碲化鎘量子點抑制人臍靜脈內皮細胞存活并損傷線粒體

嚴明，張云，劉珂舟，孫永紅

（1.杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院，浙江杭州310018；2.紹興文理學院基礎醫學院，浙江紹興312000；3.浙江大學生物醫學工程與儀器科學學院浙江省心腦血管檢測技術與藥效評價重點實驗室，浙江杭州310027）

碲化鎘量子點抑制人臍靜脈內皮細胞存活并損傷線粒體

嚴明1，張云2，劉珂舟1，孫永紅3

（1.杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院，浙江杭州310018；2.紹興文理學院基礎醫學院，浙江紹興312000；3.浙江大學生物醫學工程與儀器科學學院浙江省心腦血管檢測技術與藥效評價重點實驗室，浙江杭州310027）

目的 觀察碲化鎘量子點（CdTe QD）對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）線粒體自噬的誘導作用，探討CdTe QD對血管內皮細胞的毒理特性。方法原代培養的HUVEC采用免疫熒光法鑒定后與CdTe QD（0.1～100 mg·L-1）共孵育24 h，MTT法檢測細胞存活；Mitotracker標記、激光共聚焦顯微術觀察線粒體斷裂情況；JC-1染色、流式細胞術檢測CdTe QD對HUVEC線粒體膜電位的影響；Western蛋白印跡法檢測線粒體自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3Ⅰ/Ⅱ（LC3Ⅰ/Ⅱ）、膜突蛋白樣BCL2作用蛋白1（Beclin1）、同源性磷酸酶張力蛋白誘導的激酶1（PINK1）和動力相關蛋白1（DRP1）水平的變化。結果 經鑒定，原代培養的HUVEC＞95%為血管內皮細胞。MTT結果 顯示，CdTe QD作用于HUVEC 24 h后，細胞存活率顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。激光共聚焦顯微術檢測發現，CdTe QD導致HUVEC胞內線粒體大量斷裂。流式細胞術檢測染色結果 表明，CdTe QD 0.1,1和10 mg·L-1使HUVEC的線粒體膜電位下降，膜電位較高的HUVEC比例分別由正常對照組的（91.8±0.6）%下降至（90.2±1.1）%，（84.4±0.9）%和（78.1±1.3）%（P＜0.05，P＜0.01）。Western蛋白印跡結果 顯示，CdTe QD 10 mg·L-1誘導自噬相關蛋白Beclin1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值PINK1和DRP1的水平升高（P＜0.05，P＜0.01），CdTe QD 1 mg·L-1還造成線粒體自噬相關蛋白PINK1和DRP1表達顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。結論CdTe QD可誘導HUVEC線粒體損傷并激活線粒體自噬。

碲化鎘量子點；臍靜脈內皮細胞；線粒體；自噬；線粒體自噬

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.012

量子點（quantum dots，QD）是一類在生物醫學領域常用的半導體發光納米材料，通常由1～2種或更多的Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成，是三維尺寸均10 nm的球形或類球形超微顆粒［1］。我們利用水熱法合成了巰基丁二酸包被的碲化鎘QD（CdTe QD）。其具有優于傳統有機熒光染料的光電特性，如激發光譜寬而連續，發射光譜窄而對稱；同時其發射光譜可通過改變尺寸進行調諧，從而具有實現單激發、多發射的多色熒光標記的可能。CdTe QD還具有良好的光穩定性和抗淬滅能力；此外，其表征結果 還顯示其表面包被完整、鎘泄漏低［2］。因此，該QD具有良好的生物醫學標記應用前景。然而，目前已有研究表明，QD存在一定的生物毒性［3］，這是QD應用于臨床的最大障礙。特別是用于在體成像時，它可通過注射直接進入機體血液循環系統［4］，對人體健康尤其是心血管系統健康構成潛在危害。

血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VEC）是位于血液與血管壁內皮下組織之間的單層扁平細胞，是生理條件下與血液直接接觸的唯一血管細胞。因此，當QD經注射進入血管后將可能與內皮細胞發生直接作用。正常生理狀態下，VEC不僅對于血漿大分子具有屏障作用，還能分泌如一氧化氮等重要的細胞因子來調節血液系統、心血管系統甚至免疫系統等的生理功能；而當外源性有毒物質攻擊VEC時，則可能造成VEC損傷（如線粒體等細胞器的功能紊亂）甚至死亡，并進而影響機體平衡、導致動脈粥樣硬化等疾病的發生［5］。我們前期研究發現，水熱法合成的CdTe QD會造成人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）內活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量迅速上升［2］。細胞內ROS主要由線粒體產生，而線粒體對ROS的損傷作用又最為敏感。為維持細胞內穩態，這些受損的線粒體可通過細胞自噬機制選擇性地清除，這一過程被稱為線粒體自噬（mitophagy）［6］。但該CdTe QD是否會損傷HUVEC的線粒體功能并誘發線粒體自噬，目前尚無報道。本研究擬在前期研究基礎上，采用體外培養HUVEC，研究CdTe QD對HUVEC線粒體功能的損傷及其對線粒體自噬的激發作用，以進一步探討QD誘導HUVEC損傷及應激調控的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

M200培養基、低血清生長添加物（low serum growth supplement，LSGS）和線粒體膜電位染料（5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide，JC-1）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；胰酶細胞消化液購自上海碧云天生物技術有限公司；RIPA細胞裂解液、蛋白濃度測定試劑盒（BCA法）和超敏ECL化學發光試劑盒均購自聯科生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）和碘化吡啶（propidium iodide，PI）購于美國Sigma公司；小鼠抗人VEC特異性分子VE-cadherin單克隆抗體購自美國eBioscience公司，兔抗人微管相關蛋白1輕鏈3Ⅰ/Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅰ/Ⅱ，LC3Ⅰ/Ⅱ）單克隆抗體、兔抗人膜突蛋白樣BCL2作用蛋白1（moesinlike BCL2-interacting protein1，Beclin1）單克隆抗體、兔抗人同源性磷酸酶張力蛋白誘導的激酶1〔phosphatase and tensin homologue（PTEN）-induced putative kinase 1，PINK1〕單克隆抗體，兔抗人動力相關蛋白1（dynamin related protein 1，DRP1）單克隆抗體和小鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗和FITC標記的山羊抗兔IgG二抗均購自杭州聯科生物技術有限公司。

電子分析天平購自瑞士梅特勒-托利多公司，恒溫二氧化碳細胞培養箱購自美國Thermo scientific公司，高速臺式冷凍離心機購自德國Hermle公司，酶標儀購自美國Molecular Devices公司，流式細胞儀購自美國BD公司，激光共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司，電泳儀、轉膜儀及凝膠成像分析系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 HUVEC培養及分組處理

無菌條件下取健康新生兒臍帶（20～30 cm），參考Jaffe等［7］的方法并加以改進，采用Ⅰ型膠原酶（1 g·L-1）消化法進行HUVEC的原代培養。消化結束將收集到的細胞400×g離心5 min，棄上清、加入含10%LSGS的M200培養基，接種于培養瓶中，37°C，5%CO2培養箱靜置培養。24 h后首次換液，之后每隔48 h換液。至細胞長滿培養瓶底面90%后用胰酶消化、傳代。取3～5代HUVEC用于后續實驗。

用電子分析天平稱取10 mg CdTe QD干粉溶于1 mL PBS中，得到10 g·L-1母液。上述母液經0.22 μm濾膜過濾除菌后4°C儲存備用。細胞染毒時將儲存液用PBS稀釋為1～1000 mg·L-1染毒工作液，作用于HUVEC。

將HUVEC隨機分成細胞對照組和不同劑量CdTe QD作用組。細胞對照組細胞每孔加入1/10體積的PBS，不同劑量CdTe QD組分別加入1/10體積相應濃度的染毒工作液，使其終濃度為0.1～100 mg·L-1，孵育24 h后取細胞進行實驗。

1.3 免疫熒光鑒定內皮細胞純度

HUVEC接種至玻璃底培養皿中，生長至融合后用3.7%多聚甲醛固定30 min，然后加入0.5%Triton X-100和含5%BSA的PBS室溫孵育各20 min；去除BSA后，加入用0.1%Triton X-100和5%BSA稀釋的小鼠抗人VE-cadherin抗體（1∶100稀釋），4°C孵育過夜；第2天用PBS清洗后，加入FITC標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶100稀釋），室溫孵育2 h。最后加入10 μL propidium lodide（PI）5 mg·L-1孵育5 min，滴加10 μL抗熒光淬滅劑封片后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察HUVEC VE-cadherin的表達。

1.4 MTT法檢測細胞存活率

取對數生長期的HUVEC接種于96孔培養板中，待細胞基本融合后按1.2處理細胞，待細胞與CdTe QD作用24 h后加入20 μL MTT溶液（5 g·L-1）繼續孵育4 h，然后棄上清并加入150 μL DMSO溶解藍紫色甲瓚結晶。用酶標儀在490 nm處檢測吸光度值（A490nm）。細胞存活率（%）=（處理組A490nm-對照組A490nm）/（細胞對照組A490nm-空白對照組A490nm）×100%。每組3復孔，并至少重復3次。

1.5 Mitotracker染色檢測線粒體形態

將HUVEC接種至玻璃底培養皿中，細胞90%融合后按1.2處理細胞24 h。處理結束后移除上清液，PBS洗2次后加入100 μL的Mitotracker染色液（100 nmol·L-1），避光孵育20 min，然后用激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體形態。

1.6流式細胞術檢測線粒體膜電位

HUVEC接種于24孔板，按1.2分組并處理細胞24 h后，PBS清洗細胞。然后用0.125%胰酶+ 0.01%EDTA消化液消化、離心收集細胞（400×g，5 min）。將收集的細胞重懸于PBS，制成單細胞懸液，加入JC-1染料（終濃度5 mg·L-1）避光孵育30 min后上流式細胞儀檢測。分群設定由對照組細胞加入線粒體解耦聯劑CCCP（50 mg·L-1）再負載JC-1染料后獲取，每組設3復孔，實驗至少重復3次。以R1門內細胞數占檢測細胞的百分比表示線粒體膜電位。

1.7 Western蛋白印跡法檢測Beclin1，LC3Ⅰ/Ⅱ，PlNK1和DRP1蛋白表達

HUVEC接種于6孔板，按1.2隨機分組處理細胞24 h。處理結束后，PBS清洗細胞、胰酶消化并離心收集細胞（400×g，10 min）；棄上清，加入RIPA裂解液冰上裂解、高速離心獲取細胞總蛋白。采用BCA法測定各組總蛋白量。每組各取50 μg蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育過夜（兔抗人Beclin1，LC3Ⅰ/Ⅱ，PINK1和DRP1單克隆抗體（1∶1000），小鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體（1∶1000），HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶2500）孵育1 h。然后按超敏ECL顯色試劑盒說明書，加入顯色液于凝膠成像系統中拍照。用Quantity One軟件分析蛋白條帶，以目標蛋白條帶與β肌動蛋白條帶積分吸光度比值表示目標蛋白的表達水平。

1.8 統計學分析

實驗結果 數據以x±s表示，采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，各組間比較釆用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HUVEC純度鑒定

光鏡下HUVEC形態（圖1A）所示，生長至融合時，HUVEC呈典型的“鋪路石”狀單層生長的狀態。激光共聚焦顯微鏡下觀察VEC特異性分子VE-cadherin免疫熒光染色結果 （圖1B）顯示，所有細胞的細胞核均被PI染色，呈現紅色熒光，其中＞98%的細胞為VE-cadherin免疫熒光染色陽性，其細胞膜呈現綠色熒光，表明HUVEC純度＞98%。

2.2 CdTe QD對HUVEC存活的影響

CdTe QD顯著抑制HUVEC的細胞存活（P＜0.05，P＜0.01），且隨著CdTe QD濃度上升，抑制作用逐漸增強。CdTe QD 0.1～100 mg·L-1處理24 h后，HUVEC細胞存活率分別下降到細胞對照組的（94.5± 3.2）%，（88.9±1.6）%，（54.5±2.6）%，（31.7±2.6）%，（21.2±2.5）%和（20.6±1.5）%（圖2）。

Fig.1 ldentification of human umbilical endothelial cells（HUVECs）by immunofluorescence staining.A：HUVECs under an optical microscope；B：HUVECs labeled with VE-cadherin antibody and PI.

Fig.2 Effect of CdTe quantum dot（CdTe QD）on HUVEC survival.HUVECs were treated with CdTe QD（0.1-100 mg·L-1）for 24 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.3 CdTe QD對HUVEC線粒體形態的影響

細胞對照組的線粒體呈網狀或長柱狀結構；而經CdTe QD 0.1，1和10 mg·L-1處理后的細胞，線粒體發生斷裂，線粒體呈短棒狀或點狀；隨著CdTe QD濃度升高，線粒體斷裂程度加深，表明CdTe QD導致HUVEC線粒體發生明顯的斷裂（圖3）。

Fig.3 Effect of CdTe QD on morphology of mitochondria in HUVECs（200×）.HUVECs were treated without（A）or with CdTe QD 0.1，1 and 10 mg·L-1（B，C，D）for 24 h，and the morphology of mitochondria was detected by Mitotracker staining.

2.4 CdTe QD對HUVEC線粒體膜電位的影響

如圖4A和4B所示，正常HUVEC線粒體膜電位保持在較高水平，（91.8±0.6）%的細胞內JC-1以J-凝聚體（aggregates）的形式存在，而線粒體膜電位解偶聯劑CCCP 50 mg·L-1使HUVEC線粒體膜電位完全崩解，膜電位較高的HUVEC細胞僅占所有細胞的（5.9±2.3）%。在CdTe QD作用下，HUVEC線粒體膜電位下降（P＜0.01），CdTe QD 0.1，1和10 mg·L-1處理后，膜電位較高的HUVEC細胞百分比分別下降至（90.2±1.1）%，（84.4±0.9）%和（78.1±1.3）%，提示CdTe QD能誘導HUVEC線粒體損傷。

2.5 CdTe QD對HUVEC線粒體自噬相關蛋白表達的影響

Fig.4 Effect of CdTe QD on mitochondrial membrane potential（MMP）of HUVECs by flow cytometry.See Fig.3 for the cell treatment.Cells were digested and labeled with JC-1.R1：J-aggregates；R2：J-monomers.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

Fig.5 Effect of CdTe QD on expression of mitophagy related protein microtubule-associated proteinⅠlight chain 3Ⅰ/Ⅱ（LC3Ⅰ/Ⅱ），Beclin1，phosphate and tensin homolo-induced putative kinaseⅠ（PlNK1）and dynamin-related protein 1（DRP1）in HUVECs by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.B and C were the semi-quantitative results of A.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

Western蛋白印跡法結果 （圖5）示，與細胞對照組相比，CdTe QD作用24 h后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（P＜0.05），分別由0.44±0.08升高至0.48± 0.10，0.52±0.10和0.74±0.08。Beclin1蛋白表達增加（P＜0.01），由細胞對照組的0.62±0.09上升至0.66±0.06，0.71±0.05和0.94±0.08。線粒體自噬相關蛋白PINK1和DRP1表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），PINK1由0.37±0.14上升至0.53±0.05，0.75±0.09和0.93±0.13，DRP1則由0.40±0.05上升至0.52±0.08，0.64±0.07和0.71±0.13。上述結果 表明，CdTe QD能誘導線粒體自噬相關蛋白表達增加。

3 討論

本研究結果 表明，CdTe QD可顯著抑制HUVEC細胞存活，導致其細胞內線粒體大量斷裂，JC-1染色線粒體膜電位較高的HUVEC比例明顯下降；同時CdTe QD可誘導自噬相關蛋白Beclin-1表達上升，上調LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，還造成線粒體自噬相關蛋白PINK1和DRP1水平顯著上調，誘導細胞發生線粒體自噬。

細胞器是細胞功能正常運轉的結構基礎，線粒體因其能通過氧化磷酸化作用合成ATP，為細胞的生命活動提供能量，是細胞內最重要的細胞器之一。而線粒體的功能與其結構的完整性直接相關，換言之，線粒體斷裂將可能直接影響能量的合成和細胞功能。近年有研究證實，線粒體也是納米材料產生細胞毒性的重要靶點之一。如納米金和納米二氧化硅顆粒會造成VEC在內的多種細胞線粒體發生去極化和形態異常［8-9］。與之類似，本研究發現，CdTe QD也能導致HUVEC線粒體損傷（包括線粒體斷裂和線粒體膜電位崩解。有研究表明，線粒體膜電位的崩解將抑制VEC合成一氧化氮，進而抑制細胞功能［10-11］。因此，CdTe QD造成的HUVEC線粒體損傷除了抑制細胞能量供給外，還可能直接參與誘導細胞功能異常、抑制VEC功能。

另一方面，線粒體膜電位崩解常被視為細胞凋亡的早期事件，受損的線粒體可釋放并激活多種凋亡相關蛋白，誘導細胞凋亡［12］。因此，及時清除受損線粒體對維持細胞穩態至關重要。自噬是一種非常保守的細胞自我更新過程，在營養供應充足條件下的特異性自噬如線粒體自噬和過氧化物酶體自噬（pexophagy）等，可清除并回收受損細胞器，防止其對細胞造成進一步損傷甚至死亡。目前認為，PINK1介導的PINK1/Parkin通路與線粒體自噬密切相關。當線粒體膜電位下降時，PINK1在線粒體累積、將Parkin募集到受損線粒體并將其磷酸化。隨后，Parkin泛素化線粒體內多種底物蛋白，上述蛋白被信號接頭蛋白識別，再與LC3結合，介導線粒體進入自噬體。最終，隨著自噬體與溶酶體的融合受損線粒體被清除，從而達到保護細胞的目的［13-14］。此外，病理條件下，細胞內DRP1也將發生聚集，造成線粒體的促分裂狀態，從而調節線粒體自噬［15］。2014年常麗俊等［16］報道納米氧化鋁誘導神經細胞發生線粒體自噬。2015年Zhang等［17］研究發現，多金屬氧酸鹽納米顆粒能導致線粒體膜電位下降并激活Parkin通路，誘導線粒體自噬。本研究結果 也顯示，CdTe QD作用24 h造成PINK1和DRP1蛋白水平顯著升高，表明CdTe QD能誘導線粒體促分裂狀態的發生，并啟動線粒體自噬。而自噬標志性蛋白LC3和Beclin1表達的增加，則進一步標志著下游自噬激活和受損斷裂線粒體的清除。上述結果 提示，QD和其他納米材料可能誘發線粒體自噬，后者可能是納米材料誘導細胞應激調控的一種新機制。而線粒體自噬的激活對納米材料造成的細胞損傷是否具有抑制作用還需進一步研究和驗證。

綜上，本研究發現，CdTe QD可顯著抑制HUVEC細胞存活，并誘導細胞線粒體斷裂和線粒體膜電位下降；還可激活細胞內線粒體自噬相關蛋白表達，受損斷裂的線粒體可能通過線粒體自噬作用被清除。

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CdTe quantum dot inhibits cell survival and induces mitochondrial dysfunction in primary human umbilical vein endothelial cells

YAN Ming1,ZHANG Yun2,LIU Ke-zhou1,SUN Yong-hong3
(1.Department of Biomedical Engineering,College of Life Information Science and Instrument Engineering,Hangzhou Dianzi University,Hangzhou 310018,China;2.College of Medicine, Shaoxing University,Shaoxing 312000,China;3.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Cardio-c erebral Vascular Detection Technology and Medical Effectiveness Appraisal, Department of Biomedical Engineering,College of Biomedical Engineering and Instrument Science,Zhejiang University,Hangzhou 310027,China)

OBJECTlVETo elucidate the toxicological properties of CdTe quantum dots(CdTe QD)by investigating their effect on mitophagy in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).METHODSThe purity of primarily cultured HUVECs was detected by immunofluorescence.Then, HUVECs were incubated with CdTe QD 0.1-100 mg·L-1for 24 h.After treatment,the cell viability of HUVECs was detected with MTT assay.The mitochondrial morphology was observed under a laser scanning confocal microscope after labeling with Mitotracker.The treated HUVECs were also labeled with JC-1 probe,and the mitochondrial membrane potential(MMP)was then examined by flow cytometry. The expression of mitophagy-related proteins including microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅰ/Ⅱ(LC3Ⅰ/Ⅱ),moesin-like BCL2-induced protein1(Beclin1),phosphatase and tensin(PTEN)homologinduced putative kinase 1(PINK1)and dynamin-related proteinⅠ(DRP1)was determined by Western blotting.RESULTSMore than 95%of the cultured cells expressed vascular endothelial cadherin and herein were vascular endothelial cells.The MTT result showed that the cell survival of HUVECs was significantly decreased after incubation with CdTe QD(0.1-100 mg·L-1)for 24 h(P＜0.05,P＜0.01).CdTe QD also induced extensive fragmentation of the mitochondrial network.The results of JC-1 assay showed that CdTe QD(0.1-100 mg·L-1)caused the disruption of MMP.The percentage of HUVECs with higher MMP was reduced from(91.8±0.6)%in cell control group to(90.2±1.1)%,(84.4±0.9)%(P＜0.05)and(78.1± 1.3)%(P＜0.01),respectively.The Western blotting data suggested that CdTe QD 10 mg·L-1significantly increased the expression of autophagy-related protein beclin 1 and the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(P＜0.05, P＜0.01),CdTe QD 1 mg·L-1also raised the level of mitophagy-related proteins like PINK1 and DRP1.CONCULSlONCdTe QD can induce mitochondrial dysfunction as well as mitophagy in HUVECs.

CdTe quantum dots;human umbilical vein endothelial cells;mitochondria;autophagy; mitophagy

The project supported by National Natural Science Foundation of China(31401008);Zhejiang Provincial Natural Science Foundation(LY15H180012);Zhejiang Provincial Natural Science Foundation(LY17H060007); Zhejiang Provincial Natural Science Foundation(LY14C100004);and Key Social Development Project of Major Scientific and Technological Special Projects in Zhejiang Province(2014C03017)

YAN Ming,E-mail:yanming@hdu.edu.cn,Tel:(0571)86878667

R995

A

1000-3002-（2017）06-0574-07

2016-12-21接受日期：2017-01-24）

（本文編輯：喬虹）

國家自然科學基金（31401008）；浙江省自然科學基金（LY15H180012）；浙江省自然科學基金（LY17H060007）；浙江省自然科學基金（LY14C100004）；浙江省重大科技專項重點社會發展項目（2014C03017）

嚴明，女，博士，講師，主要從事生物制造和微納米材料生物相容性研究。

嚴明，E-mail：yanming@hdu.eud.cn，Tel：（0571）86878667