基因組學研究Csu基因簇在生物被膜生成過程中的作用

李海濤，張魯濤，李 帥，王伯麗，齊天杰，李宏林

(河北醫科大學第二醫院呼吸內一科，河北 石家莊 050000)

·論 著·

基因組學研究Csu基因簇在生物被膜生成過程中的作用

李海濤，張魯濤，李 帥，王伯麗，齊天杰，李宏林

(河北醫科大學第二醫院呼吸內一科，河北 石家莊 050000)

目的探討基因組學研究Csu基因簇在多藥耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜生成過程中的作用。方法選取我院臨床檢驗科細菌室分離篩選的多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株，取該菌株致病力最強的快速生長期和生物被膜期，提取2個不同時期的mRNA進行基因組比對研究。將樣本的基因序列與公共數據庫進行比較，進行功能注釋。結果同一菌株在菌體快速生長期和生物被膜期2種狀態下基因表達差異有統計學意義(P<0.05)。生物被膜狀態的菌體較快速生長期的菌體有106個基因的表達上調，其中CsuA/B/C/D基因簇表達呈顯著升高，92個基因出現了表達的下調。結論CsuA/B/C/D基因簇在生物被膜生成和形態維持中發揮著極其重要的作用。細菌生物被膜形成過程中，菌體的初始黏附依賴于CsuA/B/C/D基因的顯著表達。CsuA/B/C/D基因簇介導菌毛的生物合成，還介導菌體分泌表面活性物質和細胞外基質，這些是生物被膜形成早期階段所必需的。

鮑氏不動桿菌；抗藥性，多藥；基因檢測

目前最具威脅的院內感染致病菌包括屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬，這些超級細菌對目前大多數可用的抗生素均耐藥[1]。多藥耐藥的鮑曼不動桿菌目前已經成為醫院院內感染的重要病原菌，常常會引起廣泛的院內感染[2-3]。鮑曼不動桿菌可以長期存活，造成慢性定植和感染的反復發生，主要是由于細菌菌體生物被膜的形成。本研究應用高通量轉錄組基因測序方法，檢測相關調控因子在生物被膜生成中的影響，探討生物被膜獨特的生長方式以及細菌菌體長期定植造成反復感染的機制，報告如下。

1 資料與方法

1.1 收集和篩選菌株 菌株來自河北醫科大學第二醫院臨床檢驗科細菌室，對收集的菌株進行篩選和藥敏檢測，剔除非鮑曼不動桿菌及非多藥耐藥菌株，收集多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株。多重耐藥鮑曼不動桿菌是指對5類目前應用的抗生素有3類或者3類以上耐藥。

1.2 樣本的制備 試驗菌株選取分離篩選的多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株中數量最多的優勢菌株Acinetobacter baumannii BJAB0868進行研究。取該菌株致病力最強的快速生長期和生物被膜期，提取2個不同時期的mRNA進行轉錄組基因比對研究。將多重耐藥Acinetobacter baumannii BJAB0868接種于無菌血培養皿生長8 h，酶標儀測定600 nm吸光度值(檢測OD600=0.4)，獲得快速生長期菌株。以無菌肉湯配制濃度為0.7 Mac的菌懸液，生長在50 mL微發酵罐中，持續在37 ℃恒溫無菌培養箱內培養96 h，使得生物被膜均勻生長在微發酵罐下層表面。每個微發酵罐加入1%結晶紫2 mL，染色30 min。再用PBS清洗3次，無菌環境中常溫風干，再加入2 mL 95%的乙醇，脫色15 min，用酶標儀測定600 nm吸光度值。均值為空白對照的2倍以上者為生物膜形成陽性。然后電子顯微鏡鏡下觀察生物被膜生長情況。

1.3 樣本mRNA的提純和提取 選取多重耐藥Acinetobacter baumannii BJAB0868進行研究。取該菌株快速生長期和生物被膜期，提取2個不同時期的mRNA。應用RNAprotect Bacteria Reagent和RNeasy Mini Kit試劑盒。取2個樣本的懸浮菌液，離心，收集菌體。用溶菌酶消化菌體，再加入裂解液，反復收集，提純，剔除菌體中DNA和蛋白質。得到菌體總RNA，進一步提純mRNA。樣本RNA≥1 μg，應用Life-tech Ribominus系列試劑盒提取。

1.4 樣本基因結果注釋 將樣本的基因序列與公共數據庫進行比較，通過基因的相似性進行功能注釋?；蛳嗨菩员葘χ饕诰植啃蛄信疟葯z索基本工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)算法。BLAST能夠實現比較兩段核酸或者蛋白序列之間的相似性的功能。

1.5 統計學方法 應用R version 3.3.0軟件處理數據， 組間基因表達的比較采用Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 樣本RNA數據的質控檢測 對高通量測序所使用的mRNA數據進行質量評估：①污染評估，對比鮑曼不動桿菌公共數據庫，是否污染其他物質RNA；②純度評估，結果樣本RNA純度高，可進行后續研究。樣本測序序列無明顯污染其他物種序列(圖1)，其中橫坐標表示測序位置，縱坐標為測序質量值，圖中紅色表示中位數，黃色是25%～75%區間，觸須是10%～90%區間，藍線是平均數。測序是雙端測序，每條 read 長度 125 bp。隨著測序的進行，酶的活性會逐步下降，因此到達一定測序長度后，堿基質量值也會隨之下降。中位值均在 Q20 以上，因此該文庫堿基質量良好，可用于后續分析。

圖1 樣本堿基質量分布圖

Figure 1 The sample base mass distribution

2.2 2組樣本基因表達比較 2種狀態的菌體有198個基因表達差異有統計學意義(P<0.05)。生物被膜狀態的菌體有106個基因較快速生長期菌體的基因表達上調，其中又有53個基因表達呈顯著升高，但在快速生長期菌體的表達極少，甚至表達被完全抑制。此外，有92個基因出現了表達的下調(圖2)，CsuA/B/C/D基因表達是顯著升高的。見表1。

在圖2中，每一個點代表一個基因，橫縱坐標分別表示log2(FPKM)值。其中紅色表示上調基因，綠色表示下調基因，藍色表示表達的基因差異無統計學意義。

圖2 基因表達量散點圖

Figure 2 The difference in basic table scattering amount scattering

表1 表達顯著升高的基因列表Table 1 The list of highly expressed genes

注：Fisher精確檢驗

3 討 論

生物被膜是細菌微生物的聚合體，它可以不可逆地黏附在醫療器械或者人體組織的表面，包埋入自身分泌產生的細胞外基質中。主要包括細胞外多糖、蛋白質、細胞外核酸以及其他基質[4]。對于鮑曼不動桿菌來說，常常會形成難以清除的生物被膜，這是其慢性長期定植于人體組織和持續存在于各類患者體內置管中的重要原因[5]。此外，生物被膜還與菌株多藥耐藥特性有關，生物被膜內的菌體更耐不利的外環境和各種抗生素[6]。鮑曼不動桿菌對抗生素耐藥主要是由于菌體生物被膜的生成[7]。

生物被膜的生成，主要經歷3個階段：初始黏附、細胞外基質分泌結構形成及生物被膜成熟[8]。此外，細菌生物被膜的形成需要復雜的信號因子調控以及多種蛋白參與其中[9]。生物被膜初始黏附，起始步驟就是需要黏附于一個生物或者非生物的表面，這是細菌侵犯機體造成感染的先決條件，也是細菌生物被膜形成的先決條件。細菌菌體的黏附主要靠蛋白和菌毛的介導，通過非特異電引力或者疏水作用促進細菌的黏附，此階段是可逆的黏附[10]。隨后，細菌分泌大量細胞外基質及信號調控因子，促使細菌與黏附表面之間形成不可逆的牢固結合[11]。在隨后的生物被膜生長和形態維持過程中，信號因子的調控起著十分重要的作用，如群體感應系統會感應被膜內細菌釋放的特定信號因子，這些信號因子及其特異的感應受體在菌體內部和菌落細菌之間進行信號交流，調控生物被膜菌落的基因和蛋白表達。在細菌啟動初始黏附階段，需要CsuA/B/C/D家族的顯著表達，幫助促進菌體的初始黏附。此外，這些基因還會作為特殊的信號系統，調控細菌生物被膜的生長和形態維持。目前，多藥耐藥鮑曼不動桿菌以生物被膜形式廣泛存在，難以清除；但是有關生物被膜形成能力與被膜維持所需相關基因調控仍不明確[12]。

細菌生物被膜的形成，使得菌體可以在不利的環境下長期存活，造成了鮑曼不動桿菌在人體組織慢性定植和感染反復發生。細菌的生物被膜狀態，不單單只是細菌在不同生長階段的簡單混合物，而是具有自己獨特蛋白質表型和特殊的生物學特性。生物被膜的生成、形態維持是通過特殊通路和信號因子啟動以及復雜信號網絡調控的。細菌從浮游狀態到生物被膜內菌株固著狀態是一系列復雜的過程，需要啟動狀態轉換，形成足夠密度的菌落、適宜的陽離子濃度、特殊的信號轉導機制，啟動其轉換模式。但大多機制不明。

本研究結果顯示，生物被膜狀態下，CsuA/B/C/D基因表達是顯著升高的。說明其在生物被膜生成和形態維持中發揮著極其重要的作用。細菌生物被膜形成中，菌體的初始黏附需要依賴CsuA/B/C/D基因的顯著表達[13]。生物被膜在形成過程中，初始黏附以及隨后發生的基質分泌、被膜逐漸成熟、形成不可逆黏附均需要復雜的信號網絡調控，且這些基因表達需要時序性調控，其中CsuA/B/C/D基因會介導菌毛產生增加，幫助生物被膜黏附和成熟[14]。菌毛是細菌菌體表面類毛發樣物質，它可以幫助菌體識別非生物表面、宿主黏膜受體及其他黏附表面[15-16]。若是使上述基因鈍化或者失活，就會出現菌毛缺失、細菌生物被膜生成受限、菌體黏附受到抑制[17]。因此，CsuA/B/C/D基因的顯著表達啟動了菌體生物被膜形成的初始黏附，使得菌體可以不可逆地黏附于生物表面或醫療器械的表面，這是生物被膜生成的決定性因素，也是鮑曼不動桿菌長期存活、廣泛傳播的決定性因素。CsuA/B/C/D基因是菌毛生成增加的開啟操縱子。

細菌生物被膜的生成依賴于菌毛的生物合成，需要CsuA/B/C/D基因介導，CsuA/B/C/D基因還介導菌體分泌表面活性物質和細胞外基質，這些是生物被膜形成早期階段所必需的[18]。此外，Csu基因簇還與鮑曼不動桿菌致病力和毒力相關[19]。相比于浮游狀態的細菌，生物被膜固著狀態的菌株更加耐藥，具有更強的致病力[15]。由于生物被膜的生成，被膜內菌落間、菌落內細菌間聯系和信號交換更加頻繁，細胞外DNA及基質間物質交換，使得生物被膜內的菌落更容易發生質?；蚰退幓虻霓D移，生物被膜內的菌體耐藥性更強[20-21]。因此，生物被膜使得鮑曼不動桿菌更加耐藥，具有更強的致病力，能夠生成更長時間，導致院內感染反復發生[22-24]。進一步地深入研究Csu基因簇在生物被膜形成和形態維持中的作用和機制，可以為今后治療多耐藥鮑曼不動桿菌定植提供新的方向。

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(本文編輯：許卓文)

Genomics studies the role of the Csu cluster in the biofilm formation

LI Hai-tao, ZHANG Lu-tao, LI Shuai, WANG Bo-li, QI Tian-jie, LI Hong-lin

(TheFirstDepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Objective To study the role of Csu cluster in the biofilm formation of the multidrug resistant Acinetobacter baumannii by genomics. Methods The bacteria were selected from the clinical laboratory of our hospital. The rapidly growth period and biofilm stage were obtained. The mRNA of the two different stages were extracted and sequenced. Compared the gene sequence with the public database, we found the differences in gene expression. Results There were significant differences in the expression of genes between the two strains in the rapid growth phase and biofilm stage of the same strain. In the biofilm state, the expression of 106 genes was up-regulated in the cells with rapid growth phase, in which the expression of CsuA/B/C/D gene cluster was significantly increased, and the expression of 92 genes was down regulated. Conclusion The Csu cluster played an important role in biofilm formation and maintenance. In the formation of biofilm, the initial adhesion of the cells required significant expression of the Csu A/B/C/D. The Csu cluster mediated the biosynthesis of pili and the secretion of extracellular matrix, which were necessary for the early stages of the biofilm formation.

Acinetobacter baumannii; drug resistance, multiple; genetic testing

2017-04-07；

2017-05-05

河北省醫學科學研究重點課題(ZL20140206，20130503)

李海濤(1983-)，男，河北南宮人，河北醫科大學第二醫院副主任醫師，醫學碩士，從事呼吸疾病診治研究。

R378.79

A

1007-3205(2017)08-0869-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.001