固相萃取柱凈化-液相色譜-串聯質譜法測定糕點中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物和玉米赤霉烯酮

王麗娟,柯潤輝,*,安紅梅,尹建軍,宋全厚 (1.中國食品發酵工業研究院,北京 100015; 2.國家食品質量監督檢驗中心,北京 100015)

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固相萃取柱凈化-液相色譜-串聯質譜法測定糕點中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物和玉米赤霉烯酮

王麗娟1,2,柯潤輝1,2,*,安紅梅1,2,尹建軍1,2,宋全厚1,2
(1.中國食品發酵工業研究院,北京 100015; 2.國家食品質量監督檢驗中心,北京 100015)

建立使用超高效液相色譜-串聯質譜儀測定糕點中玉米赤霉烯酮(ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)及其衍生物3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON)4種真菌毒素的方法。該方法在4 min內完成4種真菌毒素的分析,線性范圍5～1000 μg/kg,標準曲線的相關系數均在0.997以上,DON、ZEN的最低檢出限為1.0 μg/kg,3-AcDON、15-AcDON的最低檢出限為1.5 μg/kg。通過對134份市售預包裝糕點樣品進行分析發現，4種真菌毒素均有一定檢出,其中ZEN、DON、3-AcDON和15-AcDON的檢出率分別為2.2%、78.4%、3.0%和5.2%,所有樣品中4種真菌毒素含量水平均未超過食品安全國家標準限量要求。

固相萃取,液相色譜-串聯質譜儀,真菌毒素,糕點

真菌毒素廣泛存在于世界各地的谷物及其加工產品當中,極大地影響到這些產品的經濟價值并對人畜健康造成潛在危害。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是污染范圍最廣的兩種鐮刀菌毒素,會通過食物鏈在人體或動物體中蓄積,造成對機體的危害,是影響食品安全的重要因素[1-2]。DON及其衍生物3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-Acetyl deoxynivalenol,3-AcDON)和15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-Acetyl deoxynivalenol,15-AcDON)具有極性毒性、免疫毒性、細胞毒性、生殖毒性和三致作用[3-4],目前已被聯合國糧農組織和世界衛生組織確定為最危險的自然發生食品污染物之一。ZEN是具有雌激素作用的真菌毒素,通過食物鏈進入人和動物體,并在機體內蓄積,產生多種雌激素效應綜合癥狀,甚至引起致癌和致畸[1]。

我國作為糧食生產大國,是受真菌毒素污染比較嚴重的國家之一。由于受氣候因素和農戶個體種植、貯藏方式的影響,我國主要糧食作物易受鐮刀菌毒素污染。尤其是南方高溫高濕地區、長江中下游地區,梅雨季節有利于霉菌生長及產毒,小麥、玉米等較普遍受到鐮刀菌毒素的污染,DON和ZEN的污染程度更是常超我國的限量標準[5-8]。食品中真菌毒素污染問題一直是備受關注的食品安全熱點,但國內相關研究多集中在小麥、玉米、花生等糧油及其加工產品上,而糕點作為一種以糧、油、糖、蛋等為主要原料加工而成的食品,其真菌毒素的殘留情況一直未受關注,目前關于糕點中真菌毒素污染水平數據十分欠缺。

真菌毒素的檢測方法很多,有生物鑒定法、化學分析法、儀器分析法和免疫分析法等[9-12],其中免疫親和柱或多功能柱凈化,液相色譜或液相色譜-串聯質譜測定的方法在食品中真菌毒素的分析中得到了廣泛的應用[13-16]。免疫親和柱凈化效果好,但通常只適用于單種毒素,通用性較差,且價格昂貴,使用成本高[17-18]。多功能凈化柱適用于多種毒素,操作簡單,但對復雜基質的樣品凈化效果不佳。固相萃取作為一種成熟、穩定的樣品前處理技術,主要作用是降低樣品基質干擾、富集目標物質、提高檢測靈敏度,在食品安全檢測中得到了廣泛的應用。本研究采用固相萃取柱凈化,液相色譜-串聯質譜法同時檢測糕點中DON、3-AcDON、15-AcDON和ZEN 4種真菌毒素殘留,并應用此方法分析134份市售糕點中4種真菌毒素殘留情況,以期為今后更全面深入的研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 超市、集市及網購的包括蛋糕、餅干、麻花、鍋巴等在內的134份預包裝糕點(包括熱加工糕點93份和冷加工糕點41份);脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮 純度≥98%,美國Sigma公司;甲醇、乙腈、正己烷為色譜純 美國J T Baker公司;實驗用水 為經Milli-Q Reference凈化系統過濾的去離子水;其他試劑 分析純。

Cleanert PEP固相萃取柱、Cleanert C18固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司；LCMS-8050超高效液相色譜-串聯質譜儀 日本Shimadzu公司,具體配置為LC-20ADXR×2輸液泵,DGU-20A3R在線脫氣機,SIL-20AXR自動進樣器,CTO-20AC柱溫箱,CBM-20A系統控制器,LCMS-8050三重四極桿質譜儀,LabSolutions Ver. 5.72色譜工作站;Milli-Q Reference超純水器 美國Millipore公司;KQ-500DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備 4種真菌毒素標準品分別用乙腈配制成100 mg/L的標準儲備液,再用乙腈配制5 mg/L的混合標準溶液,于-18 ℃避光儲存。

基質匹配標準溶液:選取不含4種待測真菌毒素的糕點作為空白樣品,按1.2.2的方法處理,移取6份各1 mL空白樣品提取液于10 mL刻度試管中,以弱氮氣流吹至近干,分別加入一定量的4種真菌毒素混合標準溶液,再加甲醇-水(20∶80)溶液定容至1 mL,混勻,配制成5、10、20、100、500和1000 μg/kg的基質匹配標準溶液,經0.22 μm微孔濾膜過濾供LC-MS/MS分析。

1.2.2 樣品前處理方法 準確稱取粉碎均勻的樣品粉末5.0 g(精確到0.01 g),置于40 mL塑料離心管中,加入乙腈20 mL,渦旋振蕩3 min,超聲10 min,浸泡過夜;9000 r/min離心10 min,上清液轉移至100 mL雞心瓶中,45 ℃旋蒸至干;加入3 mL 5%乙腈-水溶液(乙腈∶水=5∶95,體積比),再加入3 mL乙腈飽和的正己烷,渦旋2 min,充分溶解殘渣,倒入10 mL塑料離心管中,6000 r/min離心5 min,棄去上層正己烷,下層水相待凈化。

待凈化液過3 mL甲醇和3 mL水活化好的Clenert PEP(60 mg/3 mL)固相萃取小柱,控制樣品溶液滴落速度為1滴/s,1 mL蒸餾水淋洗小柱,負壓抽干,3 mL甲醇洗脫并接收。洗脫液于45 ℃下氮氣吹干,1 mL甲醇-水(20∶80)溶解,過0.22 μm濾膜,LC-MS/MS測定。

1.2.3 液相色譜條件 使用HALO C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,2.7 μm);流動相:A相-甲醇,B相-0.1%氨水溶液;流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0 min,甲醇的體積分數為10%;0～0.5 min,保持甲醇的體積分數為10%;0.5～2 min,甲醇體積分數由10%升至80%,并保持0.2 min;2.21 min,甲醇的體積分數從80%降至10%;2.21～4.0 min,甲醇的體積分數保持10%;柱溫:40 ℃;進樣體積:5 μL。

1.2.4 質譜條件 離子源:ESI(-);離子源接口電壓:0.5 kV;霧化氣:氮氣3.0 L/min;干燥氣:氮氣10 L/min;碰撞氣:氬氣;DL溫度:250 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃;掃描模式:多反應監測(MRM);駐留時間:15 ms;延遲時間:3 ms;4種真菌毒素標準品MRM參數:見表1。

1.3 數據處理

數據采集與處理通過儀器配套的Version 5.27軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱凈化技術具有能夠有效去除雜質、富集目標物的特點,在痕量分析中應用廣泛。本實驗分別考察了Cleanert PEP固相萃取柱和Cleanert C18固相萃取柱的凈化吸附和濃縮效果。

表1 4種真菌毒素的化合物信息和MRM優化參數Table 1 The information of 4 mycotoxicns compounds and MRM optimization parameters

注:*表示定量離子。

結果表明:采用C18柱凈化時,4種真菌毒素回收率較PEP柱低,4種真菌毒素在PEP柱中的保留效果更為理想(回收率均大于70%);另外,C18柱對色素等極性雜質的凈化效果不好,凈化液噪音較PEP柱凈化液大,因此,本實驗最終采用PEP柱凈化。

2.2 質譜條件優化

圖1 4種真菌毒素混合標準溶液的選擇離子圖Fig.1 Ior chromatograms for 4 mycotoxins注:A. DON;B. 3-AcDON;C. 15-AcDON;D. ZEN。

根據4種真菌毒素的分子結構特征,選擇ESI-電離模式。取100 μg/L的4種真菌毒素混合標準溶液,不接色譜柱直接進樣,采用單極質譜掃描,得到4種真菌毒素的母離子,利用儀器的自動優化功能,分別對Q1、Q3、CE等進行優化,確定4種真菌毒素的母離子和子離子,以強度較大的子離子作為定量離子,強度稍小的子離子為定性離子,各化合物的定量離子及定性離子見表1。

2.3 液相色譜條件優化

根據4種真菌毒素的理化性質,采用柱填料為C18的色譜柱,比較了50 mm和100 mm兩種不同長度及1.7 μm和2.7 μm不同粒徑色譜柱的分離效果,發現采用HALO C18(2.1 mm×50 mm,2.7 μm)時,4種真菌毒素的分離效果良好,分析時間短,峰形尖銳,保留時間適中,可滿足4種真菌毒素的定量檢測要求。

測定真菌毒素通常使用的流動相為乙腈-水或者甲醇-水[16],在流動相中加入一定量氨水、乙酸銨等適合負離子模式的鹽,可顯著提高待測物的離子化效率。通過比較不同流動相體系的分離效果,發現當用乙腈-10 mmol/L乙酸銨的水溶液為流動相時,樣品色譜峰與其它雜質峰未能完全分離;當用甲醇-0.1%氨水為流動相時,待測組分達到較好的分離,最終確定甲醇-氨水體系作為流動相。進一步實驗比較甲醇與0.05%、0.1%和0.2%的氨水作為流動相時,真菌毒素的測定效果,發現采用0.1%的氨水時,靈敏度和分離度均達到最好,故采用甲醇、0.1%氨水作為流動相。優化條件下4種真菌毒素的MRM質譜圖見圖1。

2.4 定量方法學評價

表2 4種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限Table 2 Linear range,calibration curves,correlation coefficients(R2),and LOD of 4 mycotoxins

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限 將5、10、20、100、500和1000 μg/kg濃度的基質匹配混合標準工作液按1.2中的分析條件進行測定,外標法定量。以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制校準曲線。用空白糕點樣品作為基質,添加5 μg/kg濃度水平的4種真菌毒素混合標準溶液后按1.2.2方法處理后重復測定,根據3倍信噪比計算最低檢出限,校準曲線參數和方法最低檢出限見表2。由表2可知,線性范圍為5～1000 μg/kg,標準曲線的相關系數均在0.997以上。本方法的檢出限(1～1.5 μg/kg)低于國標檢出限[19-20],靈敏度更高。

表4 市售糕點樣品中4種真菌毒素的檢測結果(n=3)Table 4 Results of 4 mycotoxins residual in pastry samples(n=3)

2.4.2 方法的回收率和精密度 以空白糕點樣品加標的回收率表示方法的準確度,以回收率的相對標準偏差(RSD)表示方法的精密度。向空白糕點樣品中添加真菌毒素混合標準溶液,進行低、中、高3個水平的添加回收實驗,按1.2.2節所述實驗步驟進行處理和測定,進行6次重復實驗,計算其回收率及相對標準偏差。結果表明,糕點中4種待測物的平均回收率在74.6%～92.8%之間,相對標準偏差小于3.6%(表3),方法的準確度和精密度均符合分析要求。

表3 糕點中4種真菌毒素的添加回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and precisions of 4 mycotoxins spiked in pastry(n=6)

2.5 實際樣品分析

用建立的方法對134份糕點樣品進行檢測,結果(表4)發現:134份樣品中DON的檢出率為78.4%,最高為441.6 μg/kg,DON的平均含量為44.8 μg/kg;3-AcDON的檢出率為3.0%,最高檢出濃度為8.1 μg/kg;15-AcDON的檢出率為5.2%,最高檢出濃度為13.2 μg/kg;ZEN的檢出率為2.2%,最高濃度為50.3 μg/kg。3-AcDoN、15-AcDON和ZEN的檢出率明顯低于DON,陽性樣品總離子流圖見圖2。

圖2 某陽性糕點樣品檢出真菌毒素總離子流譜圖Fig.2 Total ion current of detected mycotoxins in one pastry sample

我國《GB 2761-2011 食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中規定谷物及其制品中DON和ZEN的限量分別為1000 μg/kg和60 μg/kg。根據本研究的檢測結果,所有樣品均符合食品安全國家標準,處于安全水平,但它們在糕點產品中的存在值得引起重視,可采用更加有效的食品保存手段以防食品在儲存時霉變。

3 結論

本文建立了一種固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯質譜儀測定預包裝糕點中4種真菌毒素的方法。該方法在4 min內完成4種真菌毒素的分析,線性范圍5～1000 μg/kg,標準曲線的相關系數均在0.997以上,DON、ZEN方法最低檢出限為1 μg/kg,3-AcDON、15-AcDON方法最低檢出限為1.5 μg/kg,方法簡便可靠,可滿足行業標準分析、檢測的需要。按照本方法對市售134份糕點樣品進行分析,發現:4種真菌毒素均有一定檢出,其中DON的檢出率達78.4%,3-AcDoN、15-AcDON和ZEN的檢出率明顯低于DON,所有樣品中4種真菌毒素含量水平均未超過食品安全國家標準限量要求。

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Determination of deoxynivalenols and zearalenone in pastry by solid phase extraction coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WANG Li-juan1,2,KE Run-hui1,2,*,AN Hong-mei1,2,YIN Jian-jun1,2,SONG Quan-hou1,2

(1.China National Research Institute of Food & Fermentation Industries,Beijing 100015,China; 2.National Food Quality Supervision and Inspection Center,Beijing 100015,China)

A method for simultaneous determination of deoxynivalenol,3-Acetyl deoxynivalenol,15-Acetyl deoxynivalenol and zearalenone in pastry had been developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS). The determination was finished within 4 minutes. The results showed that all of the 4 mycotoxins had good linearity in the range of 5～1000 μg/kg with the correlation coefficients(R2)better than 0.997. The limits of detection(LODs)of DON and ZEN were 1.0 μg/kg,3-AcDON and 15-AcDON were 1.5 μg/kg. The results of 134 pastry samples determined by the method showed that all of the 4 mycotoxins were detected in the tested samples.The detection rate were 2.2%,78.4%,3.0% and 5.2% for ZEN,DON,3-AcDON and 15-AcDON. The maximum residual contents were lower than national food safety limited requiements.

solid phase extraction;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);mycotoxins;pastry

2016-12-14

王麗娟(1987-)，女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品安全分析與檢測技術，E-mail：wanglijuan8802@163.com。

*通訊作者:柯潤輝(1980-)，博士，高級工程師，研究方向：食品安全分析與檢測技術，E-mail:runhuike@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2017)14-0031-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.007