中度嗜酸放線菌YY21液體發酵產纖溶酶條件的研究

鄧永平,劉曉蘭,*,韓 楊,艾瑞波(.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江齊齊哈爾 6006; 2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾農產品加工重點實驗室,黑龍江齊齊哈爾 6006)

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中度嗜酸放線菌YY21液體發酵產纖溶酶條件的研究

鄧永平1,2,劉曉蘭1,2,*,韓 楊1,艾瑞波1
(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾農產品加工重點實驗室,黑龍江齊齊哈爾 161006)

為了提高中度嗜酸放線菌YY21產纖溶酶的產量,本文通過單因素實驗對其液體發酵培養基和培養條件進行了研究。結果表明:發酵培養基組成為小米粉1.7%,葡萄糖2%,碳酸鈣0.2%,氯化鈉0.5%,蛋白胨0.6%;發酵條件為250 mL三角瓶裝培養基50 mL,接種量5%,在22 ℃、轉速160 r/min的條件下振蕩培養4 d。在最適條件下,放線菌YY21液體發酵產物在血纖維蛋白平板上形成溶圈面積可達到164.38 mm2,較初始產酶活力(溶圈面積87.58 mm2)提高了88%,發酵時間縮短了3 d。通過對液體發酵培養基和培養條件的研究有效地提高了中度嗜酸放線菌YY21產纖溶酶的產量。

中度嗜酸放線菌YY21,纖溶酶,液體發酵,發酵條件

血栓栓塞性疾病嚴重危害人類健康,已知構成血栓的主要成分是纖維蛋白,其由纖維蛋白原通過凝血酶的作用形成,纖維蛋白沉積在血管中形成血栓,導致心肌梗塞和其他心血管疾病[1]。纖溶酶或纖溶酶原激活劑可以直接或間接溶解血纖維蛋白[2]。纖溶酶原激活劑如鏈激酶、尿激酶、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)已被臨床用于治療血栓栓塞性疾病。然而,這些纖溶酶原激活劑類藥物還存在諸多弊端,如引起出血并發癥、半衰期短、過敏反應等,而且價格較高[3]。因此,需要積極地尋找相對更安全和較低價格的纖溶酶。

纖溶酶存在于多種動物、植物和微生物中[4-6]。微生物種類多樣,生長周期短,并且發酵技術相對較成熟,可在較短的時間內獲得大量的目的產物[7],因此,微生物發酵法成為開發新型纖溶酶的主要方法。已經從多種微生物代謝產物中分離到了纖溶酶。例如,已見報道的源自細菌的納豆激酶(NK)[8]、枯草激酶(CK)[9]等,源自中華根霉[10]、鐮刀霉[11]、枯青霉[12]、好食脈孢霉[13]等霉菌的纖溶酶,源自金針菇[14]、蛹蟲草[15]等大型真菌的纖溶酶,以及源自鏈霉菌[16]的纖溶酶。

國內外對放線菌產纖溶酶的研究甚少,僅限于鏈霉菌。Bono等[17]從鏈霉菌(Streptomycessp.)發酵液中獲得了纖溶酶。武臨專等[18]對產纖溶酶的鏈霉菌C3662進行了鑒定。Chitte等[19-20]依次對嗜熱鏈霉菌纖溶酶的發酵和純化進行了研究,獲得了高純度的纖溶酶。Ju等[21]對鏈霉菌纖溶酶進行了分離純化,并對酶學性質進行了表征。放線菌種類繁多,代謝類型多樣,對其產纖溶酶的研究還遠遠不夠,特別是對一些有特殊生活習性的放線菌的代謝產物的研究還有很大的空間[22]。

嗜酸放線菌(Acidophilicactinomycetes)廣泛分布于酸性環境中,可以產生耐酸的胞外酶,如幾丁質酶、蛋白酶、淀粉酶等,在酸性土壤有機物的降解循環中起著重要作用。此外,由于大多數真菌適宜于酸性環境中生存,所以嗜酸放線菌也是極具潛力的抗真菌活性物質的產生者[23]。從嗜酸放線菌的代謝產物中開發新的天然生物活性物質,對新型藥物的開發具有重要意義。在前期研究中,筆者發現中度嗜酸放線菌YY21的代謝產物中存在較高活力的纖溶酶[24]。本文對中度嗜酸放線菌YY21液體發酵產纖溶酶的培養基和培養條件進行了研究,以期獲得高產纖溶酶的發酵工藝,為該酶的進一步研究奠定基礎,為纖溶酶提供新的來源。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

中度嗜酸放線菌菌株YY21(Actinomycetesp.) 保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心,保藏號CGMCC No.5816;牛血纖維蛋白原、牛凝血酶 為中國醫學科學院天津血研所產品;其余試劑 均為國產分析純;GYM固體培養基 葡萄糖0.4%,酵母膏0.4%,麥芽浸膏1%,碳酸鈣0.1%～0.2%,瓊脂1.8%,pH6.7;GYM液體培養基 葡萄糖0.4%,酵母膏0.4%,麥芽浸膏1%,碳酸鈣0.1%～0.2%,pH6.7;小米粉培養基 小米粉2%,葡萄糖2%,碳酸鈣0.2%,氯化鈉0.5%,蛋白胨0.3%,pH7.2-7.4;高氏合成一號培養基 可溶性淀粉2%,KNO30.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,NaCl 0.05%,K2HPO40.05%,Fe2(SO4)30.001%,pH7.4;黃豆粉培養基 蔗糖 2%,黃豆粉 2%,pH7.0;豆餅粉培養基 豆餅粉2%,葡萄糖2%,pH自然;玉米黃粉培養基 玉米黃粉2%,葡萄糖2%,pH自然;豆粕粉培養基 豆粕粉2%,葡萄糖2%,pH自然；PDA液體培養基 稱取去皮馬鈴薯200 g,切成小塊,加1000 mL水煮沸30 min,用雙層紗布過濾成清液,加水至1000 mL,然后加入20 g葡萄糖完全溶解,pH自然。

PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;雙層振蕩培養箱DZP-2F 金壇市城西崢嶸儀器廠;pHS-25型酸度計 上海精密科學儀器有限公司;himac CF15RX冷凍離心機 天美科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 放線菌YY21生長曲線的測定 采用GYM液體培養基作為種子培養基,250 mL三角瓶中加入GYM培養基50 mL,將在GYM斜面培養基活化后的菌株接入種子培養基,28 ℃、180 r/min振蕩培養,分別在培養0、6、12、18、24、29、32、34、36、38、40、44、48、52、56、60 h取樣,測定生物量。

1.2.2 液體發酵培養基的確定 采用八種液體培養基(具體名稱見表1)培養放線菌YY21,250 mL三角瓶中加入液體培養基50 mL,接種量為培養基體積的5%,28 ℃、180 r/min振蕩培養,分別于2、3、4、5、6、7 d取樣,測培養液pH和纖溶酶的活性。

1.2.3 培養基碳源的確定 以小米粉培養基為初始發酵培養基,分別添加蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和葡萄糖,濃度均為2%,接種量為培養基體積的5%,28 ℃、180 r/min振蕩培養4 d,測定培養液中纖溶酶的活性。

1.2.4 底物配比的確定 以小米粉為主要碳源,兼做輔助氮源,以蛋白胨為主要氮源,以2%的葡萄糖為速效碳源,小米粉與蛋白胨占培養基中總含量2.3%不變,研究二者添加比例對產酶活力的影響。

1.2.5 培養條件對菌株YY21產纖溶酶的影響 通過單因素實驗對影響菌株YY21液體發酵產纖溶酶的培養條件進行研究,包括接種量(接種量分別為1%、3%、5%、7%、10%和15%,在28 ℃、180 r/min振蕩培養4 d)、培養溫度(培養溫度分別為22、24、26、28、30、32、34、37 ℃,接種量5%,180 r/min振蕩培養4 d)和搖床轉速(轉速分別為140、160、180、200、220 r/min,接種量5%,在28 ℃培養4 d),并且在后續的實驗中使用最佳條件。

1.2.6 粗酶液的制備 發酵結束后,將發酵液在4 ℃、10000 r/min離心10 min,收集上清液即為粗酶液。

1.2.7 纖溶酶活力的測定 參照Liu的方法[15],采用血纖維蛋白平板法測定纖溶酶活力。取10 μL粗酶液點加于平板表面,37 ℃保溫6 h后測溶圈面積。纖溶酶的活力與其在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積正相關,因此,以水解血纖維蛋白后在平板上形成的溶圈面積大小表示菌株產纖溶酶活力的高低。

1.2.8 生物量的測定 采用稱干重法[25]。

1.2.9 數據統計 利用Excel 2003和SPSS 11.5分析軟件對數據進行統計分析,并結合Duncan氏法做多重比較,實驗均重復三次,結果用平均值±標準差表示(p<0.05)。

2 結果與討論

2.1 放線菌YY21生長曲線的測定

放線菌YY21生長曲線如圖1所示。在0～12 h內,菌體生長處于延遲期。在12 h后,菌體生長逐漸進入快速生長期,在24 h之后菌體干重增加速率加快,培養36 h時,菌體生物量達到最大,菌體濃度為0.029 g/mL。隨后,菌體生長逐漸進入衰亡期。

圖1 放線菌YY21生長曲線Fig. 1 The growth curve of the strain YY21

處于快速生長期的菌種酶系活躍,代謝旺盛,可以縮短發酵的延遲期,最適宜作為發酵的種子[25]。因此,分別將培養12～36 h的新鮮種子液進行發酵實驗,培養基為GYM培養基。由圖2可知,接入培養30 h的種子液時發酵產酶活力最高,所以,確定種子培養時間為30 h。

表1 發酵時間對放線菌發酵液pH的影響Table 1 Effect of fermentation time on the pH of the fermentation liquor of the strain YY21

表2 發酵時間對纖溶酶活力影響(mm2)Table 2 Effect of fermentation time on the enzyme production of the fermentation liquor of the strain YY21(mm2)

圖2 種齡對纖溶酶產量的影響Fig.2 Effect of the age of inoculum on the fibrinolytic enzyme production

2.2 培養基及發酵時間對產纖溶酶的影響

采用八種液體培養基培養放線菌YY21,發酵液pH隨著培養時間的變化見表1,發酵液中纖溶酶活力見表2。

如表1和表2所示,高氏一號培養基為合成培養基,營養成分簡單,含有速效碳源和氮源,有利于菌體生長,但是不利于積累代謝產物,而且可能缺乏產酶誘導物,導致其發酵產物中不含纖溶酶;豆餅粉培養基中也沒有檢測到酶活力;黃豆粉培養基、玉米黃粉培養基和豆粕培養基中富含蛋白質,需要經酶解為小分子物質才可以被菌體利用,導致產纖溶酶周期延長、酶活力低;同時,由表1可知,在培養菌株YY21過程中,高氏一號培養基、豆餅粉培養基、玉米黃粉培養基和豆粕粉培養基隨培養時間的延長培養環境逐漸呈酸性,適合菌體生長,但是并不適合產纖溶酶,GYM、PDA和小米粉培養基的pH維持在中偏堿性,酶活力也較高,由此可以推測菌株YY21最適產酶pH可能是中偏堿性。GYM、PDA和小米粉培養基發酵液中纖溶酶活力較高,其中小米粉發酵液中酶活相對最高(109.32 mm2),在培養第2 d時暫時降低可能是培養基pH下降引起的,隨后pH逐漸又上升至6.5左右,酶活力也隨之升高,培養至第4 d酶活力最高,在血纖維蛋白平板上形成109.32 mm2的溶圈。

小米粉培養基為天然培養基,較GYM培養基營養豐富,小米含碳水化合物約74%～76%,蛋白質9.2%～14.7%,脂肪3.0%～4.6%,并富含維生素B1、B12[26],而且小米來源廣泛,價格也較葡萄糖、麥芽浸膏(GYM培養基組分)低,從產酶活力以及經濟的角度綜合考慮,最終確定最適發酵培養基為小米粉培養基,最佳培養時間為4 d。

2.3 碳源對產纖溶酶的影響

碳源是微生物生長繁殖需求量最大的營養物質,可構成菌體及目的產物的碳骨架、為其生長繁殖提供發酵能。按干重計算,一個典型的細胞中碳元素約占50%,并且在生物大分子中,碳也是最主要的一種元素。碳源對產纖溶酶的影響見圖3。

圖3 培養基中碳源種類對纖溶酶產量的影響Fig.3 Effect of different carbon sources in culture medium on the fibrinolytic enzyme production

如圖3所示,培養基中添加可溶性淀粉時,放線菌YY21產酶效果較差,結果與嗜熱鏈霉菌S.megasporusSD5[19]、白色鏈霉菌StreptomycesalbusHS1類似[27];葡萄糖為單糖,可以作為速效碳源供菌體生長代謝之用,與遲效碳源小米粉協同使用,獲得較好產酶效果,溶圈面積達到130.5 mm2。葡萄糖對鏈霉菌C-3662發酵產纖溶酶也有促進作用[18],但是,抑制某些真菌產酶[28]。對培養基中添加葡萄糖濃度進行研究。如圖4所示,葡萄糖添加量為2%時酶的活力最高。

圖4 培養基中葡萄糖濃度對纖溶酶產量的影響Fig.4 Effect of concentration of glucose in culture medium on the fibrinolytic enzyme production

2.4 底物配比的確定

培養基中碳源和氮源的比例(C/N)對微生物生長及產物的合成有很大影響。若培養基中氮源過多,會引起微生物生長過于旺盛,不利于產物的積累;氮源不足則菌體生長過慢。碳源供應不足時容易引起菌體衰老或自溶[25]。本實驗對培養基中小米粉與蛋白胨的添加比例進行了研究,實驗結果見表3。

如表3所示,與初始配比比較,C組配比最適宜發酵產酶,溶圈面積達到150.17 mm2。H組為沒有添加蛋白胨的小米粉培養基,發酵液不產酶,而添加蛋白胨的其它組產酶量顯著高于H組(p<0.05),說明蛋白胨或者其酶解產物對產纖溶酶可能有一定的誘導作用。F、G兩組為沒有添加小米粉的培養基,纖溶酶活力較添加小米粉的組低,說明,添加小米粉有利于YY21菌株產纖溶酶。由表3確定,培養基中小米粉添加量為1.7%,蛋白胨添加量為0.6%。

表3 小米粉/蛋白胨添加比例Table 3 Different ratio of millet to peptone

2.5 培養條件對產纖溶酶活力的影響

2.5.1 接種量對酶活力的影響 采用較大的接種量可縮短菌體生長達到穩定期的時間,使產物的合成提前。但是,接種量過大,可能使菌體生長過快,培養液粘稠度增加,溶氧不足,從而影響產物的合成;此外,接種量過大也會導致成本增加。接種量對產酶的影響見圖5。

圖5 接種量對產酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum size on the fibrinolytic enzyme production

如圖5所示,接種量5%時中度嗜酸放線菌產纖溶酶活力最高,增大接種量不能進一步提高產酶活力,降低接種量纖溶酶的活力有所降低,因此,選擇5%的接種量進行后續實驗。

2.5.2 培養溫度對酶活的影響 當微生物生長繁殖處于最適生長溫度時,生長速度最快,代時也最短,但此時的產酶活力并不一定最高。在較高溫度下,細胞分裂較快,但是持續時間短,易老化。而在較低溫度時,細胞雖然生長緩慢,但是持續時間較長,所以產酶量反而較高。同樣,發酵速度和溫度之間也有類似關系[29]。因此,研究不同微生物在生長或積累代謝產物階段時的不同最適溫度,對提高發酵生產的效率具有十分重要的意義。溫度對產酶的影響見圖6。

圖6 發酵溫度對產酶活力的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on the fibrinolytic enzyme production

如圖6所示,溫度對菌體產酶活力具有較大影響,在22～28 ℃范圍內,產纖溶酶活力較高,并且較穩定,溫度達到30 ℃時產酶活力明顯下降(p<0.05),且在30～37 ℃之間,產酶活力普遍較低,可見,溫度升高抑制菌體產酶。通過對圖6中酶活力的比較,確定最適產酶溫度為22 ℃。嗜熱鏈霉菌S.megasporusSD5的最適培養溫度為55 ℃[19],白色鏈霉菌S.albusHS1的最適產酶溫度為28 ℃[27],與之相比,放線菌YY21纖溶酶的生產能耗更低。

2.5.3 轉速對纖溶酶的影響 放線菌屬于好氧菌,適當的提高搖床轉速有利于菌體生長。轉速實驗結果見圖7。

圖7 搖床轉速對產酶活力的影響Fig.7 Effect of rotation speed of erlenmeyer flask on the fibrinolytic enzyme production

由圖7可見,在其他培養條件不變的情況下,降低搖床轉速時,酶活力下降,可能是因為溶氧量降低導致菌體代謝緩慢,產酶能力下降;提高搖床轉速時,溶氧量雖然隨之提高,但是剪切力繼續增加,使成熟菌絲橫隔間空泡的增大,導致部分菌絲體片斷無法生長,影響了產酶[20]。由此可確定最佳轉速為160 r/min。

2.6 放線菌YY21在GYM培養基和小米粉培養基中液體發酵產酶活力的比較

在前期研究中采用GYM培養基培養菌株YY21產纖溶酶,培養條件:GYM培養基,28 ℃,180 r/min,發酵7 d[24]。本文中使用小米粉培養基培養菌株YY21,培養條件:小米粉培養基(小米粉1.7%,葡萄糖2%,碳酸鈣0.2%,氯化鈉0.5%,蛋白胨0.6%),5%接種量,22 ℃、160 r/min發酵4 d。發酵結束后離心取上清,測定纖溶酶活力。結果表明,菌株YY21在小米粉培養基中產酶的活力明顯高于GYM培養基[溶圈面積(87.58±0.72) mm2],溶圈面積達到(164.38±0.19) mm2,即酶活提高了88%,而且產酶周期縮短為4 d。

3 結論

本文以中度嗜酸放線菌YY21為菌種,通過單因素實驗,對其液體發酵產纖溶酶的培養基組分和培養條件進行了研究。發酵培養基由1.7%小米粉、2%葡萄糖、0.2%碳酸鈣、0.5%氯化鈉和0.6%蛋白胨組成,液體種子種齡30 h,接種量5%,在22 ℃、160 r/min培養4 d,纖溶酶粗酶液在血纖維蛋白平板上形成溶圈面積可達到164.38 mm2,比前期使用GYM培養基產酶活力提高了88%,而且產酶周期縮短了3 d。

中度嗜酸放線菌YY21在pH4～5的環境中依然可以產纖溶酶,具有開發為口服的耐胃酸的纖溶酶制劑的潛力,而且產酶溫度較目前已知的一些鏈霉菌產酶溫度低,有利于節約液體發酵能耗,對于進一步研究工藝擴大有重要意義。

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Study on liquid fermentation conditions for fibrinolytic enzyme production by middle acidophilicActinomycetesp. YY21

DENG Yong-ping1,2,LIU Xiao-lan1,2,*,HAN Yang1,AI Rui-bo1

(1.College of Food and Biotechnology,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China)

In the current study,liquid fermentation medium and culture conditions were studied for fibrinolytic enzyme production from middle acidophilicActinomycetesp. YY21 by single factor experiment. The results showed that the fermentation medium consisted of 1.7% of millet,2% of glucose,0.2% of calcium carbonate,0.5% of sodium chloride and 0.6% of peptone. The optimized fermentation conditions were as follows:50 mL liquid medium in 250 mL flasks,inoculation volume 5%,rotate speed 160 r/min,culture time 4 d and culture temperature 22 ℃. Under the optimized conditions,the degradation zone area ofActinomycetesp. YY21 product by liquid fermentation reached 164.38 mm2in the fibrin plate,increasing by 88% than that of original conditions(87.58 mm2). Meanwhile,the fermentation time was decreased by 3 d. The production of fibrinolytic enzyme from middle acidophilicActinomycetesp. YY21 was enhanced effectively by study of liquid fermentation medium and culture conditions.

middle acidophilicActinomycetesp. YY21;fibrinolytic enzyme;liquid fermentation;fermentation conditions

2017-01-16

鄧永平(1978-)，女，碩士，副教授，研究方向：微生物學、酶學，E-mail：913913_monkey@163.com。

*通訊作者:劉曉蘭(1962-)，女，博士，教授，研究方向：發酵工程、應用酶學，E-mail：liuxiaolan001@126.com。

國家自然科學基金項目(31301414)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)14-0131-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.026