激活素受體樣激酶4，5和7抑制劑體外高通量篩選模型的構建

龍?。?，李菲菲，3＊，劉洪英，王莉莉

（1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京100850；2.抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京100850；3.北京師范大學生命科學學院，北京100875）

激活素受體樣激酶4，5和7抑制劑體外高通量篩選模型的構建

龍隆1，2＊，李菲菲1，2，3＊，劉洪英1，2，王莉莉1，2

（1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京100850；2.抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京100850；3.北京師范大學生命科學學院，北京100875）

目的 構建適于高通量篩選的激活素受體樣激酶4（ALK4），ALK5和ALK7抑制劑的篩選模型。方法利用Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達系統，構建ALK4激酶結構域（ALK4kd），ALK5kd和ALK7kd及Smad2和Smad3蛋白的病毒表達系統，轉染Sf9昆蟲細胞，表達目的蛋白；通過谷胱甘肽S-轉移酶（GST）親和柱純化，獲得純化的目的蛋白；分別以純化的ALK4，ALK5，ALK7激酶片段與純化的Smad3和ATP構建ALK4，ALK5，ALK7激酶活性測定體系，優化各反應底物濃度及反應條件，建立適于通量化分析的篩選模型；以已知ALK激酶抑制劑SB431542為工具分子，檢測其對激酶的抑制活性，確證篩選模型的可靠性。結果 經酶切和PCR鑒定，所得重組Bacmid均正確。轉染Sf9昆蟲細胞后純化獲得相應目的蛋白。經條件優化，反應體系中激酶和底物蛋白Smad3最佳濃度均為10 mg·L-1，ATP最佳初始濃度為10 nmol·L-1。所得ALK4，ALK5和ALK7激酶抑制劑篩選體系的Z′因子分別為0.71，0.51和0.74，符合高通量篩選要求。已知SB431542在所建模型上對ALK4kd，ALK5kd和ALK7kd的抑制活性IC50值分別為22，188和91 nmol·L-1。結論成功構建了ALK4，ALK5和ALK7激酶抑制劑的體外篩選模型。

激活素受體樣激酶；Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達系統；高通量篩選分析；Smad3蛋白

轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一類廣泛分布在多種生物的多種組織中的細胞生長因子，在從蠕蟲到哺乳動物的多種組織細胞中均有發現。該信號通路是一個復雜的超家族，配體包括TGF-β、激活素（activin）、抑制素（inhibin）、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和苗勒抑制物質（mullerian-inhibiting substance，MIP）等；受體有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種，其中Ⅰ型受體共7個，分別為激活素受體樣激酶1～7（activin receptor-like kinase 1～7，ALK 1～ALK 7）［1］；胞內信號至少由8種Smad蛋白介導［2］。配體結合受體后誘導Ⅱ型受體自身磷酸化并磷酸化Ⅰ型受體，活化的Ⅰ型受體再磷酸化下游的轉錄調節因子Smad信號蛋白，調節下游相應基因的表達。該復雜的信號通路在細胞的生長分化、組織器官的發育，以及損傷修復等眾多生物學過程中發揮作用［3］，其中Ⅰ型受體是決定細胞內信號特異性的關鍵分子。

TGF-β信號通路的異常與多種器官如腎、肝和心等的慢性進展性纖維化病變相關。研發該信號通路的抑制劑，特別是Ⅰ型受體ALK選擇性絲/蘇氨酸磷酸酶抑制劑，對于治療和緩解相應病癥具有重要意義［4-7］。然而，該通路抑制劑的現有篩選和評價方法有限。常用方法包括熒光素酶報告基因法檢測該通路下游轉錄因子Smad蛋白的功能開放程度［8］，以此反映該通路的激活程度?；虿捎肳estern蛋白印跡法定量磷酸化底物的量，或通過檢測細胞中［32P］標記ATP的方法，反映酶活性［8-9］。這些方法因為步驟繁瑣，通量低，不適用于化合物的大量篩選，且無法區分化合物對不同亞型受體的選擇性。

基于以上現狀，本研究分別構建了Ⅰ型受體ALK4，ALK5和ALK7激酶活性抑制劑的體外篩選平臺。首先分別構建ALK4激酶結構域（ALK4 kinase domain，ALK4kd），ALK5kd和ALK7kd，以及底物蛋白Smad2和Smad3的昆蟲表達系統，表達并純化獲得相應的目的蛋白，并以此構建適用高通量快速篩選的ALK4和ALK5和ALK7激酶抑制劑篩選模型。ALK4kd，ALK5kd和ALK7kd分別截取表達ALK4蛋白的207～498 aa，ALK5蛋白的209～496 aa以及ALK7蛋白的195～486 aa。ALK4kd，ALK5kd和ALK7kd能夠利用ATP，將底物蛋白Smad2/3磷酸化激活，在一定范圍內，含有等量酶、底物蛋白和ATP的反應體系在反應相同時間后，體系中剩余的ATP量與酶的活性成反比關系?？梢酝ㄟ^Promega的ATP定量試劑盒，采用化學發光儀，檢測相對光單位（relative light unit，RLU），確定體系中剩余ATP的量，以此反映酶的活性。

1 材料與方法

1.1 試劑

所有限制性內切酶、連接酶、普通Taq酶、高保真Taq酶及相關試劑均購于大連寶生物公司；普通質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于Omega公司（美國）；Grace培養基購自Gibco公司（美國）；蛋白純化GST柱購于Pierce公司（美國）；ATP檢測試劑盒和熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司（美國）；化學發光專用96孔板購自PE公司（美國）。

三抗藍白斑篩選平板：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%瓊脂，DDW配置，高壓滅菌后，冷卻至60℃左右，補加慶大霉素7 mg·L-1，四環素10 mg·L-1，卡那霉素50 mg·L-1，IPTG 50 mg·L-1及X-gal 100 mg·L-1，混勻后快速倒入10 cm無菌培養板中，每板15 mL，冷卻后，密封，4℃備用。

SOC培養基（μmol·L-1）：NaCl 10，KCl 2.5，MgCl210，MgSO410，葡萄糖20；2%tryptone胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，pH 7.0，0.22 μm濾膜過濾除菌。

Bacmid提取溶液Ⅰ（μmol·L-1）：Tris-Cl 15，EDTA 10，RNA酶A 100 mg·L-1，pH 8.0，0.22 μm濾膜過濾除菌。Bacmid提取溶液Ⅱ：NaOH 0.2 mol·L-1，1% SDS，0.22 μm濾膜過濾除菌。Bacmid提取溶液Ⅲ：乙酸鉀3 mol·L-1，pH 5.5，0.22 μm濾膜過濾除菌。PBS裂解液（μmol·L-1）：含DTT 10，PMSF 1，亮抑酶肽1 mg·L-1，抑肽酶1 mg·L-1，DNA聚合酶Ⅰ5 mU·L-1，RNA酶A 10 mg·L-1的PBS。蛋白純化洗脫液（μmol·L-1）：Tris-Cl 50，NaCl 1×105，DTT 25，pH 8.5。酶促反應緩沖液（μmol·L-1）：Tris-醋酸50，MgCl210，二甲苯青5 mg·L-1，pH 7.75，高壓滅菌備用。酶稀釋液（μmol·L-1）：Tris-Cl 50，NaCl 1×105，DTT 25，GSH 20，pH 8.5。EGFP-Smad2實驗緩沖液：F12培養基，補充0.1%BSA，HEPES 10 μmol·L-1。

1.2 菌株和細胞

感受態DH5α購自大連寶生物公司。Bac to Bac昆蟲表達系統購自Invitrogen（美國），其中DH10Bac感受態大腸桿菌培養于含四環素10 mg·L-1，卡那霉素50 mg·L-1的LB液體培養基中。昆蟲Sf9細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，培養于含10%FBS的Grace培養液中，培養條件27～28℃，空氣介質，無需補充CO2。

1.3 引物設計與合成

該課題所用引物均由北京三博遠志生物技術公司合成。所用引物序列如表1。

1.4 重組Bacmid的構建及驗證

質粒構建過程以ALK4為例進行介紹，其余蛋白步驟相同。利用ALK4全長上下游引物，從人cDNA文庫中調取ALK4全長序列。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離和回收后，經T4連接酶連接到T載體pGEM-5ZF（+）上，獲得PGEM-5ZF（+）-ALK4重組質粒。再用ALK4kd上下游引物從上述重組質粒中調取ALK4kd片段，PCR擴增產物經T4連接酶連接到T載體pMD18-T上，獲得pMD18-T-ALK4kd重組質粒。將所得質粒擴增，用Pst I+Bam H I雙酶切后切膠回收880 bp片段，獲得帶粘性末端的ALK4kd目的片段。將切膠回收的ALK4kd目的片段和線性化帶粘性末端的pFast-Bac1-谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）通過T4連接酶連接成重組質粒pFastBac1-GST-ALK4kd。以上所得各質粒均經過酶切鑒定、PCR鑒定和測序鑒定。

將pFastBac1-GST-ALK4kd質粒轉化DH10Bac感受態菌株，具體步驟如下：DH10Bac感受態菌液100 μL置于1.5 mL離心管中，加入100 μg·L-1的重組pFastBac1-GST-ALK4kd質粒0.5 μL，輕彈混勻，冰浴30 min后，42℃水浴45 s，立即冰浴2 min。其中加入900 μL SOC培養基，37℃250 r·min-1搖菌4 h，用SOC培養基按1∶10000將菌液稀釋后，取100 μL稀釋菌液涂布三抗藍白斑篩選平板，37℃倒置培養48 h，選10個白斑克隆分別在三抗藍白斑篩選平板上劃線擴增，37℃倒置培養24 h，選全為白斑平板上的菌作為陽性克隆。選3個陽性克隆，以ALK4kd上下游引物或GST序列上正向引物與ALK4kd下游反向引物的組合進行菌落PCR驗證。

陽性克隆按照以下步驟提取重組Bacmid：陽性菌接種于2 mL含三抗的LB液體培養基中，37℃250 r·min-1搖晃培養24 h。取1.5 mL菌液室溫12 000×g離心1 min，棄上清收集菌體。加入0.3 mL溶液I，重懸菌體。加入0.3 mL溶液Ⅱ，顛倒混勻8～10次，室溫靜置10 min。慢慢加入0.3 mL溶液Ⅲ，輕輕混勻，冰浴10 min后，4℃12 000×g離心10 min。取上清于新離心管中，加入等體積（約0.8 mL）異丙醇，顛倒混勻8～10次，冰浴10 min后，4℃12 000×g離心10 min，棄上清。管中加入0.8 mL 70%乙醇洗1次，4℃12 000×g離心5 min，棄上清。重復上步操作，棄上清后，離心管及底部DNA沉淀室溫干燥10 min。用40 μL滅菌雙蒸水溶解DNA，4℃備用。

1.5 包裝病毒的生產

配制轉染混合物：每孔30 μL重組Bacmid（1 μg），加入95 μL Grace培養液，混勻成混合液Ⅰ，每孔6 μL CellFECTIN試劑加入到每孔94 μL Grace培養液混勻后成混合液Ⅱ，將混合液Ⅰ和Ⅱ混勻后，室溫靜置45 min，每孔加入0.8 mL Grace培養液，配制成轉染混合物。培養于6孔板中的昆蟲Sf9細胞在豐度80%～90%時換Grace培養液脫血清，1 h后棄培養液，每孔加入1 mL上述轉染混合物，27～28℃孵育5 h。棄去轉染混合物，加入含10%FBS的新鮮Grace培養液，27～28℃，空氣條件培養。3～4 d后吸取細胞培養液上清，500×g離心取上清為P1病毒，4℃保存6個月內使用或補加2%FBS，-70℃長期凍存。

培養于T25細胞培養瓶中的昆蟲Sf9細胞在豐度70%～90%時，每瓶接種50 μL P1病毒，病毒吸附1 h后換含10%FBS的新鮮Grace培養液，感染3～4 d后收集P2病毒上清，4℃保存6個月內使用或補加2%FBS，-70℃長期凍存。

1.6 目的蛋白表達及純化

昆蟲Sf9種于6孔板中，至細胞豐度80%～90%時每孔接種50 μL P2病毒，吸附1 h后換含10% FBS的新鮮Grace培養液，培養1，2，3，4和5 d等不同的時間長度，裂解細胞后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白條帶，考馬斯亮藍染色后，判斷目的蛋白的表達情況。

Tab.1 Sequence of primers

昆蟲Sf9細胞按上述步驟感染P2病毒后，培養至目的蛋白表達最豐（據條件優化，GST、ALK4kd和Smad3約72 h，ALK5kd約84 h，ALK7kd約60 h，Smad2約96 h）時，用預冷PBS吹下細胞，PBS洗2次后離心收集細胞沉淀，細胞量控制在每個樣品約1×107個。用1 mL預冷PBS裂解液重懸細胞，冰水浴下超聲破碎10 s停30 s，重復5次破碎細胞。4℃12 000×g離心2 min，取上清加入到100 μL充分混懸的50%固定化還原型谷胱甘肽膠混合液（Thermo PIERCE）中，室溫混勻10 min。1200×g離心2 min，棄上清。用0.5 mL PBS重懸膠，將膠加入到柱托架中，10 000×g離心2 min，形成柱芯。向柱芯中加入0.5 mL PBS孵育5 min，室溫10 000×g離心2 min洗柱芯，重復洗柱芯3次，注意在每次離心后收集濾過液并更換新的收集管。向柱芯中加入100 μL洗脫液，室溫孵育5 min，室溫10 000×g離心2 min，重復洗脫4次，分別收集洗脫液獲得純化目的蛋白。SDS-PAGE電泳鑒定濾過液和洗脫液，并定量洗脫液中目的蛋白濃度。柱芯可用NaCl 5 mol·L-1充分沖洗再生并用PBS沖洗平衡，置于100 μL PBS中4℃保存，可再次用于相同目的蛋白的純化。用于蛋白表達的驗證和表達條件優化。

1.7 ATP標準曲線的生成

ATP檢測采用化學發光儀Microlumat Plus LB96V Luminometer（Berthold Technologies，德國）進行。以酶反應緩沖液為體系，配制梯度濃度的ATP（終濃度分別為0.01，0.1，1，10和100 nmol·L-1），各取50 μL，加入到化學發光專用96孔板中。采用化學發光儀加樣臂，向每個反應體系中加入50 μL的rL/L顯色液（Cat No.FF2000，Promega），2 s后開始讀數，累積讀10 s。逐孔加樣、讀數。以不加ATP的酶反應緩沖液加入rL/L顯色液后的讀數作為背景RLU讀數，從反應體系的RLU讀數中扣除。

1.8 反應條件優化

ALK4kd，ALK5kd和ALK7kd的活性表現為利用ATP將Smad蛋白磷酸化成pSmad。建立包含ALK、Smad3底物蛋白和ATP的反應體系，體系中Smad3蛋白中濃度固定為10 mg·L-1，確保足夠的底物量。分別對體系中激酶量、ATP量進行優化，激酶設0.1，0.3，1，3和10 mg·L-1濃度梯度，設ATP 2和10 nmol·L-1。以酶稀釋緩沖液替代酶，配制反應體系，作為陰性對照；以無ATP水替代ATP，配制反應體系，作為陽性對照。反應總體積200 μL， 30℃孵育3 h后，取50 μL反應體系于化學發光專用96孔板中，采用化學發光儀加樣臂，向每個反應體系中加入50 μL的rL/L顯色液，2 s后開始讀數，累積讀數10 s。逐孔加樣，逐孔讀數。以陰性對照的RLU值為0%ATP利用率，以陽性對照RLU值為100%ATP利用率，計算各樣品組的ATP利用率。

1.9 篩選模型建立

酶促反應緩沖液中加入終濃度為10 mg·L-1的激酶，0.01，0.03，0.1，0.3，1和23 μmol·L-1的陽性化合物SB431542，37℃反應30 min后，補加終濃度10 mg·L-1Smad3蛋白和終濃度10 nmol·L-1的ATP。以酶稀釋緩沖液代替酶，DMSO代替化合物，形成包含DMSO（藥物溶媒）、Smad3蛋白和ATP的反應體系為陽性對照，即ATP不被利用，酶活性100%被抑制；以DMSO代替化合物，形成包含酶、DMSO（藥物溶媒）、Smad3蛋白和ATP的反應體系作為陰性對照，即酶活性完全不被抑制。反應體系總體積200 μL，30℃孵育3 h，反應結束后，取50 μL反應體系于化學發光專用96孔板中，采用化學發光儀加樣臂，向每個反應體系中加入50 μL rL·L-1顯色液，2 s后開始讀數，累積讀數10 s，對反應體系中剩余ATP進行定量分析，逐孔加樣，逐孔讀數。

1.10 統計學分析

實驗結果 數據表示為x±s，采用Excel軟件進行數據處理。采用Graphpad 5.0軟件繪制柱狀圖和濃度依賴曲線。使用One-way ANOVA進行數據分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組Bacmid的構建和驗證結果

將人ALK4基因通過T4連接酶插入到T載體pGEM-5ZF（+）中后，得到pGEM-5ZF（+）-ALK4重組質粒（圖1A1）。轉化感受態DH5α大腸桿菌，并擴增重組質粒。將所得質粒分別進行BgⅢ+SpeⅠ雙酶切，SacⅠ單酶切和pvuⅡ單酶切鑒定，結果 均正確（圖1A2）。同時，對重組質粒進行測序鑒定，結果 正確。重組質粒PGEM-5ZF（+）-ALK4構建成功。

用ALK4kd上下游引物擴增得到目的片段，并通過T4連接酶連接到T載體pMD18-T上，得到重組質粒pMD18-T-ALK4kd（圖1B1）。所得質粒采用ALK4kd上下游引物進行PCR擴增鑒定，結果 得到880 bp的ALK4kd片段，如圖2B2所示，表明pMD18-T-ALK4kd重組質粒構建成功。

用PstⅠ和Bam HⅠ酶從pMD18-T-ALK4kd質粒上切得帶黏性末端的ALK4kd片段，與帶相同黏性末端的pFastBac1-GST質粒連接，生成目的質粒pFastBac1-GST-ALK4kd（圖2A），并轉化DH5α大腸桿菌。采用GST上游引物、ALK4kd下游引物對陽性菌落進行PCR驗證，結果 得到1400 bp的目的片段，與預期結果 一致（圖2B）。對陽性質粒進行PstⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，得到5377和889 bp的條帶，與預期結果 一致（圖2C）。此外，還將所得質粒進行測序鑒定，結果 表明，pFastBac1-GSTALK4kd質粒構建成功。

Fig.1 Construction of pGEM-5ZF（+）-ALK4 and pMD18-T-ALK4kd.A1：plasmid pGEM-5ZF（+）-ALK4.A2：identification of pGEM-5ZF（+）-ALK4 by restriction enzyme digestion.Lane 1：BgⅢ+SpeⅠ；lane 2：SacⅠ；lane 3：PvuⅡ；lane 4：marker.B1：plasmid pMD18-T-ALK4kd.B2：PCR identification of pMD18-T-ALK4kd，ALK4kdforward and reverse primers were used in PCR amplification.Lane 1：plasmid；lane 2：marker.

Fig.2Construction of pFastBac1-GST-ALK4kd.A：plasmid pFastBac1-GST-ALK4kd.B：bacterial colony PCR identification of the plasmid using GST forward primer and ALK4kd reverse primer.Lane 1：marker；lane 2：PCR procluct.C：plasmid identification byPstⅠandBamHⅠdouble digestion.Lane 1：marker；lane 2：plasmid.

將所得pFastBac1-GST-ALK4kd質粒擴增后，轉化Bac to Bac系統的DH10Bac感受態菌株。pFastBac1-GST-ALK4kd質粒中包含慶大霉素抗性序列、多角體蛋白啟動序列PH、和目的蛋白序列GST-ALK4kd的Tn7轉座子。轉座子在轉座酶的協助下，轉座到DH10Bac中Bacmid上的相應位點上，形成新的Bacmid-GST-ALK4kd重組Bacmid。發生正確重組的DH10Bac菌株具有慶大霉素、卡那霉素和四環素三重抗性，且半乳糖苷酶LacZ的表達序列被破壞。因此，可通過含以上3種抗性的藍白斑篩選平板對發生重組的克隆進行篩選。所得陽性克隆采用ALK4kd正反向引物進行PCR驗證，結果 如圖3A所示，可得到880 bp的目的片段。同時，采用GST序列上正向引物和ALK4kd反向引物進行PCR驗證，也成功的獲得了1100 bp的目的片段（圖3B），表明重組Bacmid構建成功。

Fig.3Identification of three positive clones usingALK4kdforward and reverse primer（A）and GST intra forward primer andALK4kdreverse primer（B）by PCR.Lane 1，2 and 3 represent three different positive clones.

2.2 重組Bacmid的包裝和鑒定

除ALK4kd的真核表達Bacmid外，還構建了ALK5kd和ALK7kd以及TGF-β下游分子Smad2和Smad3的真核表達Bacmid，構建和驗證方法同ALK4kd。將此5個Bacmid分別感染Sf9細胞。如圖4A所示，感染病毒3 d后，Sf9細胞的密度與正常細胞相比無顯著改變，表明細胞的生長速度不受病毒感染的影響。然而，細胞在感染病毒后發生了細胞膨大、起泡、顆粒物質形成和貼壁不緊密等形態改變，與已有報道一致［10］。

病毒感染Sf9細胞后，用各目的片段的上下游引物對細胞裂解液進行PCR驗證，結果 如圖4B所示，感染ALK4kd,ALK5kd和ALK7kd重組Bacmid包裝病毒的Sf9細胞裂解液中特異性地存在PCR產物。同樣，感染Smad2重組Bacmid包裝病毒的Sf9細胞裂解液，分別用Smad2全長正反向引物或GST序列上的正向引物和Smad2全長反向引物進行PCR，可得到預期的1400 bp和1600 bp片段（圖4C）；感染Smad3重組Bacmid包裝病毒的Sf9細胞裂解液，以Smad3全長正反向引物進行PCR，可得到1100 bp的目的片段（圖4D）。結果 表明，各表達Bacmid對Sf9細胞的感染均能成功將目的片段引入細胞中。

2.3 目的蛋白的表達和純化

分別收集感染病毒1，2，3，4和5 d的細胞裂解液，進行SDS-PAGE凝膠電泳，判斷目的蛋白的表達情況。結果 表明，GST，GST-ALK4kd和GSTSmad3蛋白在感染72 h后蛋白表達豐度達到最大，而GST-ALK5kd,GST-ALK7kd和GST-Smad2分別在感染后84，60和96 h達到最大表達豐度。如圖5E所示（圖中細胞均為最優蛋白表達豐度條件下收集），箭頭所示條帶即為目的蛋白條帶，是細胞中豐度最高的蛋白。用GST一抗進行免疫印跡檢測，識別各跑道中的目的條帶，結果 如圖4F所示，目的蛋白條帶的相對位置與圖4E中一致。如圖4G所示，每個跑道上均含單一蛋白條帶，表明純化過程中蛋白純度合格。以濃度為0.1 g·L-1牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）為內參，對目的蛋白進行定量，結果 獲得目的蛋白濃度分別為GST 0.203 g·L-1，ALK4kd 0.022 g·L-1，ALK5kd 0.019 g·L-1，ALK7kd 0.022 g·L-1，Smad2 0.026 g·L-1和Smad3 0.024 g·L-1。

2.4 成功獲得活性蛋白并建立體外篩選模型

TGF-β結合細胞膜表面的Ⅱ型受體后，Ⅱ型受體結合并激活Ⅰ型受體，Ⅰ型受體的胞內激酶結構域通過消耗ATP，將底物蛋白Smad2/3磷酸化。被磷酸化的Smad2/3蛋白入核，介導下游基因的表達。利用ALK激酶消耗ATP將Smad2/3蛋白磷酸化這一特點，通過測定含ALK激酶結構域、Smad2/ 3蛋白、ATP的反應體系中ATP的剩余量，可反映體系中ALK的激酶活性。ATP的定量檢測采用Promega的ATP定量檢測試劑盒和化學發光檢測系統，檢測原理如圖5A所示，在有氧情況下，ATP促進D-熒光素的氧化反應，生成氧化熒光素、AMP、焦磷酸以及CO2的同時，生成560 nm光子，可通過檢測固定時間內散發的光子的量，反映體系中ATP的含量。首先，測定適用于該化學發光檢測系統的ATP線性范圍。如圖5B所示，當待測ATP濃度在10 nmol·L-1～0.1 mol·L-1之間時，ATP濃度與化學發光儀檢測到的RLU值成良好線性關系。

Fig.4 Expression and purification of target proteins.A：Sf9 cell morphology before and after virus infection.B：PCR identification of cell lysate after ALK4kd，ALK5kd and ALK7kd virus，forward and reverse primers for each fragment were used separately. Lanes 1，4，7：normal Sf9 cell；lanes 2，5，8：blank bacmid infected cells；lane 3：Bacmid-GST-ALK4kd infected cells；lane 6：Bacmid-GST-ALK5kd infected cells；lane 9：Bacmid-GST-ALK7kd infected cells.C：PCR identification of cell lysate after Bacmid-GST-Smad2 infection.Lane 1：Smad2 forward and reverse primer were used；lane 2：GST intra forward primer and Smad2 reverse primer were used.D：PCR identification of cell lysate after Bacmid-GST-Smad3 infection，Smad3 forward and reverse primers were used.Lane 1：normal cell；lane 2：blank bacmid infected cells；lane 3：Bacmid-GST-Smad3 infected cells.E：SDS-PAGE of different cell lysate，the arrow indicate the target protein band.Lane 1：normal Sf9 cell；lane 2：blank bacmid infected cells；lane 3：bacmid-GST infected cells；lane 4：bacmid-GST-ALK4kd infected cells；lane 5：bacmid-GST-ALK5kd infected cells；lane 6：bacmid-GST-ALK7kd infected cells；lane 7：bacmid-GST-Smad2 infected cells；lane 8：bacmid-GST-Smad3 infected cells.F：Western blotting of different cell lysate using anti-GST antibody.Loading sequence was identical to lane 3-8 in E.G：SDS-PAGE of purified proteins.Loading for lane 1-6 was identical to lanes 3-8 in E；lane 7：BSA.

Fig.5 Validation of constructed screening system.A：mechanism of the screening system；B：standard curve for ATP detection.

對反應體系中酶的終濃度和ATP的終濃度進行優化，當體系中ATP初始濃度為10 nmol·L-1時，ALK4，ALK5和ALK7激酶消耗ATP的能力均與蛋白量呈現良好的濃度依賴關系，而降低體系中初始ATP的濃度至2 nmol·L-1時，該濃度依賴關系消失。因此，選用體系初始ATP濃度為10 nmol·L-1。對反應體系中酶的最適濃度進行優化，當體系中ATP濃度固定為10 nmol·L-1，Smad3蛋白濃度為10 mg·L-1時，激酶消耗ATP的能力隨激酶濃度增加而梯度增加。當激酶濃度達最大，即10 mg·L-1時，3種激酶消耗ATP的比例分別為39%，34%和22%。為保證激酶抑制劑篩選時ATP消耗的窗口值，選擇最大激酶濃度10 mg·L-1為體系中的最終激酶濃度。

采用已知ALK4，5和7的共同抑制劑SB431542，驗證該體系的靈敏性。如圖6所示，SB431542濃度依賴性地抑制了ALK4kd，ALK5kd和ALK7kd的激酶活性，IC50值分別為22 nmol·L-1，188 nmol·L-1和91 nmol·L-1，與文獻報道一致［11］。該體外篩選模型建立成功。

Fig.6 SB431542 inhibits kinase activities of ALK4，ALK5 and ALK7 in a concentration-dependent manner.

如表2所示，得出ALK4，ALK5和ALK7篩選體系的平均Z’因子分別為0.71，0.51和0.74，均符合高通量篩選對體系穩健性的要求。

Tab.2 Z′factors of established screening assays

3 討論

利用真核表達所得的TGF-β信號通路受體激酶結構域ALK4kd，ALK5kd和ALK7kd及底物蛋白Smad2/3，本文成功構建了TGF-β信號通路受體ALK4，ALK5和ALK7激酶抑制劑的體外篩選模型。通過驗證表明，在該篩選模型中，陽性化合物SB431542對ALK4，ALK5和ALK7激酶活性的抑制IC50值分別為22，188和91 nmol·L-1。

該細胞外篩選系統能夠滿足高通量和快速篩選需求。昆蟲Sf9細胞為懸浮生長狀態，可實現液體搖晃培養。通過本課題發現，從1 L培養體積的Sf9細胞懸液中，可最終分離純化到至少1 mg目的蛋白。而按照每個反應體積200 μL，蛋白濃度10 mg·L-1計算，1 mg目的蛋白可完成約500個反應。在通量上與已有的熒光素酶報告基因法相當［8］，但顯著高于Western蛋白印跡法定量磷酸化底物的量，或通過檢測細胞中［32P］標記ATP的方法［8-9］。此外，該體外篩選模型體系組成相對簡單，僅由靶蛋白ALK，底物蛋白Smad、ATP以及藥物組成，相比基于細胞體系的Smad2-EGFP核轉位模型，篩選結果 更加專一和特異，目的性更強，并且能夠區分化合物對不同受體亞型的選擇性。該模型與細胞篩選模型結合使用，能夠準確而有效地篩選得到TGF-β信號通路抑制劑。

該篩選系統仍具有一定缺陷，即以ATP為檢出方式。該檢出方式容易因為環境中痕量ATP的污染，而造成檢測結果 失真。因此，在實驗全程中需嚴格使用一次性用品。并在每次實驗前，用50%的次氯酸鈉沖洗和浸泡化學發光儀的加樣管道和器皿1 h，浸泡后用無ATP的蒸餾水或去離子水充分漂洗10次，以除去體系中的細菌及痕量的ATP污染。

綜上，該篩選模型的篩選結果 真實、可靠，可用于高通量快速篩選TGF-β信號通路抑制劑，對促進該通路抑制劑的研發具有重要意義。

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Construction of in vitro high-throughput screening system for activin receptor-like kinases 4,5 and 7 inhibitors

LONG Long1,2＊,LI Fei-fei1,2,3＊,LIU Hong-ying1,2,WANG Li-li1,2
(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850, China;2.State Key laboratory of Antitoxic Drugs and Toxicology,Beijing 100850,China; 3.College of Life Sciences,Beijing Normal University,Beijing 100875,China)

OBJECTIVETo establish an in vitro screening system for activin receptor-like kinase 4, 5 and 7(ALK4,ALK5 and ALK7)inhibitors.METHODSThe insect expression systems for kinase domain of ALK4,5,7 and Smad2/3 proteins were established using the Bac to Bac baculovirus expression system.The desired proteins were expressed in Sf9 insect cells and purified by GST affinity.The screening system was composed of the kinase,Smad3 protein,ATP as well as the compound.The impact of the compound on the activities of ALK kinase domains was examined by measuring the amount of remnant ATP in the system as ALKs catalyzed the phosphorylation of Smad3 protein and consumed ATP during the process. The screening conditions were optimized,and validation of the screening system was conducted using known ALKs inhibitors.RESULTSAll the reconstructed Bacmids were identified to be correct by PCR and restriction enzyme digestion.All the proteins were expressed in Sf9 insect cells after transfection, and purified proteins were achieved by GST affinity purification.For the screening system,the optimized kinase concentration and Smad3 concentration were 10 mg·L-1and the optimized ATP concentration was 10 nmol·L-1.The Z′factor for ALK4,ALK5,and ALK7 kinase inhibitors screening system was 0.71,0.51 and 0.74,respectively.The well-known ALK inhibitor SB431542 inhibited the catalytic activities of ALK4,ALK5,and ALK7 with IC50values of 22,188 and 91 nmol·L-1,respectively.CONCLUSIONThe in vitro screening system for ALK4,ALK5 and ALK7 inhibitors is successfully established.

activin receptor-like kinase;Bac to Bac insect baculovirus expression system;highthroughput screening assays;Smad3 protein

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81430090);National Science and Technology Major Project of China(2009ZX09501031);and National Science and Technology Major Project of China (2012ZX09301003-003)

WANG Li-li,Email:wangll63@126.com,Tel:(010)88932674

R965.1

A

1000-3002-（2017）06-0581-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.013

2017-01-03接受日期：2017-05-09）

（本文編輯：喬虹）

國家自然科學基金（81430090）；國家科技重大專項（2009ZX09501031）；國家科技重大專項（2012ZX09301-003003）

龍隆，女，實驗師，主要從事藥物篩選工作；李菲菲，女，博士，主要從事藥物作用機制評價工作。

王莉莉，E-mail：wangll63@126.com，Tel：（010）88932674

＊共同第一作者。

＊Co-first author.