基于人胎盤屏障體外模型評價雙黃連的胚胎毒性

宋殿榮，張崴，趙麗穎，郭潔，李會娟，杜文欣

（1.天津中醫藥大學第二附屬醫院婦產科，天津300150；2.天津中醫藥大學研究生院，天津300070）

基于人胎盤屏障體外模型評價雙黃連的胚胎毒性

宋殿榮1，張崴1，趙麗穎2，郭潔1，李會娟2，杜文欣1

（1.天津中醫藥大學第二附屬醫院婦產科，天津300150；2.天津中醫藥大學研究生院，天津300070）

目的 聯合應用人胎盤屏障體外模型和胚胎干細胞（ES）實驗模型，評價雙黃連的胚胎毒性。方法利用胎盤組織薄片培養技術與尤斯（Ussing）擴散池實驗相結合建立人胎盤屏障體外模型。于胎盤屏障母體側給予雙黃連0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4和12.8 g·L-1，于藥后60 min分別取母體側和胎兒側培養液作為含藥上清，與ES（D3系）和BALB/c小鼠胚胎成纖維細胞（3T3）共培養10 d，MTT法檢測細胞存活率，分別計算兩側含藥上清抑制ES和3T3細胞存活的IC50。利用懸滴-懸浮-貼壁方法，體外培養ES向心肌細胞分化，實時定量PCR檢測心肌細胞特異基因肌球蛋白重鏈基因β（β-MHC）的表達，表示ES向心肌細胞的分化率，分別計算抑制ES細胞分化的IC50。根據胚胎毒性評價標準，預測雙黃連的胚胎毒性。結果 胎盤屏障母體側雙黃連抑制3T3細胞存活及ES細胞存活和分化的IC50分別為1.97，0.84和0.48 g·L-1；根據胚胎毒性評價標準判定，雙黃連在母體側具有弱胚胎毒性。胎盤屏障胎兒側雙黃連抑制3T3細胞存活及ES細胞存活和分化的IC50分別為3.19，2.57和0.95 g·L-1；根據胚胎毒性評價標準判定，雙黃連透過胎盤屏障后，在胎兒側無胚胎毒性。結論母體側給予所測試濃度范圍內的雙黃連透過胎盤屏障后，無明顯胚胎毒性。以透過胎盤屏障的含藥上清作為受試物檢測藥物的胚胎毒性，對于評價妊娠期用藥的安全性更具有科學性，對臨床合理用藥具有參考價值。

雙黃連；胚胎毒性；胎盤屏障；胚胎干細胞

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.022

雙黃連凍干粉為金銀花、黃芩和連翹3味中藥經現代工藝制成的中藥粉針劑，具有清熱解毒和抗菌抗病毒的雙重作用，廣泛用于治療各種感染性疾病，特別是屢見于妊娠期使用并取得良好療效的臨床報道［1］。2009年宋殿榮等［2］研究報道，雙黃連凍干粉透過大鼠胎盤屏障造成胎兒宮內暴露的主要藥物成分為黃芩苷（baicalin），同時應用胚胎干細胞（embryonic stem cells，ES）模型進行評價，提出了黃芩苷具有弱胚胎毒性［3］。但由于存在種屬差異，動物實驗結果 不能直接外推到人體，2013年宋殿榮等［4］建立了人胎盤屏障體外模型，該模型具有在體胎盤的內分泌和物質轉運功能，能避免種屬差異，模擬人體環境，明確透過人胎盤屏障的中藥成分。故本研究聯合應用人胎盤屏障體外模型和ES實驗（ES test，EST），進一步評價雙黃連的胚胎毒性，為臨床合理用藥提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 細胞和動物

新鮮胎盤來源于天津市南開醫院產科。ES（D3系）細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。BALB/c小鼠胚胎成纖維細胞（3T3）為天津醫科大學腫瘤醫院研究所惠贈。BALB/c小鼠〔SPF級，實驗動物生產許可證號：SCXK-（軍）2007-004〕購自軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.2 藥物、主要試劑和儀器

黃芩苷購自中國藥品生物制品檢定所，批號110715-200815。Knock out-DMEM培養基、Knock out-serum replacement（KSR）、1%非必需氨基酸、β-巰基乙醇、谷氨酰胺和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；小鼠白血病抑制因子1000 kU·L-1購自美國Chemicon公司；熒光素、異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖、乙二醇、二甲亞砜、明膠、MTT和絲裂霉素購自美國Sigma公司。倒置顯微鏡（Nikon TE2000-u，日本Nicon公司），酶聯免疫檢測儀（Σ960，中國臺北），Chromo4四通道實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），尤斯擴散池（Ussing chamber EM-CSYS-2，美國PI公司），樣本夾片P2314和Leica VT1000振動切片機（德國徠卡公司）。

1.3 人胎盤屏障體外模型的建立

參照文獻［4］方法建立人胎盤屏障體外模型，選擇孕14～24周無妊娠合并癥和妊娠并發癥非計劃妊娠婦女經水囊引產的胎盤，年齡25～30歲。排除HIV、HBV、HCV、蒼白密螺旋體（梅毒密螺旋體）和巨細胞病毒感染等。由天津中醫藥大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準，并獲得患者知情同意。選擇胎盤終末絨毛部位，即胎盤母體面底板區的中間帶的叢密絨毛處，取約3 cm×3 cm×1 cm大小的組織塊，玻璃化冷凍方法固定，切割成為厚度500 μm的組織薄片，復蘇，按照母體面-胎兒面的方向固定于擴散池的夾片上，放置于尤斯擴散池，胎兒側和母體側分別加入37℃，pH 7.4的K氏緩沖液（g·L-1：NaCl 6.923，KCl 0.354，NaHCO32.1，Na2HPO40.136，MgSO4·7H2O 0.288，CaCl2·6H2O 0.56，葡萄糖1.8，L-丙氨酸0.178）2 mL，建立人胎盤屏障體外模型系統裝置。該模型系統由尤斯擴散池、溫度加熱塊、恒溫水浴箱及95%O2和5%CO2混合氣體循環系統4部分組成，分別構成人胎盤屏障體外模型的擴散系統、溫度控制系統和氣流控制系統。

1.4 人胎盤屏障體外模型功能鑒定

胎盤屏障體外模型預平衡30 min后，即刻在擴散池的母體側和胎兒側同時加入已預溫到37℃，pH 7.4的K氏緩沖液2 mL，于給定的時間間隔（1，2，3，4，5，12，24和48 h）在母體側取樣100 μL，同時立刻補充同溫度等體積的K氏緩沖液。各樣本1000×g離心10 min，取上清液，4℃保存。ELISA檢測胎盤滋養細胞人絨毛膜促性腺激素β（β-human chorionic gonadotropin，β-HCG）的分泌水平。

1.5 雙黃連含藥上清樣品的制備

精密稱取雙黃連凍干粉256 mg于10 mL容量瓶中，用K氏緩沖液標定，得到25.6 g·L-1雙黃連溶液，用K氏緩沖液逐級稀釋，分別得到不同濃度的供試品，-4℃冰箱保存。在胎盤屏障體外模型母體側加入已預溫到37℃，濃度分別為0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4和12.8 g·L-1的雙黃連溶液7 mL，胎兒側同時加入同溫度等體積K氏緩沖液。于加藥后60 min，將兩側樣品全部取出，1000×g離心10 min，取上清液分別為兩側雙黃連含藥上清樣品，置于-20℃冰箱冷凍保存備用。

1.6 小鼠胚胎干細胞培養

取孕期12.5～14.5 d的BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死，浸泡，洗刷，消毒，剖腹取出胚胎，去除頭、肝和四肢，培養液沖洗，充分剪碎。加入0.25%胰酶-0.04%EDTA 10 mL，分階段消化，吸取上層懸液并離心收集細胞，接種于T75培養瓶培養。倒置顯微鏡下觀察滋養層細胞鋪滿培養瓶底，加入絲裂霉素10 mg·L-1混勻，培養4 h，消化，接種于明膠化的培養皿中備用。

從液氮中取出ES復蘇，接種于已鋪好滋養層細胞的6 cm培養皿中培養，每天更換細胞培養液（HDMEM、15%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol·L-1、1%非必需氨基酸、2-巰基乙醇0.1 mmol·L-1、青霉素50 kU·L-1、鏈霉素50 mg·L-1和小鼠白血病抑制因子1000 kU·L-1）。ES細胞增殖3 d，形成大小均一的克隆，克隆緊密，立體感強，折光性好，細胞克隆于培養皿鋪滿60%～70%時傳代。

1.7 MTT法檢測胚胎干細胞和3T3細胞的存活

將ES或3T3細胞200 μL（含500個細胞）接種于96孔板上，將胎盤屏障胎兒側和母體側雙黃連含藥上清樣品（加入10%FBS、谷氨酰胺2 mmol·L-1、青霉素50 kU·L-1和鏈霉素50 mg·L-1）加入96孔板，與ES或3T3細胞共培養。同時設細胞對照組。第3和第5天更換培養液。第10天相差顯微鏡下觀察細胞形態，形態正常則應用MTT法檢測細胞存活率。細胞存活率（%）=細胞對照組A570nm均值/藥物組A570nm均值×100%。分別以雙黃連初始濃度（母體側）為橫坐標，細胞存活率為縱坐標，繪制濃度-細胞存活率曲線，應用GraphPadPrism5軟件計算抑制ES或3T3細胞存活50%的雙黃連濃度。

1.8 胚胎干細胞向心肌細胞的體外分化培養［5］

①懸滴培養：調整ES細胞密度至3.75×107L-1，分別將單細胞懸液置于6 cm培養皿中，從中取單細胞懸液以每滴20 μL、每培養皿80滴置于10 cm細胞培養皿內，加蓋。翻轉培養皿蓋子至正常位置，蓋在培養皿上，使之懸滴生長，培養皿內加入PBS 5 mL。置37℃，5%CO2和飽和濕度培養箱內培養3 d。②懸浮培養：第4天于倒置顯微鏡下觀察，每個懸滴內均含有1個擬胚體。吸棄PBS，分別加入胎盤屏障胎兒側和母體側雙黃連含藥上清樣品（加入15%FBS、谷氨酰胺2 mmol·L-1、1%NEAA、2-巰基乙醇0.1 mmol·L-1、青霉素50 kU·L-1和鏈霉素50 mg·L-1）。將擬胚體沖入培養皿底，并移至6 cm培養皿懸浮培養2 d。③貼壁培養：第6天時肉眼觀察，每個培養皿中均可見數十個擬胚體。分別接種至事先用明膠包被的24孔板內，每孔中加入2 mL上述胎兒側和母體側雙黃連含藥上清。37℃，5%CO2和飽和濕度培養箱內培養5 d，實時定量PCR法檢測心肌細胞特異基因肌球蛋白重鏈基因β（myosin heavy chain gene-β，β-MHC）mRNA表達。

1.9 實時定量PCR法檢測β-MHC mRNA的表達

Trizol試劑一步法提取細胞總RNA，檢測總RNA濃度，鑒定其純度及完整性。以2 μg RNA為模板逆轉錄合成cDNA。β-MHC引物：GCCCCTCCTCACATCTTCTCC（F）和CAGGGTTGGCTTGGATGATTT（R）；內參照GAPDH引物：CCTTCCGTGTTCCTACCC（F）和CAACCTGGTCCTCAGTGTAG（R）。PCR擴增的反應體系為SYBR Green Real time PCR Master Mix 12.5 μL，樣品溶液2.5 μL，引物各1.0 μL，加雙蒸水至總體積25 μL。反應條件：95℃預變性60 s；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個循環，熔解曲線72～95℃，每0.4℃讀數1次，持續1 s。用基因相對定量法（2-ΔΔCt）計算各組β-MHC mRNA相對于對照組的表達倍數。β-MHC表達水平表示ES細胞分化率。ES細胞分化率（%）=藥物組2-ΔΔCt/細胞對照組2-ΔΔCt× 100%。以初始雙黃連濃度（母體側）為橫坐標，ES分化率為縱坐標繪制濃度-反應曲線。應用GraphPadPrism5軟件計算抑制ES 50%分化的雙黃連濃度。

10胚胎毒性結果 評價［6］

公式Ⅰ：5.916 lg（3T3存活IC50）+3.500 lg（ES存活IC50）-5.307〔（3T3存活IC50-ES分化IC50）/ 3T3存活IC50〕-15.72；公式Ⅱ：3.651 lg（3T3存活IC50）+2.394 lg（ES存活IC50）-2.033〔（3T3存活IC50-ES分化IC50）/3T3存活IC50〕-6.85；公式Ⅲ：-0.125 lg（3T3存活IC50）+1.917 lg（ES存活IC50）+ 1.500〔（3T3存活IC50-ES分化IC50）/3T3存活IC50〕-2.67。胚胎毒性判定標準：Ⅰ＞Ⅱ且Ⅰ＞Ⅲ，受試物胚胎毒性為一級，即無胚胎毒性；Ⅱ＞Ⅰ且Ⅱ＞Ⅲ，受試物胚胎毒性為二級，即弱胚胎毒性；Ⅲ＞Ⅰ且Ⅲ＞Ⅱ，受試物胚胎毒性為三級，即強胚胎毒性。

2 結果

2.1 人胎盤屏障體外模型功能鑒定

測定人胎盤屏障體外模型建立后母體側胎盤組織薄片48 h內的分泌功能。結果 顯示，胎盤終末絨毛組織薄片在擴散池培養條件下，48 h內均存在β-HCG的分泌，呈先上升后下降的趨勢，分泌的峰值在培養5 h（圖1），表明該模型在48 h內能很好地維持胎盤的在體功能。

Fig.1 Human chorionic gonadotropin-β（β -HCG）expression level in placenta tissue slice within 48 h in human placental barrierin vitrodetected by ELlSA.After the placenta barrier model was pre-equilibrated 30 min，K buffer 2 mL was added to the maternal and fetal sides of the diffusion chamber at once，and the level of β-HCG in the maternal side buffer was detected by ELISA at a given time interval.x±s，n=3.

2.2 雙黃連對3T3細胞存活的影響

胎盤屏障母體側和胎兒側雙黃連對3T3細胞存活的影響見表1。培養10 d后，隨母體側雙黃連初始濃度的加大，細胞存活率明顯下降（P＜0.05）；在雙黃連濃度為3.2和6.4 g·L-1時，母體側含藥上清的細胞毒性較胎兒側含藥上清更加明顯（P＜0.05）。根據雙黃連初始濃度-3T3細胞存活率反應曲線，母體側雙黃連抑制3T3細胞存活的IC50為1.97 g·L-1（初始濃度）；透過胎盤屏障后，胎兒側雙黃連IC50為3.18 g·L-1（初始濃度）。

2.3 雙黃連對胚胎干細胞存活的影響

胎盤屏障母體側和胎兒側雙黃連對ES細胞存活的影響見表2。培養10 d后，隨母體側雙黃連初始濃度的加大，細胞存活率明顯下降（P＜0.05）；雙黃連濃度6.4 g·L-1時，母體側含藥上清的細胞毒性較胎兒側含藥上清更加明顯（P＜0.05）。根據雙黃連初始濃度-ES存活率反應曲線，母體側雙黃連抑制ES細胞存活的IC50為0.84 g·L-1（初始濃度）；透過胎盤屏障后，胎兒側雙黃連IC50為2.57 g·L-1（初始濃度）。

2.4 雙黃連對胚胎干細胞向心肌細胞分化的影響

實時定量PCR檢測心肌β-MHC表達結果 （圖2）表明，隨母體側雙黃連初始濃度的加大，ES向心肌細胞分化程度下降。根據雙黃連初始濃度-ES分化率效應曲線計算，母體側雙黃連抑制ES細胞分化的IC50為0.48 g·L-1（初始濃度）；透過胎盤屏障后，胎兒側雙黃連IC50為0.95 g·L-1（初始濃度）。

2.5 基于胎盤屏障體外模型預測雙黃連胚胎毒性

胎盤屏障母體側雙黃連抑制3T3細胞存活及ES細胞存活和分化的IC50分別為1.97，0.84和0.48 g·L-1。根據胚胎毒性評價公式，計算得到Ⅰ= 10.005，Ⅱ=10.649，Ⅲ=4.482；顯然Ⅱ＞Ⅰ，Ⅱ＞Ⅲ，提示母體側雙黃連具有弱胚胎毒性。胎盤屏障胎兒側雙黃連抑制3T3細胞存活及ES細胞存活和分化的IC50分別為3.19，2.57和0.95 g·L-1。根據胚胎毒性評價公式，計算得到Ⅰ=13.219，Ⅱ=12.679，Ⅲ= 5.359；顯然Ⅰ＞Ⅱ，Ⅰ＞Ⅲ，提示雙黃連透過胎盤屏障后無胚胎毒性。

Tab.1 Effect ofShuanghuanglianon survival of 3T3 cells

Tab.2 Effect ofShuanghuanglianon survival of embryonic stem cells（ESCs）

Fig.2 lnhibitory effect ofShuanghuanglianon differentiation of ESCs to cardiomyocytes.See Tab.1 for the preparation of fetal and maternal side supernatant withshuanghuanglian.The differentiation of ESCs to cardiomyocytes was detected through hanging drop-suspension attachment method. Real-time quantitative PCR assay was used to detect the expression of heart muscle myosin heavy chain（β-MHC）mRNA in ESCs．The relative quantitative expression of β-MHC mRNA was by 2-△△Ct.Differentiation rate of ESCs（%）=2-ΔΔCtof experimental group/2-ΔΔCtof cell control group×100%.x±s，n=6.

3 討論

本課題組前期研究結果 顯示，雙黃連透過大鼠胎盤屏障造成胎兒宮內暴露的藥物成分為黃芩苷，應用EST方法評價黃芩苷的胚胎毒性為弱胚胎毒性［3］。然而，由于中藥具有組成成分的多樣性和可變性以及成分間相互作用的難以預測性等特點，僅考察中藥單一組分的胚胎毒性尚不能全面客觀地評價中藥的安全性［7］。因此，黃芩苷的胚胎毒性并不能完全代表雙黃連的胚胎毒性。根據血清藥理學理論，應用中藥后只有被吸收入血或在體內代謝最終存在于血液中含量較高的成分，才是發揮藥效或毒性作用的成分。本研究充分考慮到藥物在體內的代謝更為接近人體，以胎盤屏障體外模型母體側和胎兒側含藥上清作為雙黃連胚胎毒性研究的受試物，結果 亦顯示雙黃連在母體側具有弱胚胎毒性，與以往研究結果 一致。

妊娠期胎盤作為母體與胎兒之間的重要器官，具有保護胎兒的屏障作用，藥物只有透過胎盤屏障進入胎兒體內，才可能對胎兒的生長發育造成影響。因此，檢測透過胎盤屏障的藥物成分的胚胎毒性更具臨床價值。本研究成功復制了人胎盤屏障體外模型，該模型在48 h內能保持胎盤活性，很好地模擬在體環境。因此，本研究以透過胎盤屏障模型的胎兒側含藥上清作為雙黃連胚胎毒性評價的受試物。EST結果 顯示，透過胎盤屏障后，雙黃連無胚胎毒性，這與文獻［8-9］報道結果 一致，即妊娠期應用雙黃連治療上呼吸道感染和泌尿系統感染，未發現對孕婦心、肝、腎及造血系統的影響，經隨訪亦未發現流產、早產及新生兒畸形。本研究結果 顯示，胎盤屏障母體側雙黃連抑制3T3細胞存活及ES細胞存活和分化的IC50分別為1.97，0.84和0.48 g·L-1；透過胎盤屏障胎兒側雙黃連抑制3T3細胞存活及ES細胞存活和分化的IC50分別為3.19，2.57和0.95 g·L-1，說明雙黃連透過胎盤屏障造成胎兒宮內暴露的濃度至少要增加至2倍，才能抑制ES細胞50%存活及向心肌細胞50%分化。提示胎盤屏障可減少雙黃連透過胎盤、減弱其宮內暴露對胎兒的影響。在所觀察濃度范圍內，母體側給予雙黃連，透過胎盤屏障后，對胚胎無明顯胚胎毒性。

以透過胎盤屏障的含藥上清作為受試物進行EST，檢測藥物的胚胎毒性，對于評價妊娠期應用中藥的安全性更具有科學性，對臨床合理用藥更具有參考價值。但胎盤是孕期特有的組織器官，具有物質轉運、屏障和內分泌代謝等功能，不同孕期胎盤功能不盡相同。在孕早期胎盤尚未形成，其功能并不完善。孕中期胎盤屏障由合體滋養細胞、細胞滋養細胞及基膜、絨毛內薄層結締組織、絨毛內毛細血管內皮細胞和基膜構成，其結構最為完整，在整個孕期具有最強的屏障功能。妊娠后期母體血與胎兒血之間只隔合體滋養層、血管內皮及兩者之間的基膜，故通透性很強。本研究選擇胎盤屏障功能最完善的孕中期胎盤組織作為研究對象，考察胎盤對藥物的通透性。然而不同藥物在不同孕期對胚胎或胎兒的影響不盡相同，因此要考察藥物在不同孕期的胚胎毒性，需選擇相應孕期的胎盤組織建立胎盤屏障體外模型，以獲得更加科學可靠的實驗結果 。另外，體外培養ES細胞向心肌細胞分化的技術要求高，耗時長，費用昂貴；EST過程中需要利用生物統計公式對實驗所得數據進行分析，過程繁瑣，耗時耗力，不適于高通量篩選中藥的胚胎毒性。因此，建立一種高通量的胚胎毒性篩選模型，與人胎盤屏障體外模型聯合快速篩選藥物胚胎毒性，將成為今后研究的重點。

［1］Wang LW，Yang J．Clinical application of Shuanghuanglian in pregnancy complication［J］.J Chengde Med Coll（承德醫學院學報），2007，24（2）：157-158.

［2］Song DR，Guo J，Wang YF，Pan GX，Li PL，Zhang W，et al.Ingredients of Shuanghuanglian injection powder permeation through placental barrier of rat in pregnancy［J］.China J Chin Mater Med（中國中藥雜志），2010，35（12）：1626-1629.

［3］Zhang W，Song DR，Wang YN，Zhu Z.Evaluation of embryotoxicity of baicalin based on embryonic stem cell test system［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國藥理學與毒理學雜志），2012，26（6）：864-869.

［4］Song DR，Guo J，Han F，Zhang W，Wang YN，Wang YH.Establishment of an in vitro model of the human placental barrier by placenta slice culture and Ussing chamber［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2013，77（5）：1030-1034.

［5］Kuang NZ，Fu YY，Huang BH，Zhou ZX，Zeng XP. An experimental study on inhibitory effect of baicalin on human hepatic carcinoma cell line SMMC7721 in vitro［J］.Lishizhen Med Mater Med Res（時珍國醫國藥），2008，19（6）：1422-1424.

［6］Genschow E，Scholz G，Brown NA，Piersma AH，Brady M，Clemann N，et al.Development of prediction models for three in vitro embryotoxicity tests which are evaluated in an ECVAM validation study［J］.Altex，1999，16（2）：73-83.

［7］Zaffani S，Cuzzolin L，Benoni G.Herbal products：behaviors and beliefs among Italian women［J］. Pharmacoepidemiol Drug Saf，2006，15（5）：354-359.

［8］Qi LW，Zhou JL，Hao HP，Li HJ，Wen XD，Chen J，et al.Biological-chemical profiling of in vitro and in vivo bioactive compounds from traditional Chinese medicines with holistic views［J］.J China Pharm Univ（中國藥科大學學報），2010，41（3）：195-202.

［9］Wang QL.Clinical observation of Shuanghuanglian Injection in treatment of upper respiratory tract infection during pregnancy［J］.Res Tradit Chin Med（中醫藥研究），1999，15（3）：33.

［10］Zhou CH，Wang Q，Hu XF.Clinical observation of Shuanghuanglian Injection in treating 29 cases of urinary tract infection during pregnancy［J］.Clin J Anhui Tradit Chin Med（安徽中醫臨床雜志），1998，10（1）：13.

Evaluation of embryo toxicity of Shuanghuanglian based on human placental barrier model

SONG Dian-rong1,ZHANG Wei1,ZHAO Li-ying2,GUO Jie1,LI Hui-juan2,DU Wen-xin1
(1.Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300150,China;2.Graduate School,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300070,China)

OBJECTlVETo evaluate the embryo toxicity of Shuanghuanglian(SHL)by the combination of a human placental barrier model and embryonic stem(ES)cell test model.METHODSA human placental barrier model was set up by placenta slice culture and Ussing chamber.SHL 0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 and 12.8 g·L-1was added into the maternal side of the human placental model,respectively.All the media was collected respectively from the maternal side and fetal side 60 min later and taken as the SHL containing medium.ES cells(D3 line)and embryonic fibroblast cells(BALB/c 3T3)were cultured with the SHL containing medium respectively from the maternal side and the fetal side for 10 d.Cell viability was detected by MTT assay,and 50%survival inhibitory ratio of ES and 3T3 cells by SHL was calculated.ES cells were incubated with the SHL containing medium from the maternal side or fetal side when they differentiated to cardiac myoblasts using hanging drop-suspension-attachment method.Messenger RNA of myosin heavy chain genes(β-MHC)was detected by Q-PCR for differentiation ratio,and 50%differentiation inhibitory ratio of ES cells by SHL was calculated.A statistics formula was used for prediction of SHL embryotoxicity potential.RESULTSThe IC50of SHL in the maternal side of the human placental model for 3T3 cell survival,ES cell survival and ES differentiation was 1.97,0.84 and 0.48 g·L-1,respectively.According to the criteria for embryo toxicity evaluation,SHL had weak embryo toxicity.However,the IC50of SHL in the fetal side of the human placental model for 3T3 cell survival,ES cell survival and ES differentiation was 3.19,2.57 and 0.95 g·L-1,respectively.According to the criteria for embryo toxicity evaluation,the supernatant containing SHL that went through the placental barrier had no embryo toxicity.CONCLUSlONSHL is safe in the test concentration range during pregnancy.It is more scientific to evaluate embryo toxicity of drugs by ES cell test with the samples obtained through the placental barrier during pregnancy.

Shuanghuanglian;embryotoxicity;placental barrier;embryonic stem cells

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81273938）

SONG Dian-rong，E-mail：songdr58@126.com

R285.1

A

1000-3002-（2017）06-0649-06

2017-02-04接受日期：2017-06-16）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學基金（81273938）

宋殿榮，女，主任醫師，教授，主要從事妊娠期用藥安全性研究。

宋殿榮，E-mail：songdr58@126.com