血管內皮生長因子與胎盤生長因子聯合對大鼠急性心肌梗死后血管新生及心功能的影響

張曉婷 劉峰 王炳銀

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·基礎研究·

血管內皮生長因子與胎盤生長因子聯合對大鼠急性心肌梗死后血管新生及心功能的影響

張曉婷 劉峰 王炳銀

目的 觀察血管內皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PLGF)單獨使用和聯合使用對急性心肌梗死大鼠心肌梗死缺血邊緣區血管新生和心功能的影響。方法 75只雄性SD大鼠隨機分為5組：sham 組(假手術組)，NS組(250 μl生理鹽水)，VEGF組(1 μg重組鼠VEGF溶于250 μl生理鹽水)，PLGF組(1 μg重組鼠PLGF溶于250 μl生理鹽水)，VEGF+PLGF組(重組鼠VEGF 0.5 μg+重組鼠PLGF 0.5 μg溶于250 μl生理鹽水)。sham 組大鼠僅開胸，不結扎左前降支，并且不注射藥物，其余所有大鼠均結扎左前降支近端，建立急性心肌梗死模型，并于心肌梗死缺血邊緣區注射VEGF和PLGF。術后3周，以超聲心動圖評估大鼠心臟結構及功能，測定梗死范圍，用免疫組織化學方法檢測大鼠心肌梗死缺血邊緣區Ⅷ因子相關抗原(vWF)染色陽性的內皮細胞評估新生血管數量，α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)染色陽性的平滑肌細胞評估新生小動脈數量。結果 冠狀動脈結扎3周后，sham組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS明顯優于其余各組，差異均有統計意義(均P<0.01)；與NS組、VEGF組及PLGF組比較，VEGF+PLGF組LVEF、LVFS顯著增高，而LVEDD及LVESD則顯著減少(均P<0.05)。sham組心肌梗死范圍顯著小于其余四組，差異均有統計意義(均P<0.01)；VEGF+PLGF組大鼠梗死范圍顯著小于NS組[(19.75±3.98)%比(38.70±7.45)%，P<0.01]、VEGF組[(19.75±3.98)%比(32.20±6.00)%，P<0.05]及PLGF組[(19.75±3.98)%比(25.09±5.52)%，P<0.05]，差異均有統計學意義。sham組vWF陽性細胞數量和α-SMA陽性細胞數量顯著小于其余四組，差異均有統計學意義(均P<0.01)；其余四組大鼠vWF陽性細胞數量和α-SMA陽性細胞數量比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)；而VEGF+PLGF組vWF陽性細胞數量[(64.08±10.89)個/mm2比(55.09±8.20)個/mm2，P<0.05]、α- SMA陽性細胞數量[(11.42±3.15)個/mm2比(9.00±2.19)個/mm2，P<0.05]均高于PLGF組，差異均有統計學意義。結論 將半劑量的VEGF與PLGF聯合應用可使心肌梗死缺血邊緣區毛細血管和小動脈生成增多，心肌梗死范圍減小，并且明顯改善心功能。

急性心肌梗死； 血管內皮生長因子； 胎盤生長因子； 血管新生

急性心肌梗死后盡快恢復缺血區域心肌血供，挽救缺血、瀕臨壞死的心肌細胞，減少心肌梗死面積是改善心肌梗死患者預后的關鍵。盡管藥物治療、血運重建、再灌注治療措施和外科手術(冠狀動脈旁路移植術)等均取得令人矚目的進展，提高了患者的生存率和生活質量，然而在我國及時行再灌注治療的患者不足10%。梗死心肌自身新生血管代償、缺血預適應的變化過程非常緩慢，且只能部分代償動脈閉塞引起的心肌缺血[1]。因此，急性心肌梗死后，通過促進缺血部位血管新生、增加側支循環形成及心肌細胞再生等輔助性治療從而改善心功能，已成為國內外研究的熱點之一[1-2]。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 作為特異的血管內皮細胞促有絲分裂原，能特異性促血管內皮細胞增殖、分裂，促進缺血區域新生血管形成，并啟動或強化側支循環[3]。胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)作為VEGF家族成員，不僅具有更強的促進血管新生作用，且無水腫、纖維素沉著和新生血管瘤等不良反應[4]。有研究顯示，VEGF和PLGF可改善心肌梗死后缺血部位血流從而改善心功能[3-4]。本研究采用VEGF和PLGF半劑量聯合應用，觀察缺血區域新生血管生成及心功能情況，評估與比較不同組心功能、心肌梗死面積及梗死交界區再生血管程度等的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠(SD)75只，年齡為2～3個月，體重250～300 g，由蘇州大學動物實驗中心提供，在上海交通大學醫學院蘇州九龍醫院動物實驗中心飼養。75只SD大鼠隨機分為5組，每組15只：sham組(假手術組)，NS組(注射生理鹽水)，VEGF組(注射VEGF)，PLGF組(注射PLGF)，VEGF+PLGF組(注射VEGF+PLGF)。

1.2 急性心肌梗死模型的建立

急性心肌梗死SD大鼠模型建立參照許官學等[5]的方法。應用3%戊巴比妥溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，氣管插管后呼吸機輔助呼吸(潮氣量3 ml/100 g，呼吸頻率100次/min，呼吸比1∶3)，在胸骨左緣心臟搏動明顯處縱行切開皮膚，經左緣第3～4肋間開胸暴露心臟，于左主干左心耳下方2 mm處進針，肺動脈圓錐旁出針，以5-0絲線結扎左前降支。數分鐘后，見左心室前壁心肌變蒼白，并伴隨局部室壁運動減弱，心電圖示胸前導聯ST段弓背向上抬高并持續15 min以上為模型制作成功。sham 組大鼠僅開胸在同一解剖位置穿線，不結扎左前降支，并且不注射藥物，其余同上述操作步驟，逐層縫合胸壁，待大鼠恢復自主呼吸后，拔出氣管插管，喂養觀察。確認模型成功后，按照分組立即將250 μl注射液分5點分別注射于梗死交界區，即sham 組及NS組250 μl生理鹽水，VEGF組1 μg重組鼠VEGF溶于250 μl生理鹽水，PLGF組1 μg重組鼠PLGF溶于250 μl生理鹽水，VEGF+PLGF組，重組鼠VEGF 0.5 μg+重組鼠PLGF 0.5 μg溶于250 μl生理鹽水。

1.3 超聲心動圖對心臟結構及功能的評估

冠狀動脈結扎術后3周，于腹腔內注射1%戊巴比妥對大鼠進行經胸超聲心動圖檢查(12 MHz探頭)，用胸骨旁長軸切面，M型超聲測量左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左心室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室縮短分數(left ventricular fractional shortening ，LVFS)，以連續測量三個心動周期的平均值作為檢測數值。根據Teichholz公式[6]計算左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.4 標本采集及處理

完成超聲心動圖檢查后，經股靜脈注射10%氯化鉀溶液2 ml處死大鼠，迅速開胸，取出心臟，沿冠狀動脈溝切除心房和右心室，室間隔保留于左心室，常規石蠟包埋，垂直于室間隔，連續切5 μm厚切片5張，用于常規蘇木精-伊紅(HE)染色及免疫組化。

1.5 心肌梗死范圍測定

各切片經HE染色后，于400倍鏡下觀察，梗死區細胞纖維排列紊亂，肌層變薄，肌纖維溶解甚至消失，可見纖維組織增生，非梗死區心肌細胞排列整齊，未見斷裂、變性壞死，然后以Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行定量分析。梗死范圍計算：梗死范圍(%)=(梗死區心內膜弧長+梗死區心外膜弧長)/(左心室心內膜周長+左心室心外膜周長)×100%。

1.6 梗死交界區新生血管測定

采用免疫組化法檢測心肌梗死交界區Ⅷ因子相關抗原(von Willebrand factor，vWF)陽性的內皮細胞數量，評估新生毛細血管情況，檢測α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)陽性的平滑肌細胞數量，以評估新生小動脈數量。于400倍視野下用病理圖像分析軟件計數，vWF染色陽性的內皮細胞表示新生血管；于200倍視野下用病理圖像分析軟件計數，α-SMA染色陽性的平滑肌細胞表示新生小動脈。每張切片計數5個視野。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠急性心肌梗死模型

用3%戊巴比妥溶液腹腔麻醉效果好，術中呼吸道分泌物少，無麻醉意外發生。各組存活大鼠數量分別為：sham 組14 只，存活率為 93%;NS組10只，存活率為67%；VEGF組10只，存活率為67%；PLGF組11只，存活率為73%；VEGF+PLGF組12只，存活率為80%。大鼠死亡的主要原因為嚴重心律失常、肺部損傷和分泌物呼吸道梗塞等。

2.2 超聲心動圖對大鼠心臟結構及功能的評估情況(表1、圖1)

冠狀動脈結扎3周后，sham 組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS明顯優于其余各組，差異均有統計意義(均P<0.01)；NS組與VEGF組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)；與NS組和VEGF組相比，PLGF組及VEGF+PLGF組大鼠LVEF、LVFS顯著增高，而LVEDD及LVESD則顯著減少(均P<0.01)；與PLGF組相比，VEGF+PLGF組大鼠LVEF、LVFS均顯著升高(均P<0.05)，而LVEDD及LVESD則顯著減少(均P<0.05)。

2.3 各組大鼠心肌梗死范圍及交界區新生血管情況比較(表2、圖2～4)

大鼠心肌HE染色顯示，sham組心肌細胞排列整齊，未見斷裂、變性壞死；NS組及VEGF組梗死交界區細胞纖維排列紊亂，肌纖維溶解甚至消失，可見纖維組織增生；PLGF組及VEGF+PLGF組梗死交界區存活心肌細胞較NS組及VEGF組較多，且細胞纖維可見成列排列，尤以VEGF+PLGF組明顯。大鼠心肌vWF免疫組織化學染色顯示，sham組vWF陽性細胞數量最少，VEGF+PLGF組vWF陽性細胞數量顯著高于NS組、VEGF組及PLGF組，PLGF組高于VEGF組及NS組，而NS組vWF陽性細胞數量最少；α-SMA免疫組織化學染色顯示，sham組α-SMA陽性細胞數量最少，VEGF+PLGF組α-SMA陽性細胞數量高于NS組、VEGF組及PLGF組，PLGF組高于VEGF組及NS組，而NS組與VEGF組α-SMA陽性細胞數量未見明顯差異。

冠狀動脈結扎后3周， sham組心肌梗死范圍顯著小于其余四組，差異均有統計意義(均P<0.01)；與NS組比較，VEGF組、PLGF組及VEGF+PLGF組大鼠梗死范圍顯著縮小，差異均有統計學意義(均P<0.05)；與VEGF組大鼠相比，PLGF組梗死范圍[(25.09±5.52)%比(32.20±6.00)%，P<0.05]、VEGF+PLGF組大鼠梗死范圍[(19.75±3.98)%比(32.20±6.00)%，P<0.01]顯著縮小，差異均有統計學意義； 與PLGF組大鼠相比，VEGF+PLGF組梗死范圍[(19.75±3.98)%比(25.09±5.52)%，P<0.05]亦顯著縮小，差異有統計學意義。

表1 冠狀動脈結扎后3周超聲心動圖測定結果±s)

注：sham組，假手術組；NS組，250 μl生理鹽水；VEGF組，1 μg重組鼠VEGF溶于250 μl生理鹽水；PLGF組，1 μg重組鼠PLGF溶于250 μl生理鹽水；VEGF+PLGF組，重組鼠VEGF 0.5 μg+重組鼠PLGF 0.5 μg溶于250 μl生理鹽水；LVEDD，左心室舒張末期內徑；LVESD，左心室收縮末期內徑；LVEF，左心室射血分數；LVFS，左心室縮短分數； a，與NS組比較，P>0.05；b，與VEGF組比較，P<0.01；c，與NS組和VEGF組比較，P<0.05；d，與PLGF組比較，P<0.05；e，與其余四組比較，P<0.01

圖1 大鼠心肌梗死后超聲心動圖 急性心肌梗死模型建立3周后，sham組大鼠心功能明顯優于其余各組，VEGF+PLGF組大鼠心功能較NS組、VEGF組及PLGF組明顯改善，而PLGF組大鼠心功能較NS組及VEGF組亦改善

圖2 大鼠心肌HE染色(×400) sham組心肌細胞排列整齊，未見斷裂、變性壞死；NS組及VEGF組梗死交界區細胞纖維排列紊亂，肌纖維溶解甚至消失，可見纖維組織增生；PLGF組及VEGF+PLGF組梗死交界區存活心肌細胞較NS組及VEGF組較多，且細胞纖維可見成列排列，尤以VEGF+PLGF組明顯

圖3 大鼠心肌vWF免疫組織化學染色(×400) sham組vWF陽性細胞數量最少，VEGF+PLGF組vWF陽性細胞數量顯著高于NS組、VEGF組及PLGF組，PLGF組高于VEGF組及NS組，而NS組vWF陽性細胞數量較sham組多(棕色為陽性細胞)

圖4 大鼠心肌α-SMA免疫組織化學染色(×200) sham組陽性細胞數最少，VEGF+PLGF組α-SMA陽性細胞數量高于NS組、VEGF組及PLGF組，PLGF組高于VEGF組及NS組，而NS組與VEGF組α-SMA陽性細胞數量未見明顯差異(棕色為陽性細胞)

項目sham組(n=14)NS組(n=10)VEGF組(n=10)PLGF組(n=11)VEGF+PLGF組(n=12)梗死范圍(%) 0f38．70±7．4532．20±6．00a25．09±5．52a 19．75±3．98bcevWF陽性細胞數量(個/mm2)35．1±6．5f38．00±7．9047．90±6．76a55．09±8．20c 64．08±10．89edα?SMA陽性細胞數量(個/mm2)4．8±1．3f6．10±1．73 7．10±1．669．00±2．19c 11．42±3．15ed

注：sham組，假手術組；NS組，250 μl生理鹽水；VEGF組，1 μg重組鼠VEGF溶于250 μl生理鹽水；PLGF組，1 μg重組鼠PLGF溶于250 μl生理鹽水；VEGF+PLGF組，重組鼠VEGF 0.5 μg+重組鼠PLGF 0.5 μg溶于250 μl生理鹽水；vWF，Ⅷ因子相關抗原；α- SMA，α平滑肌肌動蛋白； a，與NS組比較，P<0.05；b，與NS組比較，P<0.01；c，與VEGF組比較，P<0.05；d，與VEGF組比較，P<0.01；e，與PLGF組比較，P<0.05；f，與其余四組比較，P<0.01

單因素方差分析發現，sham組vWF陽性細胞數量和α-SMA陽性細胞數量顯著小于其余四組，差異均有統計學意義(均P<0.01)；其余四組大鼠vWF陽性細胞數量和α-SMA陽性細胞數量比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。VEGF組vWF陽性細胞數量顯著高于NS組[(47.90±6.76)個/mm2比(38.00±7.90)個/mm2，P<0.05]，但兩組間α- SMA陽性細胞數量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；PLGF組vWF陽性細胞數量[(55.09±8.20)個/mm2比(47.90±6.76)個/mm2，P<0.05]、α- SMA陽性細胞數量[(9.00±2.19)個/mm2比(7.10±1.66)個/mm2，P<0.05]均顯著高于VEGF組；而VEGF+PLGF組vWF陽性細胞數量[(64.08±10.89)個/mm2比(55.09±8.20)個/mm2，P<0.05]、α- SMA陽性細胞數量[(11.42±3.15)個/mm2比(9.00±2.19)個/mm2，P<0.05]均高于PLGF組，差異均有統計學意義。

3 討論

急性心肌梗死是威脅人類生命的嚴重疾病之一。及時再灌注治療可以迅速開通梗死相關動脈，挽救瀕臨壞死的心肌細胞，減少梗死心肌面積。然而，在我國及時行再灌注治療的患者不足10%。而梗死心肌自身新生血管代償、缺血預適應的變化過程非常緩慢，且只能部分代償冠狀動脈梗死引起的心肌缺血[7]。未及時行再灌注治療患者往往發生明顯的心室重塑(構)，心功能逐漸減退，最終導致心力衰竭。因此，刺激、誘導和促進急性心肌梗死的缺血區域血管新生，促進缺血周邊組織側支循環形成，改善缺血心肌血流供應，已成為急性心肌梗死治療的研究熱點之一[1]。

VEGF為特異的血管內皮細胞促有絲分裂原，在急性心肌梗死后心肌缺血缺氧狀態下，細胞外基質中的VEGF與血管內皮細胞膜上的血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)結合后，通過激活Src[8]、Raf-MEK[9]，PI3K-Akt[10-12]及DII4-Notch[13]等信號通路，誘導梗死區毛細血管新生，促進缺血周邊組織側支循環建立。然而VEGF主要作用于微血管生成階段，形成的血管易滲漏、不成熟、不穩定,并且不能促進動脈生成[14-16]，因而心功能改善并不明顯。也有報道顯示，逆轉錄腺病毒載體導入VEGF后，急性心肌梗死大鼠心功能趨向好轉[17]。本研究中，給予外源性VEGF可提高心肌梗死周邊區域毛細血管密度，但對梗死區動脈密度及心功能改善無明顯作用，這與前述學者研究結果相同[14-16]。

PLGF作為VEGF家族成員同樣具有強大的促血管生成作用。在急性心肌梗死后心肌缺血區域與血管內皮生長因子受體1(vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR-1)結合激活PI-3K/Akt、p38MAPK/ERK和JAK/STAT3等下游信號轉導通路[18-19]，促進內皮細胞遷移、增殖、聚集，直接刺激血管新生，并可增加小動脈增殖[20]，形成的血管更加穩定，可顯著改善心功能。在本研究中，PLGF組較VEGF組和NS組毛細血管密度及小動脈密度均增加，心功能明顯改善；并且PLGF治療可增加梗死交界區有效側支循環、減少梗死范圍，減少左心室重構，提高LVEF，改善心功能。

本研究還觀察到VEGF+PLGF組較其他三組大鼠心功能改善更明顯，新生毛細血管及小動脈數量更多。這可能由于PLGF 特異性的受體為VEGFR-1，而VEGF在缺氧狀態下可以與VEGFR-1和VEGFR-2結合，但是VEGFR-2在參與血管生成的內皮細胞中高表達，VEGF的信號主要通過它傳導[21]。因此，在病理狀態下，PLGF競爭性地與VEGFR-1結合,從而增加VEGF與VEGFR-2的結合,強化VEGF血管生成的功能。并且PLGF 能增加 VEGF 的活性,通過覆蓋一層平滑肌細胞來刺激新的動脈形成和血管成形[22]。由此，將VEGF與PLGF聯合使用，可能促血管生成作用更強，并且形成更有效的側支循環，改善心肌缺血區血液供應，對心功能的改善更明顯。本研究在該理論基礎之上，將VEGF與PLGF劑量減半聯合使用，發現較二者單獨使用，心肌梗死區毛細血管和小動脈生成更多，心肌梗死范圍更小，并且心功能改善更明顯。因此，本研究提示，VEGF與PLGF聯合使用后促進心肌梗死區毛細血管和小動脈生成及改善心功能效果優于二者單獨使用。但本研究樣本量較小，并且尚未完全闡明相關生理機制，需要進一步擴大樣本量，對生理機制及結果進行深入研究。

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Effects of combination of vascular endothelial growth factor and placental growth factor on angiogenesis and cardiac function after acute myocardial infarction in rats

ZHANGXiao-ting,LIUFeng,WANGBing-yin.

XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China

Correspondingauthor:LIUFeng,Email:fliu@medmail.com.cn

Objective To evaluate the combined effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) and placental growth factor (PLGF) on angiogenesis and cardiac function and compare with VEGF or PLGF only in acute myocardial infarction rats. Methods Seventy-five males Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into five groups: sham group, NS group, VEGF group, PLGF group, and VEGF+PLGF group with 15 rats in each group. All the rats underwent LAD ligation and injection of NS, VEGF, PLGF, VEGF+PLGF, in the peri-infarct area, respectively, besides the sham group. Three weeks after coronary artery ligation and different agents injection, cardiac function, myocardial scar area, angiogenesis and arteriogenesis were studied. Cardiac structure and function,and infarct size were assessed by echocardiography. The number of new vessels and the number of new arterioles were evaluated by haematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry staining. Results Three weeks after LAD ligation and different agents injection, the LVEDD and LVESD were significantly decreased (P<0.01)in NS group， VEGF group and PLGF group. While the LVEF and LVFS were higher in VEGF+PLGF group than that in other groups. Myocardial infarct size was reduced in VEGF group(P<0.05). Angiogenesis and arteriogenesis were higher in VEGF+PLGF group than that in VEGF group (P<0.01) and PLGF group (P<0.05). Angiogenesis and arteriogenesis were significantly higher in PLGF group than that in VEGF group (P<0.01). The density of microvessels in VEGF group was higher than that in NS group (P<0.05), while arteriogenesis was of no statistical difference. Conclusion The combination of half VEGF and PLGF can increase angiogenesis and arteriogenesis in the ischemic marginal zone of myocardial infarction，decrease myocardial infarction area, and improve cardiac function.

Acute myocardial infarction； Vascular endothelial growth factor； Placental growth factor； Angiogenesis

10.3969/j.issn.1004-8812.2017.06.007

221004 江蘇徐州，徐州醫科大學研究生學院(張曉婷、劉峰)；江蘇蘇州，上海交通大學附屬蘇州九龍醫院心內科(張曉婷、劉峰、王炳銀)

劉峰，Email：fliu@medmail.com.cn

R542.2

2017-02-26)