超聲對木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布的影響

張 杰,丁 琳,白 鴿,鄭德娟,曹雁平,2,*(.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 00048; 2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 00048)

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超聲對木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布的影響

張 杰1,丁 琳1,白 鴿1,鄭德娟1,曹雁平1,2,*
(1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048; 2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

本文探討了超聲對木瓜蛋白酶酶解產物分子量大小及分布的影響。以牛血清白蛋白為底物,采用高效液相色譜法測定游離酶和固定化酶在超聲和非超聲作用下的酶解產物肽分子量大小及分布情況。結果表明,游離酶和固定化酶在超聲和非超聲條件下,酶解產物肽分子量大小及分布有一定的差異。非超聲條件下,游離木瓜蛋白酶酶解效果明顯比固定化酶酶解效果要好。比較超聲條件下游離木瓜蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量大小及分布情況發現:游離木瓜蛋白酶超聲條件下酶解肽主要分布在180～1000 Da、1000～5000 Da這兩個范圍內,而固定化木瓜蛋白酶超聲條件下酶解肽在<180 Da所占比例比較大。

游離酶,固定化酶,超聲,高效液相色譜法,肽分子量分布

生物活性肽是具有抗氧化、降血壓、抗血栓、減脂、呈味、免疫活性等的特定肽類的總稱,這些肽有2～20個氨基酸,分子質量小于6000 Da[1]。多數生物活性肽是以非活性狀態存在于蛋白質的長鏈中,當用適當的蛋白酶水解時,其分子片段與活性被釋放出來[2]。酶法生產小分子肽已在世界范圍內引起關注,成為當今世界相關領域研究的主要方向[3]。小分子肽是經大分子蛋白進一步酶解精制而成的,其生理活性取決于酶解后的肽分子量大小及氨基酸序列,所以測定肽的相對分子量大小顯得尤為重要。近年來,高效液相色譜法因其準確性高、重現性好,能準確地表示出肽類的分子量大小及分布而得到廣泛應用[4-5]。

自上世紀70年代開始,固定化酶因其穩定性高、可重復利用、易與產物分離、可實現自動化生產而逐漸成為酶工程領域中最為活躍的研究方向之一[6]。但由于包埋法制備固定化酶的載體材料會對分子的擴散傳質產生抑制作用,酶活力往往會有不同程度的損失[7]。為提高固定化酶活力,使固定化酶更符合工業化生產,國內外學者進行了大量研究。肖瓊等[8]發現超聲處理玉米秸稈的纖維素酶時酶解得率比未加超聲波時酶解得率提高了48.3%。黃卓烈等[9]利用超聲處理酵母過氧化氫酶(CAT)發現酵母多酚氧化酶活性的提高是由超聲處理對酶分子構象的進行改變而引起的。Basto等[10]研究了20、150、500 kHz的超聲波處理對酶活性的影響,研究證明150 kHz條件下的酶解效果最好。目前關于超聲波處理對蛋白酶酶解的影響已經有不少文獻報道,但是對超聲處理固定化酶來控制酶解產物肽分子量大小的研究還比較少。

本文以游離酶木瓜蛋白酶與包埋法制備出的海藻酸鈉-殼聚糖固定化木瓜蛋白酶為研究對象,采用高效液相色譜法對不同超聲功率和聲強作用下游離酶和固定化酶酶解產物分子量大小及分布進行測定,明確超聲條件對酶解產物分子量分布的影響,為生物活性肽的開發提供了一定的實驗數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海藻酸鈉、殼聚糖、無水碳酸鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、無水氯化鈣 國藥集團化學試劑有限公司;福林酚試劑、牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶(測定活力4.96×105U/g) Sigma公司;L-谷胱甘肽 拜爾迪生物技術有限公司;乙醇、乙腈、三氟乙酸 北京邁瑞達科技有限公司;肽標準品:細胞色素C(Mw12355)、抑肽酶(Mw6511.44)、桿菌肽(Mw1422.69)、甘氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸(Mw451.2)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Mw189.1) 北京半夏科技發展有限公司。

JXD-02型多頻槽式處理系統 北京金星超聲波技術設備有限公司;DC-2006型低溫恒溫水浴 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司;UVmini-1240型紫外可見分光光度計 日本島津公司;CP214電子分析天平 上海市奧豪斯儀器有限公司;FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省鞏義市予華有限責任公司;Waters2695高效液相色譜儀 Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化木瓜蛋白酶的制備 稱取0.57 g海藻酸鈉和0.03 g殼聚糖溶于20 mL pH7.0的Tris-鹽酸緩沖液中,于60 ℃磁力攪拌加熱至溶解并攪拌均勻,冷卻至室溫,加入1 mL 0.005 g/mL木瓜蛋白酶液,攪拌均勻。將此混合液緩慢滴入0.6 mol/L氯化鈣溶液中形成小球,置于4 ℃冰箱下30 min。用去離子水清洗,濾紙擦干,備用[11]。

1.2.2 肽分子量大小及分布的測定

1.2.2.1 測定條件 色譜柱為TSKgelG2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)凝膠柱;流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(體積比);紫外檢測器的波長設為220 nm;泵流速設為0.5 mL/min;柱溫設為30 ℃;進樣體積為10 μL。

1.2.2.2 分子量校正曲線 分別用流動相制成質量分數為1 mol/mL的上述不同分子量肽標準品溶液,用孔徑0.45 μm聚四氟乙烯膜過濾后進樣,得到一系列標準品的色譜圖。以各標準品相對分子量的對數(lgMw)對保留時間作圖,得到標準曲線和線性回歸方程。

1.2.2.3 樣品分子量的確定 不同超聲條件下酶解樣品處理后進入HPLC檢測,把色譜圖中各個峰的保留時間代入1.2.2.2所得線性回歸方程中,計算酶解產物肽分子量的大小,根據色譜峰各個峰峰面積計算不同肽分子量所占的比例。

1.2.3 木瓜蛋白酶的酶解條件 準確量取20 μL游離木瓜蛋白酶或者稱取1 g固定化木瓜蛋白酶,以保證游離酶和固定化酶酶活力均維持在6 U/g,加入3 mL谷胱甘肽和10 mL牛血清白蛋白,在酶解pH7、酶解溫度為40 ℃的條件下反應30 min,于90 ℃高溫加熱滅酶10 min。靜置分層,取上清液在10000 r/min、4 ℃的條件下離心20 min,取上清液,用孔徑0.45 μm聚四氟乙烯膜過濾,備用。

1.2.4 游離木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白

1.2.4.1 非超聲條件下游離木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白 準確量取20 μL游離木瓜蛋白酶,按上述1.2.3酶解條件酶解牛血清白蛋白,用1.2.2測定。

1.2.4.2 超聲條件下游離木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白 準確量取20 μL游離木瓜蛋白酶,在超聲頻率分別為28、40、50、135 kHz,超聲聲強分別為0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2,超聲溫度為40 ℃的條件下,按上述1.2.3酶解條件酶解牛血清白蛋白,用1.2.2測定。

1.2.5 固定化木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白

1.2.5.1 非超聲條件下固定化木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白 稱取1 g固定化木瓜蛋白酶,按上述1.2.3酶解條件酶解牛血清白蛋白,用1.2.2測定。

1.2.5.2 超聲條件下固定化木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白 稱取1 g固定化木瓜蛋白酶,在超聲頻率分別為28、40、50、135 kHz,超聲聲強分別為0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2,超聲溫度為40 ℃的條件下,按上述1.2.3酶解條件酶解牛血清白蛋白,用1.2.2測定。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次,實驗各值均為三個平行數據的均值。數據統計結果與分析應用Microsoft Excel 2007和Origin 9.0軟件。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

高效液相色譜法所用色譜柱為TSK凝膠柱,其原理是按分子量大小對物質進行洗脫分離。樣品在洗脫過程中大分子無法進入凝膠顆粒的孔徑中,只能從流動相中以較快的速度流出層析柱,而小分子則能自由出入凝膠顆粒中,因此就要花費較長的時間流經柱床,從而使不同大小的分子得以分離[12]。

表1是各標準品的出峰時間,以各標準品相對分子量的對數(lgMW)對保留時間作圖,得到分子校正曲線方程為y=-0.251x+7.053,R2=0.971。

表1 各標準品的出峰時間Table 1 Peak time of each standard

圖1 各標準品的相對分子量的對數與保留時間的關系曲線Fig.1 Curve of logarithm of relative molecular weight and retention time of each standard

2.2 游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布

2.2.1 28 kHz下不同超聲聲強對游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量的影響 酶解產物分子量大小及分布結果如圖2所示。

圖2 28 kHz頻率下游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布Fig.2 Molecular weight distribution of papain hydrolyzate under 28 kHz frequency

由圖2可知,游離木瓜蛋白酶在非超聲、超聲頻率28 kHz時,肽分子量在<180 Da和>10000 Da范圍內所占比例比較小,多集中在180～10000 Da之內。隨著超聲聲強的增大,肽分子量在180～1000 Da范圍內所占比例有所增加,變化比較明顯?？赡苁怯捎谀竟系鞍酌缸饔梦稽c廣泛，并具有低強度的酶切特異性,所以各個肽分子量分布范圍均比較多。

2.2.2 40 kHz下不同超聲聲強對游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量的影響 酶解產物分子量大小及分布結果如圖3所示。

圖3 40 kHz頻率下游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of papain hydrolyzate under 40 kHz frequency

由圖3可知,游離木瓜蛋白酶在非超聲、超聲頻率40 kHz時酶解產物肽分子量分布差異不大,多集中于180～10000 Da之間。其中,隨著超聲聲強的增加肽分子量在180～1000 Da范圍內有所增加,1000～5000 Da范圍變化比較小,5000～10000 Da范圍內先增加后有所減少。張艷艷[13]發現超聲波破壞了谷朊蛋白的網絡結構,適當的超聲波預處理使得蛋白分子分布更加均勻,而過大的超聲波預處理功率又使得蛋白分子重新聚集折疊，不利于蛋白分子酶解,這與本研究的結論一致。

2.2.3 50 kHz下不同超聲聲強對游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量的影響 酶解產物分子量大小及分布結果如圖4所示。

圖4 50 kHz頻率下游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布Fig.4 Molecular weight distribution of papain hydrolyzate under 50 kHz frequency

由圖4可知,游離木瓜蛋白酶在超聲頻率50 kHz時,隨著超聲聲強的增加,酶酶解產物肽分子量分布有明顯變化。在0.05 W/cm2時肽分子量分布比較集中,隨著超聲聲強增加,分子量在180～5000 Da的肽顯著增加，而>10000 Da的肽顯著減少(p<0.05)。Giizey等[14]研究發現用高強度超聲處理牛血清蛋白會引起蛋白α螺旋結構的含量增加,與本研究的趨勢一樣。

2.2.4 135 kHz下不同超聲聲強對游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量的影響 酶解產物分子量大小及分布結果如圖5所示。

圖5 135 kHz頻率下游離木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution of papain hydrolyzate under 135 kHz frequency

由圖5發現,游離木瓜蛋白酶在135 kHz頻率下酶解產物肽分子量主要集中在180～10000 Da范圍內。隨著超聲聲強增加,分子量在180～5000 Da的肽顯著增加,分子量在5000～10000 Da的肽所占比例有所減少,在0.45 W/cm2時變化最為明顯。

朱國輝等[15]發現經超聲不同功率處理菠蘿果蛋白酶的酶活較非超聲均有所增加,且最適功率為100 W,超聲功率再增加,酶活反而會有所降低,這與本研究的趨勢一致。

超聲對游離酶酶促反應的影響主要集中于對酶和底物結構的改變。Ma等[16]研究了高強度超聲場對堿性蛋白酶的作用機理發現超聲場對堿性蛋白酶的酶活力和分子結構均有影響。任曉峰[17]利用原子力顯微鏡觀察發現,超聲波使得玉米醇溶蛋白結構被破壞,導致蛋白顆粒疏松,蛋白酶更容易進入玉米醇溶蛋白顆粒內部,有利于疏水性氨基酸的釋放。

2.3 固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布

2.3.1 28 kHz下不同超聲聲強對固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量的影響 酶解產物分子量大小及分布結果如圖6所示。

圖6 28 kHz頻率下固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of immobilized papain hydrolyzate under 28 kHz frequency

由圖6可知,固定化木瓜蛋白酶非超聲條件下酶解效果比較差,分子量分布范圍在>10000 Da最多,高達93.81%,其他分子量范圍所占總比例不足10%,與游離酶酶解產物分子量分布相比有明顯差異?？赡苁怯捎诿腹潭ɑ^程中載體與酶之間的相互作用,酶活力往往會有不同程度的損失,所以固定化酶酶解效果往往不好。在超聲頻率為28 kHz,隨著超聲聲強的增加，肽分子量分布變化比較明顯,其中<180 Da肽分子量呈現先增加后降低的趨勢,在0.35 W/cm2時所占比例最大。

2.3.2 40 kHz下不同超聲聲強對固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量的影響 酶解產物分子量大小及分布結果分別如圖7所示。

圖7 40 kHz頻率下固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布Fig.7 Molecular weight distribution of immobilized papain hyrolyzate under 40 kHz frequency

由圖7可知,固定化木瓜蛋白酶在超聲頻率為40 kHz時,隨著超聲聲強的增大,肽段分子量<180 Da所占比例變化明顯,呈現先增加后降低的趨勢,在0.25 W/cm2達到最大值。由此認為一定的超聲條件下可以提高固定化木瓜蛋白酶的酶解活性,故超聲對提高固定化酶酶解效果有一定影響。Govind等[18]發現超聲可以促進固定化酶的酶活,并且隨著超聲功率的增加,酶活力呈現先增大后減小的趨勢,并在100 W時超聲作用最明顯,這與本研究的趨勢一致。

2.3.3 50 kHz下不同超聲聲強對固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量的影響 酶解產物分子量大小及分布結果分別如圖8所示。

圖8 50 kHz頻率下固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布Fig.8 Molecular weight distribution of immobilized papain hydrolyzate under 50 kHz frequency

由圖8可知,固定化木瓜蛋白酶在超聲頻率為50 kHz時,隨著超聲聲強的增大，肽段分子量<180 Da所占比例變化明顯,呈現先增加后降低的趨勢,在0.25 W/cm2達到最大值。說明固定化酶在小功率超聲作用條件下酶解效果不明顯。隨著超聲聲強增加小分子多肽所占比例顯著增加。朱少娟等[19]的研究結果表明,將胰蛋白酶、底物分別進行超聲處理,經紫外和熒光光譜分析發現一定的超聲波可能使酶及底物分子構象發生變化,提高胰蛋白酶水解活性。由此證明超聲對提高固定化酶酶解效果有顯著影響。

2.3.4 135 kHz下不同超聲聲強對固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量的影響 酶解產物分子量大小及分布結果分別如圖9所示。

圖9 135 kHz頻率下固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量分布Fig.9 Molecular weight distribution of immobilized papain hydrolyzate under 135 kHz frequency

由圖9可知,固定化木瓜蛋白酶在超聲頻率為135 kHz時,隨著超聲聲強的增大,肽段分子量<180 Da所占比例變化明顯。在超聲功率為0.25 W/cm2時，分子量大于10000 Da所占的比例最大,高達60.98%。超聲對固定化酶酶促反應的影響與載體結構、酶結構、底物結構的改變有關。Lin Chen等[20]研究發現,酶解前適當的預處理能夠使蛋白質原本致密的結構變的松散,暴露其內部的作用位點,使水解速度加快,提高蛋白質的水解度,利于酶解。黃正華等[21]報道,超聲促進了木瓜蛋白酶作用底物酪蛋白在海藻酸鈉及殼聚糖凝膠中的擴散作用。朱少娟等[19]研究發現一定的超聲波可能使酶及底物分子構象發生變化,提高胰蛋白酶水解活性。

3 結論

本文采用高效液相色譜法研究了超聲對木瓜蛋白酶酶解產物分子量大小及分布的影響,結果表明,游離酶和固定化酶在非超聲及超聲條件下,酶解產物肽分子量大小及分布有一定的差異。非超聲條件下,游離木瓜蛋白酶酶解效果明顯比固定化酶酶解效果要好。比較超聲條件下游離木瓜蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶酶解產物分子量大小及分布情況發現:游離木瓜蛋白酶超聲條件下酶解肽主要分布在180～1000、1000～5000 Da這兩個范圍內,而固定化木瓜蛋白酶超聲條件下酶解肽在<180 Da所占比例比較大。

酶法制備生物活性肽生產成本低,產品安全性高,生產條件溫和,水解進程易于控制,可定位生產特定的肽,能較好地滿足生產需要,具有良好的應用前景。本文只是針對超聲處理輔助酶解控制產物分子量方面進行了一定程度的研究,但是還需要對蛋白質預處理技術和可控酶解技術方面進行深入探討。

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Effect of ultrasonic on molecular weight distribution of papain hydrolyzate

ZHANG Jie1,DING Lin1,BAI Ge1,ZHENG De-juan1,CAO Yan-ping1,2,*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China; 2.Beijing Engineering Research Center for Food Additives and Ingredients,Beijing 100048,China)

The influence of ultrasonic on the molecular weight and distribution of papain hydrolyzate was discussed in this paper. The enzymolysis products of free and immobilized enzymes were determined by high performance liquid chromatography(HPLC)with bovine serum albumin as substrate. The results showed that there were significant differences in the molecular weight and distribution of the hydrolyzate peptide between free and immobilized enzymes under ultrasound and non-ultrasound conditions. The molecular weight and distribution of free papain and immobilized papain hydrolyzate under ultrasonic conditions were found to be mainly distributed in the range of 180～1000 Da and 1000～5000 Da. The proportion of hydrolyzed peptides in immobilized papain under the condition of<180 Da was relatively large.

free enzyme;immobilized enzyme;ultrasonic;high performance liquid chromatography;peptide molecular weight distribution

2015-01-05

張杰(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：固定化酶，E-mail：zjzxw722@163.com。

*通訊作者:曹雁平(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品化學與安全，E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31371722)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.023