兒童1型糖尿病血清T細胞亞群與胰島功能的相關性

張改秀,王 蕾,杜 建,胡東陽,張明襯,郭婷婷,張曉盼

(1山西省兒童醫院內分泌科，太原 030013；2山西醫科大學兒科學教研室；*通訊作者，E-mail：2651024846@qq.com)

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兒童1型糖尿病血清T細胞亞群與胰島功能的相關性

張改秀1*,王 蕾1,杜 建1,胡東陽2,張明襯2,郭婷婷2,張曉盼2

(1山西省兒童醫院內分泌科，太原 030013；2山西醫科大學兒科學教研室；*通訊作者，E-mail：2651024846@qq.com)

目的 分析1型糖尿病初發患兒外周血T細胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)變化特點；探討1型糖尿病初發患兒外周血T細胞亞群與胰島功能的關系。 方法 選擇2010-05～2013-12山西省兒童醫院確診的T1DM初發患兒43例，25例健康體檢兒童為對照組。采用流式細胞技術測定血清CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T細胞亞群，并對兩組結果進行比較。對T1DM初發患兒T細胞亞群與糖化血紅蛋白、C肽(C-P)水平進行相關性分析。 結果 T1DM組患兒外周血CD4+T細胞、CD4+/CD8+T細胞明顯高于對照組(P<0.05)，CD8+T細胞明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。T1DM患兒外周血CD4+T細胞與HbA1c呈正相關(r=0.261，P<0.05)，與C-P呈負相關(r=-0.270，P<0.05)；CD8+T細胞與HbA1c無明顯相關性(r=-0.156，P>0.05)，與C-P水平呈正相關(r=0.162，P<0.05)；CD4+/CD8+T細胞與HbA1c無明顯相關性(r=0.200，P>0.05)，與C-P水平呈負相關(r=-0.243，P<0.05)。 結論 T1DM的發病過程存在T淋巴細胞亞群失衡， CD4+T細胞異常激活、CD8+T細胞缺陷和CD4+/CD8+T細胞比值增高。CD4+及CD4+/CD8+T細胞與C肽呈負相關，CD8+T細胞與C肽呈正相關。

1型糖尿??； T細胞亞群； 胰島功能； 糖化血紅蛋白； C肽

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于內源性胰島素絕對或相對缺乏，導致血糖增高而引起的全身慢性代謝性疾病[1]。兒童期常見1型糖尿病(type 1 diabetes，T1DM)。多數學者認為T1DM是在遺傳易感性基因的基礎上，受到病毒感染等外界環境因素的影響，引起自身免疫功能紊亂，導致胰島β細胞的損傷和破壞，最終引起胰島β細胞的功能衰竭而發病[2]。T淋巴細胞對胰島的浸潤和破壞是1型糖尿病發病的中心環節。

本課題采用免疫熒光標記和流式細胞技術測定43例T1DM初發患兒(T1DM組)及25例正常兒童(對照組)血清T細胞亞群。對T1DM初發患兒T細胞亞群的變化與糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)、空腹胰島素(Fins)及空腹C肽(C-peptide，C-P)水平進行相關性分析，旨在探討T1DM初發患兒T細胞亞群的變化特點及與胰島功能之間的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗組 收集2010-05～2013-12山西省兒童醫院確診的T1DM初發患兒共43例，男19例，女24例，年齡1.5-15歲，平均年齡(7.65±3.87)歲，均參照1999年世界衛生組織(WHO)的糖尿病診斷標準[3]，同時依據以下臨床特征作出診斷[4]：①起病年齡較小(<20歲)；②起病較急，“三多一少”癥狀明顯，可有脫水、循環衰竭或昏迷等酮癥酸中毒癥狀；③空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖或任意血糖≥ 11.1 mmol/L；④C肽反應低下并依賴胰島素治療。排除原發性心、肝、腦、腎等疾病或自身免疫性疾病，未使用激素、免疫調節劑及胰島素治療。

1.1.2 對照組 選取同期本院體檢的健康兒童25例，其中男11例，女14例，年齡1.5-14歲，平均年齡(6.84±3.60)歲。對照組均無糖尿病家族史，糖化血紅蛋白及空腹血糖檢測排除糖尿病。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 入院時詳細記錄患兒年齡、性別、病程、身高、體質量、父母文化程度。

1.2.2 生化檢查 常規送檢空腹血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、C肽(C-P)水平、胰島素(Fins)。所有血樣均在早晨空腹狀態下抽取。

1.2.3 外周血T細胞亞群(CD4+，CD8+，CD4+/CD8+)檢測 采用美國Beckman Coulter公司FC 500系列流式細胞分析儀及其提供的試劑等進行T細胞亞群的檢測。實驗方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用 EXPO32v1.2 Analysis 軟件分析CD4+T及CD8+T細胞的表達，從 FSC/SSC 雙參數散點圖中圈出T淋巴細胞群體設門并計數細胞，根據所占T淋巴細胞的百分比得出結果。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 一般情況

與對照組相比，T1DM組患兒年齡、病程、性別比例、體質量指數等指標差異無統計學意義(P>0.05)；患兒父母文化程度亦無統計學意義(P>0.05,見表1)，具有可比性。

表1 兩組研究對象一般情況比較

Table 1 Comparison of general clinical data between two groups

組別年齡(歲)病程(d)性別(男/女)體質量指數(kg/m2)父母文化程度初中及以下高中大學及以上T1DM7．65±3．8739．37±1．1619/2420．2±0．51211012對照組6．84±3．6011/1419．1±0．741087

2.2 實驗組與對照組CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T細胞比較

T1DM組CD4+T細胞及CD4+/CD8+T細胞較對照組增高，差異有統計學意義(P<0.05)，CD8+T細胞低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

2.3 T1DM組T細胞亞群與胰島功能的相關性分析

T1DM組患兒CD4+T細胞與HbA1c呈正相關(r=0.261，P<0.05)，與C-P呈負相關(r=-0.270，P<0.05)；CD8+T細胞與HbA1c無明顯相關性(P>0.05)，CD8+T細胞與C肽水平呈正相關(r=0.162，P<0.05)；CD4+/CD8+T細胞與HbA1c無明顯相關性(r=0.200，P>0.05)，與C-P水平呈負相關(r=-0.243，P<0.05, 見表3)。

表2 對照組與T1DM組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的比較 (%)

Table 2 Comparison of CD4+, CD8+and CD4+/CD8+between control group and T1DM group (%)

組別CD4+CD8+CD4+/CD8+對照組 31．59±5．8428．44±2．981．22±0．36T1DM組36．39±8．4726．15±6．701．46±0．66t1．4131．5311．424P0．0370．0180．035

表3 CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T細胞與HbA1c及C肽的相關性分析

Table 3 Correlation analysis of CD4+T, CD8+T and CD4+/CD8+T cells with HbA1c and C peptide

指標C?PHbA1crPrPCD4+-0．2700．0260．2610．031CD8+0．1620．108-0．1560．205CD4+/CD8+-0．2430．0460．2000．102

3 討論

1型糖尿病(T1DM)是自身免疫性疾病，遺傳因素和環境因素共同參與發病過程，兒童及青少年發病人數約占DM患者的5%[5]。我國兒童T1DM校正發病率為每年0.59/10萬，按全國人口年齡構成的標化發病率為每年0.57/10年，是世界上T1DM發病率最低的國家之一[6]。王克安等[5]對我國兒童T1DM發病率調查結果顯示：中國兒童1型糖尿病的發病率在逐年上升；發病率隨年齡的增長而增加；發病率在不同地區之間呈現明顯的南低北高現象。

T淋巴細胞包括CD4+T細胞和CD8+T細胞兩個功能亞群，在T1DM發病過程中發揮十分重要的作用。CD4+細胞是胰島β細胞早期主要的浸潤細胞，Th1/Th2主要通過自身或其他免疫細胞分泌的細胞因子進行自我調節和相互調節，以維持機體免疫平衡[7]。當Th1和Th2兩種細胞功能失衡時，主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)基因編碼的Ⅱ類抗原HLA-DR3，DR4與胰島β細胞抗原相結合，與T細胞表面受體(T cell receptor，TCR)構成“抗原-HLA Ⅱ類抗原-TCR復合物”，激活Th1細胞分泌大量細胞因子，進一步誘導自身反應性T淋巴細胞浸潤胰島，對胰島β細胞產生毒性作用，從而引起胰島β細胞的損傷和衰竭[8]。施畢渂[9]對37例T1DM外周血T細胞亞群等分子的表達試驗結果提示患者外周血CD4+T細胞數明顯增加，CD8+T細胞數明顯降低(P<0.01)。鄒曉蕾等[10]通過實驗發現STZ誘導的T1DM模型小鼠血清CD4+Th1細胞分泌的細胞因子IFN-γ水平明顯高于正常對照小鼠，認為T1DM發病過程中存在CD4+Th1細胞優勢分化，其產生的細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2等對胰島β細胞發揮直接毒性效應。支滌靜等[11]研究表明，病程<2年的T1DM患兒IFN-γ水平高于病程>2年者，認為Th細胞的反應與病程密切相關，并隨著T1DM病程的進展，殘留胰島β細胞的減少，Th1細胞的表達也趨于穩定。本實驗結果顯示T1DM初發患兒的外周血CD4+值與正常健康兒童相比，其CD4+T細胞所占百分比明顯增加(P<0.01)，說明Th1細胞在T1DM發病初期中被異常激活，與文獻報道一致。本組病例均為T1DM初發患兒，對于Th1細胞是否隨病程發展而趨于穩定，尚不能得出結論。

CD8+T細胞是細胞免疫的主要效應細胞，通過MHC-Ⅰ類限制性的方式識別靶細胞表面的多肽抗原，代表抑制性T細胞(suppressor T cell，Ts)和細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell，CTL)[12]。Ts細胞主要抑制CD4+T細胞增殖活化，維持自身免疫耐受；CTL能特異性殺傷靶細胞，在抗病毒感染和抗腫瘤免疫中起到重要作用[13]。有報道表明，CD4+T細胞等通過Fas/FasL通路誘導了胰島β細胞凋亡的起始，而CD8+T細胞識別胰島β細胞表面的MHC-I類蛋白后，通過分泌穿孔素、Fas/FasL的相互作用等途徑，貫穿于胰島β細胞凋亡的整個過程[14]。一般認為，Ts細胞減少或失活，引起免疫失衡，進一步誘導Th細胞對胰島β細胞免疫的損傷作用，促進T1DM的發生和發展；CTL激活并介導對胰島β細胞的直接殺傷作用，則加速T1DM的發生[15]。喬凌燕等[16]對23例兒童1型糖尿病患兒研究發現，CD8+T淋巴細胞減少，其原因可能是CD8+毒性T淋巴細胞因介導胰島β細胞的破壞而大量消耗，或免疫功能調節不平衡所致。本研究檢測結果顯示，T1DM初發患兒的CD8+T細胞所占百分比明顯降低(P<0.01)，與文獻報道一致，CTL參與胰島β細胞的直接殺傷作用被大量消耗，最終引起CD8+T細胞的減少。

糖化血紅蛋白(HbA1c)與血糖水平的高低及持續時間呈正相關，通?？煞从矰M患者近2-3個月血糖的綜合平均濃度，是判斷和衡量DM患者長期血糖控制情況的金標準[17]。有研究表明，T1DM初發期CD4+/CD8+比值與HbA1c呈正相關(P<0.05)，也有學者將T1DM患兒的IFN-γ、IL-4值與HbA1c進行比較，差異無統計學意義，認為T1DM患兒CD4+T細胞免疫狀態與血糖控制程度無相關性[18]。本研究對CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與HbA1c水平的相關性進行分析，結果顯示CD4+與HbA1c呈正相關(r=0.261，P<0.05)，而CD8+、CD4+/CD8+與HbA1c水平無明顯相關性。研究表明CD4+T細胞免疫活性增強促進了患兒血糖水平的升高，而CD8+T細胞的免疫狀態與患兒血糖水平無明顯相關性。

C-P是反應胰島β細胞功能的有力指標[19]。本研究顯示CD8+T細胞與C-P水平呈正相關，CD4+、CD4+/CD8+T細胞與C-P水平呈負相關。C-P反映胰島β細胞的儲備和分泌功能，C-P水平越低，胰島β細胞的儲備將越少，分泌功能也越弱，而CD8+T細胞的Ts及CTL以自身消耗為代價介導胰島β細胞的凋亡過程，CD8+T細胞的減低間接反映了胰島β細胞的進一步減少。因此，我們認為CD8+與C肽水平在一定程度上呈正相關性。CD4+Th1細胞分泌大量細胞因子，可直接促進胰島β細胞凋亡，并促進CD8+T細胞分化成熟，介導對胰島β細胞的損傷作用，故CD4+及CD4+/CD8+T與C-P水平呈負相關。

綜上所述，T1DM患兒血清T細胞亞群的變化及其與胰島功能的相關性涉及內容廣泛且復雜。T淋巴細胞及細胞因子具有多效性、網絡性的特點，一種細胞因子不是單一起作用，而與其他細胞因子相互聯系起到協同或拮抗作用。深入研究每一種細胞、細胞因子及它們相互作用的機制，進一步揭示T細胞與胰島功能的關系，將為明確1型糖尿病的免疫學機制，為T1DM的治療提供新的思路和策略。

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Relationship between the serum levels of T cell subgroup and pancreatic islet function in children with type 1 diabetes

ZHANG Gaixiu1*， WANG Lei1， DU Jian1，HU Dongyang2， ZHANG Mingchen2，GUO Tingting2，ZHANG Xiaopan2

(1DepartmentofEndocrinology,Children’sHospitalofShanxiProvince，Taiyuan030013，China；2DepartmentofPediatrics,ShanxiMedicalUniversity；*Correspondingauthor，E-mail:2651024846@qq.com)

ObjectiveTo investigate the changes of T lymphocyte subsets (CD4+, CD8+, CD4+/CD8+) in peripheral blood of untreated children with type 1 diabetes mellitus, and to explore its relationships with islet function.MethodsForty-three children with T1DM in Shanxi Children’s Hospital from May 2010 to December 2013 were selected as experimental group, and 25 healthy children were chosen as control group. The expression of CD4+, CD8+, and CD4+/CD8+T cell subsets in two groups was measured by flow cytometry, and the results were compared. Correlation between T cell subsets and glycated hemoglobin, C peptide levels in T1DM children was analyzed.ResultsThe levels of CD4+T cells and CD4+/CD8+T cells in peripheral blood were significantly higher in T1DM group than in control group (t=1.413, 1.424,P<0.05), while the level of CD8+T cells was significantly lower(t=1.531,P<0.05). The level of CD4+T cells in peripheral blood was positively correlated with HbA1c (r=0.261,P<0.05), but negatively correlated with C-P (r=-0.270,P<0.05). The level of CD8+T cells was not significantly correlated with HbA1c (r=-0.156,P>0.05), but positively correlated with C-P (r=0.162,P<0.05). The level of CD4+/CD8+T cells was not significantly correlated with HbA1c(r=0.200,P>0.05), but negatively correlated with C-P(r=-0.243,P<0.05).ConclusionT lymphocyte subsets imbalance,such as abnormal activation of CD4+T cells, CD8+T cell deficiency and the increase of CD4+/CD8+T cell, is involved in the process of the onset of T1DM. CD4+and CD4+/CD8+T cells are negatively correlated with C-P, and CD8+T cells are positively correlated with C-P.

type 1 diabetes； T cell subset； pancreatic islet function； glycosylated hemoglobin； C peptide

張改秀，女，1966-05生，博士，副主任醫師， E-mail： 2651024846@qq.com

2017-03-06

R587.1

A

1007-6611(2017)06-0615-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.023