毒理學研究的高內涵篩選及其在藥物肝毒性研究中的應用

葛帥，湯納平，付立杰，馬璟

（中國醫藥工業研究總院國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203）

毒理學研究的高內涵篩選及其在藥物肝毒性研究中的應用

葛帥，湯納平，付立杰，馬璟

（中國醫藥工業研究總院國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203）

藥物性肝損傷（DILI）是導致藥物研發終止或從市場撤回的重要原因之一，建立可預測、高通量的臨床前檢測系統以評估臨床潛在的肝毒性是藥物研發的迫切需要?；诩毎上竦母邇群Y選（HCS）技術，允許同時檢測多個細胞參數，通過實時監測多種信號通路闡明細胞損傷的機制，具有高度的敏感性和特異性。目前已有多種肝細胞模型用于高內涵毒性篩選。本文介紹了HCS技術，回顧了近年來利用高內涵成像技術獲得的藥物肝毒性資料，探討了其在肝毒性機制探索中的應用，以及高內涵成像技術在DILI研究中的作用。

高內涵篩選；肝毒性；毒理學

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是一種常見的藥物不良反應，在藥物性靶器官毒性中排第二位，僅次于心臟毒性［1］。尤其是特異質DILI對一些患者的嚴重性和不可預測性，已成為制藥行業、監管機構以及臨床上面臨的主要挑戰［2］。DILI已被證實是一個由多種機制參與的復雜病理過程［3］，傳統的細胞毒性篩選依賴于對不同毒性指標的單終點測定，無法準確反映一個細胞群體的損傷或死亡狀況。而高內涵篩選（high-content screening，HCS）技術能夠定量和動態監測由藥物或其他化合物引起的細胞形態學、生化指標和細胞功能的改變，實現了對單細胞群的多參數和多靶點分析。本文整合了近年來利用HCS技術獲得的藥物肝毒性資料及其在肝毒性機制探索中的應用，以探討HCS技術在早期肝毒性篩選中的應用前景。

1 高內涵篩選技術的原理

1.1 高內涵篩選技術概述

HCS技術是一種結合自動化熒光顯微鏡的細胞定量成像分析系統。它可以在保持細胞結構和功能完整的前提下，檢測藥物或化合物對細胞的作用，確定藥物或化合物的生物活性或潛在毒性。其基本工作流程是：化合物處理后的細胞與指示不同細胞毒性參數的多種熒光探針混合物孵育，通過自動化熒光顯微鏡多通道波長照射細胞成像，由成像技術捕獲圖像信息后，經專業的圖像處理軟件在單個細胞水平對大量的細胞及相關靶點進行識別和運算，最后由數據管理軟件統計分析得到相應的生物學特性的數據（圖1）。與單細胞毒性試驗檢測藥物的毒性相比，這種多參數檢測策略為提高檢測輕微毒性的敏感度提供了可能性［4-5］，進而可大大減少細胞、試劑和待測化合物的用量。同時，多通道復合檢測結果 可以通過軟件計算出在同一細胞中不同參數值之間的關系，有助于更好地解釋由細胞處理引起的潛在改變［6］。

1.2 高內涵篩選系統的組成

高內涵檢測儀是實現HCS的必備儀器，一般由自動化熒光圖像獲取系統、圖像分析系統和數據管理系統組成，有的還配備自動加樣器和環境控制系統，實現多孔板自動加樣以及維持細胞檢測時正常的生存環境。

HCS區別于普通熒光顯微鏡的最大特點是其圖像獲取系統的全自動化和高速化。成像系統通常包括連續光源帶、多通道激發和發射濾光片、顯微鏡模塊和高速高分辨率圖像傳感器。新型顯微鏡成像技術的發展大大提高了獲取圖像的速度、質量和靈活度，如全自動水浸物鏡浸液掃描的應用大大提高了圖像分辨率；與傳統共聚焦技術固定針孔相比，高速轉盤和可變針孔自動對焦，短時間內精確掃描多通道的熒光信號；大芯片電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機的成像視野約是標準芯片相機的4倍，能夠更細致地獲取細胞微觀結構。

對于真正的HCS高通量實驗，需要評估成千上萬個圖像，單純依靠手動評分變得不可行，這對圖像的自動化處理提出了很高的要求。圖像和數據分析的主要步驟包括：圖像處理、象分割、特征提取和選擇以及統計分析。在圖像采集之后，首先需要通過濾波器消除噪聲，對圖像進行背景校正；接下來通過相應的算法對細胞進行分割并定義顯微鏡圖像中感興趣的區域，提取如細胞核與細胞面積比等定量特征；不是所有提取的特征都適用于要解決的生物學問題，需要研究人員根據給定的生物學問題選擇特征子集用于后續分析；最后通過數據挖掘模塊，可視化和量化所檢測的參數，并對其進行統計比較，將每個細胞的大量測量結果 轉化為生物學上有意義的結果 。

另外，HCS產生的信息豐富，越來越復雜的圖像分析算法會產生TB級容量的圖像數據，為此開發的數據管理系統應運而生，如科學圖像數據庫（the Scientific Image DataBase）和開放顯微鏡檢查環境（the Open Microscopy Environment）等高內涵數據管理平臺的應用［7-8］，在數據分析過程中可以方便地注釋、建檔、檢索及存儲高內涵圖像和數據。

圖1 高內涵篩選工作流程

2 高內涵篩選技術在藥物性肝損傷篩選中的應用

HCS現已成為公認的藥物研發早期毒性篩選的有力工具。不同的多探針HCS檢測技術已用于藥物肝毒性分類及候選化合物優先開發分級。

Tolosa等［5］采用HepG2細胞通過HCS技術確定78種化合物的肝毒性類型。待測化合物處理后的細胞裝載細胞核指示劑Hoechst33342、細胞核指示劑碘化丙啶（propidium iodide，PI）、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）指示劑四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）、脂肪指示劑氟硼二吡咯（BODIPY）665/676和鈣離子指示劑氟-4乙烯氧甲酯（fluo-4 acetoxymethyl ester，Fluo-4 AM），利用Scan和In Cell Analyzer系統聯合獲取細胞圖像，Scan分析模塊對細胞圖像分析，最終可分別通過不同肝毒性作用機制和肝損傷程度2種方式對78種化合物分類，所得結果 有很高的敏感性（MMP、氧化應激、細胞內鈣離子濃度和核型變化的敏感性分別為83%，97%，100%和63%）。

Persson等［9］開發了一種“四探針法”HCS檢測用于新藥開發早期候選化合物的DILI風險評估。該實驗選取臨床已知肝毒性譜的100種藥物進行驗證，將這些藥物分為嚴重、中度和無肝毒性3個級別，分別與HepG2細胞孵育后加入4種混合熒光探針，檢測細胞毒作用相關的6個參數：核數、核面積、質膜完整性、溶酶體活性、MMP和線粒體面積。實驗結果 發現，當藥物濃度＜100倍人體最大血漿藥物濃度時，若細胞≥2個參數表示毒性效應，通常該藥物具有肝毒性；若細胞＜2個參數表示毒性效應，一般為非肝毒性藥物。綜合6個參數檢測結果 并進行分層聚類分析，證明該方法能夠在實驗濃度范圍內準確鑒別肝細胞毒性藥物（肝毒性導致撤市藥物、嚴重或中度肝毒性藥物）和非肝毒性藥物，而且可以實現有效預測先導化合物或候選藥物是否具有誘導肝毒性的傾向，為新藥標準化預測肝細胞毒性提供了整體視角。

3 高內涵篩選技術在藥物性肝損傷機制研究中的應用

3.1 線粒體損傷

線粒體在細胞存活中扮演著整合各種細胞信號通路與維持細胞代謝的關鍵角色，其結構和功能的損傷是造成DILI的常見機制。線粒體損傷會造成各種有害結果 ，如氧化應激、ATP耗竭、脂肪變性和細胞死亡。這些結果 進而造成DILI不同的臨床表現，從臨床無癥狀的血清生化指標輕度改變到嚴重的毒性反應包括脂肪性肝炎、肝硬變和肝衰竭［10］?？紤]到線粒體毒性的嚴重后果，越來越多的研究者推薦將線粒體毒性效應納入新藥毒理學的研究體系。

通常，線粒體結構異常、電子傳遞鏈紊亂以及MMP改變會同步發生，在單細胞水平對線粒體相關的多個參數同步檢測有助于更好地了解它們之間的相互作用［11］，而采用HCS技術研究線粒體實現了其多參數實時同步定量監測。除了其他通用的HCS分析將MMP作為研究DILI相關的主要機制，數個實驗室重點研究線粒體功能障礙。如Tolosa等［10］設計了基于HCS的多參數早期化合物篩選方法用于評估潛在的線粒體肝毒性藥物，采用多種熒光探針進行不同的組合實驗，利用HCS系統獲取細胞圖像并進行定量分析，篩選引起線粒體損傷的藥物，研究線粒體損傷誘因和凋亡誘因等。通過該方法闡述了一系列涉及他汀類藥物肝毒性的細胞機制，證實他汀類藥物可通過增加線粒體超氧化物、改變MMP及細胞質鈣離子濃度等機制誘導線粒體毒性，這在以往出版的文獻中少有報道。該方法對于特異性的靶向線粒體損傷檢測有很高的敏感性。Kim等［12］采用HCS系統實時監測HepG2細胞成像，通過相應的熒光探針試劑盒檢測細胞內鈣離子濃度、線粒體滲透性轉變、胱天蛋白酶3活性等細胞參數，發現奈法唑酮、托卡朋和曲格列酮通過線粒體損傷介導肝細胞毒性；而通過胱天蛋白酶8抑制測驗表明，吡羅昔康是通過非線粒體途徑造成肝細胞損傷。由此可見，采用HCS技術檢測線粒體毒性有望成為體外藥物測試和安全性評價的領先策略。

3.2 膽汁淤積

藥物引起的膽汁淤積性肝損傷大致可分為急性和慢性2種，表現為肝內膽汁淤積和膽小管擴張，經常伴有膽栓，嚴重的可導致膽管消失綜合征，并最終可能導致纖維化和肝硬變［13］。膽鹽從肝細胞輸出主要依賴于原發性主動外排轉運蛋白的參與，如膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、多藥耐藥相關蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）。BSEP基因突變與肝膽汁淤積癥有關，藥物往往通過抑制BSEP和MRP2導致膽汁淤積性肝損傷［14］。

因嚙齒類動物與人的膽囊組成上的差異，導致其對膽汁淤積性肝損傷不明顯。這使得體外藥物致膽汁淤積評價實驗變得更有價值［14-15］。目前常用的體外模型為轉運蛋白過表達的囊泡系統或結合細胞成像技術的三維結構的肝細胞。采用夾層膠原“三明治”結構培養的肝細胞在體外可形成組織樣結構的小管，形態上與體外肝切片非常相似，更接近體內的情況［15］。而借助HCS系統可實時定量分析膽鹽轉運至組織樣小管的過程。

Xu等［16］在肝細胞成像分析技術的基礎上開發了膽汁流量成像分析技術，采用膽鹽類似物膽酰賴氨酰熒光素（cholyl-lysyl-fluorescein，CLF）作為熒光探針作用于三維結構的人原代肝細胞，通過HCS系統獲取細胞圖像后由相應的圖像分析軟件處理，可觀察到肝細胞形成的膽管結構，并能通過膽汁流量成像評價膽管轉運功能。隨后，Germano等［17］選用“三明治”結構培養的肝細胞，與待測化合物孵化14 d模仿慢性藥物治療，HCS技術檢測MRP2介導的膽管運輸、中性脂肪和磷脂積累等功能性終點。結果 表明，相比于脂肪肝和磷脂沉積預測，此研究系統更適于藥源性膽汁淤積癥的研究。最近報道了一種細胞膽管成像檢測法測定化合物對膽汁運輸的整體的抑制作用［18］，該方法采用CLF和羧甲基熒光素二乙酸酯（carboxy-methylfluorescein diacetate，CMFDA）分別作為BSEP和MRP2的底物，通過檢測CLF或CMFDA代謝物在小管的熒光強度確定藥物對轉運蛋白的抑制程度。結果 發現，肝細胞CLF積累的IC50值與人BSEP囊泡實驗的IC50值有很高的一致性。與此同時，研究者也對這2種熒光染料的特異性提出了質疑。這些研究表明，HCS技術是膽汁淤積肝損傷研究中有前景的藥物篩選工具。

3.3 脂肪變性

參與脂肪變性的主要機制是直接或間接抑制長鏈脂肪酸的β氧化。目前使用的許多藥物都能誘導脂肪變性，主要是肝細胞內甘油三酯過度積累。最近的研究表明，細胞暴露于能夠誘導肝脂肪變性的藥物，編碼脂質代謝關鍵蛋白的轉錄因子和基因的表達譜也發生了改變［19］。某些藥物引起的空泡脂肪變性，長時間暴露于藥物后可使短期可逆和良性狀態發展為更嚴重的病變（脂肪性肝炎、纖維化和肝硬變）。這些嚴重的不良反應成為臨床試驗中斷或藥物撤市的原因，以及幾種藥物被限制臨床使用的原因（如非阿尿苷、哌克昔林和丙戊酸）［20］。

目前，只有少數體外實驗被開發用于評價新藥潛在的致肝脂肪變性的風險，其中采用HCS技術檢測脂肪變性的幾個實驗取得了較好的結果 。Fujimura等［21］使用熒光脂肪酸模擬劑BODIPY558/ 568 C12分析幾種藥物對大鼠肝細胞內脂肪含量的影響。結果 顯示，HCS細胞成像檢測比熒光計檢測熒光顆粒更為敏感、選擇性更高。Donato等［22］利用HCS技術評估藥物引起的脂肪肝毒性，藥物處理過的HepG2細胞用熒光探針Hoechst33342，PI，TMRM，BODIPY493/503和2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2′，7′-dihydrodichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）等染色，評估細胞核型、細胞存活、MMP、細胞內脂質積累和活性氧生成等指標，能夠100%精確識別誘導脂肪變性的陽性和陰性化合物；與采用流式細胞術評估藥物引起的脂肪變性相比，該方法的通量更高，檢測時間更快。Pradip等［23］采用誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）分化的肝細胞來源的肝細胞檢測脂肪變性。結果 表明，與HepG2細胞相比，iPSC來源的肝細胞產生的HCS數據在不同孔、不同板和不同批次之間的敏感性和準確率更高。這一系列的細胞成像實驗表明，HCS是一種簡單、快速、敏感的用于脂肪變性誘導藥物篩選的工具。

3.4 磷脂沉積

藥物誘導的磷脂沉積是肝細胞及其他組織細胞脂質過度積累的另一種病變形式，它以磷脂在細胞溶酶體內積累，導致溶酶體腫大和形成多層狀囊泡結構為特點。許多副反應與可引起磷脂沉積的藥物有關，特別是同時含有親水性陽離子側鏈和疏水區域結構的藥物。藥物誘導的磷脂沉積往往是可逆的，它是細胞的一種確切的毒性表現還是適應性反應目前仍存在爭議，但監管機構仍將其視為一種不利因素，并建議在早期的藥物研發中篩選或評估藥物引起磷脂沉積的風險［24-25］。

HCS系統目前已被應用于磷脂沉積中高通量檢測。常用的選擇性探針包括LipidTOX染料或熒光標記的磷脂類似物，如NDB-PE或ss-BODIPY C（12）-HPC［25］，它們可選擇性地定位于累積磷脂的溶酶體而不會定位于胞質中的脂肪滴［26］。Tilmant等［27］采用基因組學和熒光檢測HepG2細胞2種體外方法篩選11種化合物誘導的磷脂沉積。結果 表明，在靈敏度和特異性上熒光檢測方法優于基因組學方法。文獻報道，HCS結合NBD-PE熒光標記物檢測中國倉鼠卵巢細胞K1（CHO-K1）和人肝癌細胞HepG2細胞磷脂沉積，對56種化合物潛在的誘導磷脂沉積作用進行驗證。結果 表明，該方法于體內實驗和體外硅片模型數據相比有較高的靈敏度（CHO-K1：92.0%，HepG2：88.0%）和特異性（CHO-K1：87.1%，HepG2：80.6%）［28］。最近，一種定量高通量篩選平臺被開發用于評估和分析大量藥物引起的磷脂沉積［29］，1536孔板培養HepG2細胞，lipid TOX Red和Hoechst33342染色，寬場成像HCS系統獲取細胞圖像并結合相應軟件進行定量分析。結果 顯示，對1280種化合物的初篩實驗中有187種有效值＞30%，即可能具有磷脂沉積作用，選取其中的109種進行驗證，與初篩結果 的一致性達到100%。這些實驗結果 表明，HCS技術可用于篩選和評價潛在的誘導磷脂沉積的化合物。

3.5 活性代謝物生成

眾所周知，有些藥物在體內經生物轉化后會轉變為具有毒性的活性代謝物，或因患者遺傳因素使藥物代謝異常而最終導致肝損傷［30］。此前已有多種藥物由于活性代謝物引起的肝毒性而被撤市，如非爾氨酯、溴芬酸和曲格列酮等。建立能夠反映臨床體內代謝物介導的肝毒性的體外篩選系統是早期肝毒性評價的關鍵步驟。

以往大多數檢測都是基于使用人肝癌細胞HepG2細胞［26］，然而HepG2細胞是由肝癌細胞衍生而來，其遺傳表型與人原代肝細胞已有很大差異，部分參與藥物代謝的CYP表達水平遠遠低于人原代肝細胞，難以檢出代謝活化的藥物，尤其是涉及毒性機制的研究中不足以準確預測DILI［5］。近年來，一些研究者提出基于HCS方法探討藥物毒性的肝細胞模型，來實現外源化合物在肝細胞代謝的可視化，既能提高對具有代謝活性的藥物的檢出率，同時可評價活性代謝物的毒作用機制。作為體外肝毒性評價的金標準，人原代肝細胞具有人類特有的代謝酶和輔因子，保留了人體關鍵的肝功能，已被廣泛用于HCS檢測［30］。此外，人iPSC（humaniPSC，hiPSC）分化的肝細胞能夠表達代謝相關的關鍵P450酶，并且來源豐富，尤其是來自健康志愿者和DILI患者的hiPSC分化的肝細胞，可以更好地預測人體DILI，并了解遺傳傾向所起的作用，目前也已被應用于HCS預測肝毒性領域［31］。采用含有藥物代謝酶相關基因的重組腺病毒為載體轉染HepG2細胞［32］，使其表達主要的P450代謝酶CYP1A2，CYP2D6，CYP2C9，CYP2C19以及CYP3A4。采用這種模型用HCS技術篩選能產生活性代謝物的藥物，相比于HepG2細胞，已知具有代謝活化效應的待測化合物IC50值更低，而在非代謝活性藥物中2種細胞模型得到的IC50值及其他參數值結果 相似。相比于HepG2細胞，HepaRG細胞可正常表達CYP酶。研究表明，通過反應性代謝物消耗GSH的DILI化合物，在HepaRG細胞比在HepG2細胞，GSH降低或ROS升高更明顯；對2種細胞有不同程度的CYP酶表達比較，有助于闡明代謝對肝細胞毒性的作用［33］。

4 展望

經過十多年的發展，HCS功能日益強大，已成為制藥行業的重要組成部分，但該技術尚有大量的技術難題有待研究和解決。目前，HCS儀器大多不具有比例成像分析的功能，隨著多參數檢測復雜性的增加，更高分辨率的顯微鏡和新的成像方式需要進一步發展。最近一項關于HCS的調查顯示，每年發布的HCS實驗數量雖持續穩步增長，但信息內容滯后，并未充分發揮HCS技術多維數據分析的優勢，其主要原因在于圖像分析方法的限制［34］。對于特定的HCS檢測通常組合不同的方法來實現最佳分析，但往往由于對實驗人員生物信息學知識儲備的要求較高而無法實現。未來的發展方向是構建強大的數據分析系統，提高分析軟件的數據挖掘技術和高維數據分析方法，并可以根據個人需求輕松定制，實現將每個細胞的海量信息轉化為生物學上可解釋的結果 。此外，尋找具有更高特異性和兼容性的指示劑和試劑也是HCS技術發展的重點。

為解決體外DILI預測結果 的準確性，更加整體和復雜的細胞模型被越來越多地開發和使用，如hiPSC分化的肝細胞、三維培養的肝細胞、與非實質細胞共培養的肝細胞以及在流體系統中培養的肝細胞等，這些新的細胞模型結合HCS技術預測肝毒性已有報道，也需要在HCS中得到進一步的研究，以解決更加復雜的機制問題。此外，鑒于DILI機制的復雜性以及體外預測與臨床結果 的差異，任何技術都無法對所有的機制實現全面預測。尤其是涉及非細胞毒性相關的肝損傷，如膽管消失綜合征、血竇阻塞綜合征和免疫介導的DILI事件，目前還無法輕易借助于細胞基礎的HCS技術預測。

隨著檢測技術、實驗設計和分析方法的發展，可以預測可視化、多參數篩選方法將繼續推進對細胞生命過程的系統化了解。期待未來HCS得到產業化的應用，從而成為藥物開發的強大工具和平臺。

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High-content screening in studies of toxicology and its application in drug-induced hepatotoxicity

GE Shuai,TANG Na-ping,FU Li-jie,MA Jing
(National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research,China State Institute of Pharmaceutical Industry,Shanghai 201203,China)

Drug-induced liver injury(DILI)is one of the major causes of termination of drug development.The establishment of a high-throughput test system to predict potential clinical hepatotoxicity is a valuable approach in the pharmaceutical industry.The high-content imaging-based in vitro assays allow simultaneous detection of cellular multiple parameters in the system.The real-time monitoring of multiple signaling pathways can shed light on many mechanisms of cell injury,with high sensitivity and specificity. Many types of liver cell models have been applied to high-content screening(HCS)so far.This paper introduceds the HCS technology and reviews the data of hepatotoxicity obtained from HCS technology in recent years.At the same time,we discuss the application of this technology in exploring the mechanism of hepatotoxicity and the potential of HCS technology in studying DILI and mechanisms.

high-content screening;hepatotoxicity;toxicology

The project supported by Special Grant from Advanced Programs of National Science and Technology Major Project of China(2015ZX09501004-002-006);and Advanced Programs of National Science and Technology Major Project of China(2015ZX09501-007-003)

MA Jing,Tel:(021)50801763,E-mail:jma@ncdser.com

R99

A

1000-3002-（2017）06-0689-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.028

2017-01-13接受日期：2017-03-27）

（本文編輯：賀云霞）

國家科技部重大專項定向擇優項目（2015ZX-09501004-002-006）；國家科技部重大專項定向擇優項目（2015ZX09501-007-003）

葛帥，女，碩士研究生，主要從事肝臟毒理學研究，Tel：13122365965，E-mail：geshuai2013@163.com；馬璟，女，博士，研究員，博士生導師，主要從事毒理學研究。

馬璟，Tel：（021）50801763，E-mail：jma@ncdser.com