/Z25-224-242-094-25P0015002500150345 0012

2.2.2 維漢族之間進行比較 漢族和維族的PD患者或對照組之間,CD3+,CD4+,CD8+T細胞,CD19+B細胞,CD56+NK細胞亞群水平無明顯差異(P>0.05,見表3)。

2.2.3 服用及未服用患者之間比較 服用美多巴組較未服用患者各細胞亞群有所下降,但其差異無統計學意義(P>0.05)。服用森福羅PD與未服用組比較,除CD8細胞亞群外,其余各亞群有所下降,但差異無統計學意義(P>0.05,見表4)。

表3 維漢族患者各細胞亞群結果 (%)

Table 3 Comparison of lymphocytes and NK cells between Han and Uygur ppopulations (%)

組別CD3+CD4+CD8+CD19+ CD56+漢族PD6006±11333387±10141820±830878±5362062±914維族PD5735±8053275±12001971±9811021±3491806±1219 P0331099109030439 0198漢族對照6716±7383932±5732252±559990±2971323±413維族對照6410±6394030±2402491±2861081±1701311±277 P038707860420522 0944

表4 服用不同藥物PD患者各細胞亞群結果 (%)

Table 4 Comparison of levels of lymphocytes and NK cells between PD patients with different treatment (%)

藥物處理CD3+CD4+CD8+CD19+CD56+美多巴服用5627±11703201±12091853±967871±5871905±876未服用6201±9053492±8981860±779948±4202079±1081P 0161 052907510560688森福羅服用5182±15622812±7831897±11251017±7861872±703未服用6109±8633481±10671848±810890±4252028±1042P 013 00708320464098

2.2.4 相關性分析 對所有PD患者的各細胞亞群數量與年齡、病程以及HY分級進行相關性分析,可見CD3與年齡呈線性相關,相關系數為0.446,CD19與病程呈線性相關,相關系數為-0.406(見表5)。

表5 年齡,病程及HY評分與各細胞亞群相關性

Table 5 Correlation of age or duration or HY with lymphocytes or NK cells

因素統計量CD3+CD4+CD8+CD19+ CD56+年齡r044602660022-0258009P0009#0134090201470617病程r-0174-0132-0105-04060165P0366049605890029#0392HY分級r-0292-0053-0052-01650183P0117078078503830344

#P<0.05

3 討論

帕金森病(PD)是一類中樞神經系統退行性疾病,由遺傳與環境相關作用所致的復雜性疾病。近年來,關于帕金森病與免疫相關研究逐漸增多。Abramsky最早提出免疫學異?？赡苁荘D發病的重要影響因素之一。研究表明,中樞神經系統炎癥是全身炎癥反應的一部分。全身系統性炎癥反應導致促炎分子、外周T細胞亞群進入腦組織中激活小膠質細胞[7-12],一旦小膠質細胞被激活,就可產生大量細胞毒性分子,包括NO[13],ROS[14]等,促進了帕金森病的病理過程。CD4+T淋巴細胞亞群被稱為輔助性T淋巴細胞(Th),MTPT動物模型提示,其可介導Fas/Fasl導致多巴胺神經元的死亡[15],但也有人發現其對多巴胺神經元有保護作用。輔助性T淋巴細胞在免疫系統中所起作用較為廣泛,所以其在帕金森病人外周血變化規律并不十分肯定,但大多數對PD病例-對照的研究,傾向于其降低[16-33]。一些研究還提到,根據患者疾病嚴重程度或患者年齡的增加,CD4+T淋巴細胞亞群降低的趨勢進一步增加[17,19,24,26-28,31,32]。CD8+T 淋巴細胞亞群在殺傷病毒感染細胞及腫瘤細胞中有重要作用。關于其與帕金森病之間關系,在多個研究中并未得到證實[16-20,24,29,33]。只有少數研究顯示PD患者CD8+T淋巴細胞數量較對照組下降[23,26,28,31]或是上升[22,25,30]。李鳳舞等[32]及趙旭[26]的研究顯示,隨著PD患者病情加重,CD8+T細胞數量逐漸減低,但只有病情發展至最嚴重階段,PD較對照組CD8+T細胞下降才差異有統計學意義。B細胞可分泌抗體,也是一類重要的抗原提呈細胞,同時可分泌多種細胞因子和某些趨化因子等來參與免疫應答的調控,CD19或CD20為B細胞的表面標志,通過不同染色的抗體與其結合,可通過流式細胞儀將其區分出來。其與帕金森的相關研究較少,關系并不明確,大部分研究[16,18,19]顯示PD組患者較正常對照組下降。僅有張思韻等[29]未觀察到兩者之間的關系。NK細胞(natural kill cell)不依賴抗體,因此稱為自然殺傷細胞,是固有免疫細胞,作用于靶細胞殺傷作用出現較早。而且其可分泌多種細胞因子,是機體抗感染及抗腫瘤的重要因素,也參與Ⅱ型超敏反應。其表面特異性標志為CD16,CD56,仍可通過流式細胞儀測定。有研究顯示其在PD患者中上升[18,19,28,31],Stevens等[16]也觀察到NK細胞的上升,但在其研究中,與對照組相比無統計學意義。

本研究結果顯示,患者外周血中,CD3+,CD4+,CD8+T細胞亞群較對照組顯著降低,B細胞亞群較對照降低,但差異無統計學意義,NK細胞較對照組顯著上升。這與之前的研究結果[29,31]大體接近?？赡芘c神經元變性與大量丟失、自由基生成、氧化反應增強,使大腦皮質至紋狀體、丘腦底核至蒼白球與黑質網狀部復合體的興奮性神經遞質作用過強,從而引起大腦皮層中樞神經體液免疫調節力減弱,T細胞活性降低等相關[34]。NK細胞升高可能是發生了K細胞對多巴胺能細胞的抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用反應。有人認為K細胞活性低對病情進展不利,因為它們不能有效抑制那些有害因素。

目前國內比較兩民族間差異性的研究尚屬少見。既往研究顯示,維漢民族之間PD患者危險因素、臨床表現有所差異[35,36]。因此,本研究還進行了不同民族間各細胞亞群的比較,但其結果差異無統計學意義?？紤]種族間差異較小,也可能為樣本量較小,未能突出差異。

有人檢測到PD外周血的淋巴細胞多巴胺受體表達增加,經美多巴或溴隱亭治療后可減少。受體密度的增高可能代表了由多巴胺能系統彌漫性損害所產生的上調機制,是中樞多巴胺能缺陷的一種代償機制。本文研究不同藥物對PD患者T淋巴細胞亞群、B細胞、NK細胞的影響,發現服用與未服用藥物的PD患者比較,各細胞亞群并無顯著差異。但本研究未作長期不同時間間隔的觀察,考慮藥物的治療效果,故此結論尚需進一步論證。

PD作為一種神經退行性疾病,既往研究顯示其與年齡、病程、嚴重程度有一定相關性。本研究中,我們對各細胞亞群與年齡、病程及嚴重程度進行了一定分析，只發現CD3與年齡,CD19與病程有一定相關性。

總之,細胞免疫功能及固有免疫異常與PD密切相關,但其為PD的始動因素或繼發因素仍需進一步觀察。其確切機制仍有待深入研究。

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Correlation between lymphocyte subsets or natural killer cells and Parkinson’s disease in Uygur and Han population

JIANG Sen1,WANG Pengfei1,GAO Hua2,YANG Xinling3*

(1DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China;2DepartmentofNeurology,FifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity;3SecondAffiliatedHospital,XijiangMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:yangxinling2014@163.com)

ObjectiveTo investigate the variation and clinical significance of lymphocyte subsets and natural killer(NK) cells in Parkinson’s disease(PD).MethodsFlow cytometry was used to measure the numbers of T lymphocytes,B lymphocytes and NK cells in the peripheral blood of 33 Han and Uygur PD patients. And 20 healthy controls were chosen. The difference of lymphocyte subsets was compared between three groups. The correlation of disease duration,severity and HY grades with lymphocyte subsets was analyzed.ResultsCompared with healthy controls,the numbers of CD3+,CD4+,CD8+significantly decreased in PD patients(P<0.05),while the level of CD19+had no statistical change(P>0.05),and the level of CD56+increased significantly(P<0.05). There was no significant difference in the numbers of lymphocyte subsets and NK cells between Uygur patients and Han patients(P>0.05). No signifiant differences of lymphocyte subsets and NK cells were observed between the patients who accepted madopar or sifrol or not (P>0.05). There was a significant linear correlation between age and CD3+subsets,between disease duration and CD19+subsets(P<0.05).ConclusionLymphocyte subsets and NK cells change in the peripheral blood of PD patients,which demonstrates the immune disorders in the pathogenesis of PD. The changes of lymphocytes and NK cells may help assess the severity of PD.

Parkinson’s disease; T lymphocytes; B lymphocytes; NK cells; flow cytometry

國家自然科學基金資助項目(U1503222)

蔣森,男,1986-11生,碩士,住院醫師,E-mail:abruzzibruce@163.com

2017-01-23

R745

A

1007-6611(2017)06-0550-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.009