蘆筍片的質量標準研究

馬 靜，費小凡，李文堯，宋 毅

(四川大學華西醫院臨床藥學部，四川 成都 610041)

蘆筍片的質量標準研究

馬 靜*，費小凡，李文堯，宋 毅#

(四川大學華西醫院臨床藥學部，四川 成都 610041)

目的：建立蘆筍片的質量控制標準。方法：采用薄層色譜法定性鑒別蘆筍片中的門冬氨酸。采用反相高效液相色譜法測定蘆筍片中門冬氨酸的含量，柱前衍生試劑為2,4-二硝基氟苯，色譜柱為Chromsil ODS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速為1.0 ml/min，流動相A為50 mmol/l的醋酸鈉溶液(pH=6.4)，流動相B為體積分數50%的乙腈溶液，進行梯度洗脫，檢測波長為360 nm，柱溫為35 ℃。結果：門冬氨酸的線性范圍為0.154～2.044 μg，r=0.999 9，平均加樣回收率為98.98%，RSD為1.23%。結論：本方法穩定可靠、簡便快捷、重復性好，能準確測定蘆筍片中門冬氨酸的含量，為蘆筍片的質量控制提供了依據。

2,4-二硝基氟苯； 柱前衍生； 門冬氨酸； 薄層色譜法； 反相高效液相色譜法； 蘆筍片

蘆筍片是由蘆筍(AsparagusofficinalisL.)加輔料制成的薄膜衣片，具有益氣生津、清熱利濕、活血散結的功效，常用于高血壓病、心臟病、腎炎水腫、乳腺結節等的治療。近年來，美國學者發現蘆筍還具有防止惡性腫瘤細胞擴散的功能，故臨床上將蘆筍片用于膀胱癌、肺癌、皮膚癌等惡性腫瘤的輔助治療。組織蛋白和門冬酰胺是蘆筍發揮藥用效能的主要成分。相關研究多采用比色法測定蘆筍中的總皂苷、總氨基酸的含量[1-3]，采用紫外分光光度法[4]和熒光光度法[5]檢測總黃酮成分，操作較繁瑣，且結果存在誤差。彭友舜[8]、安玉會[9]等采用氨基酸自動分析儀來測定氨基酸，其可全面分析各種氨基酸成分，但價格昂貴，普及率較低。此外，關于蘆筍含量測定的指標性成分選擇，蘇亞軍等[6]選擇蘆丁，邵旭等[7]選擇門冬氨酸。而本研究以蘆筍中門冬酰胺的水解產物門冬氨酸作為指標成分，采用薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)及反相高效液相色譜法(reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)對其進行定性、定量鑒別，為蘆筍片的質量控制提供了依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AT高效液相泵、SPD-M10Avp紫外檢測器、CLASSVP工作站(日本島津公司)；Shim-pack C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本島津公司)；Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(廣州菲羅門科學儀器公司)；AS3120型超聲波清洗器(AUTO SCIENCE公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技儀器有限公司)； XP205DR十萬分之一電子天平(METTLER TOLEDO公司)；調溫電熱套(ZDHW型，北京中興偉業儀器有限公司)；PBQⅠ型薄層自動鋪板器(重慶南岸新力實驗電器廠)；732型陽離子交換樹脂柱(廊坊圣泉化工有限公司)；自制硅膠G薄層板(取薄層層析硅膠G適量，加入磷酸二氫鉀適量，混合物按固定相1份 ∶0.4%羧甲基纖維素鈉的水溶液3份混合，用自動薄層制板器制成10 cm×20 cm、厚度0.4 mm、采用0.2 mol/l磷酸二氫鉀溶液制備的硅膠G薄層板，晾干后，于105 ℃下烘干1 h，置于干燥器內存放)。

1.2 藥品與試劑

乙酸鈉、醋酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀和2,4-二硝基氟苯(DNFB)、α-萘酚、磷酸二氫鉀、茚三酮、正丙醇、硫酸、氨水等為分析純；N,N-二甲基甲酰胺為優級純；乙腈(色譜純，SWELL公司出品)；純凈水(娃哈哈集團有限公司)；門冬氨酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：140691—200401)；蘆筍片為實驗室自制(批號：160201、160202、160203、160301、160302、160303)。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備：取樣品適量，去薄膜衣研成細粉，混勻，精密稱定約5 g，置于圓底瓶中，加水100 ml，加熱回流提取1 h，濾過，濾液加在732型陽離子交換樹脂柱(內徑1 cm，長10 cm)上，用水洗至洗脫液無糖反應(取洗脫液1 ml，加α-萘酚試液3滴，沿管壁加硫酸5滴，兩液界面處無紅色環產生則為無糖反應)，再用2 mol/l氨試液80 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加正丙醇2 ml使溶解，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備：取門冬氨酸對照品適量，加正丙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備：取處方中除蘆筍主藥外的空白輔料，通過相應的制備工藝制成缺蘆筍的樣品，再按照“2.1.1”項下方法制備，即得。

2.1.4 薄層色譜法：根據《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)“通則0502”，吸取對照品溶液5 μl、供試品溶液10 μl，分別點于同一用0.2 mol/l磷酸二氫鉀溶液制備的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=8 ∶3 ∶1)為展開劑，展開，取出并晾干，噴茚三酮試液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果表明，供試品溶液在與對照品溶液相同位置上顯相同顏色的斑點，Rf在0.3～0.7之間，斑點的分離度良好。

2.2 薄層鑒別的方法學考察

2.2.1 展開劑的選擇：吸取上述對照品溶液5 μl、供試品溶液10 μl，點于同一硅膠G薄層板上，分別以丁酮-吡啶-冰醋酸-水(V∶V∶V∶V=70 ∶15 ∶2 ∶15)[10]、正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=4 ∶1 ∶1)[11]、十二烷基硫酸鈉-正丁醇-正己烷-水(V∶V∶V∶V=3 ∶14 ∶2 ∶2.2)[12]、正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=8 ∶3 ∶1)為展開劑展開，將上述薄層板取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果表明，展開劑為前三種時，斑點拖尾嚴重，分離度差，而展開劑為第四種時，斑點分離度好，Rf適中。故以正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=8 ∶3 ∶1)為本研究的展開劑。

2.2.2 點樣量的選擇：吸取上述對照品溶液、供試品溶液，各2、5、10、20 μl，點于同一用0.2 mol/l磷酸二氫鉀溶液制備的硅膠G薄層板上，以“2.1.4”項下的方法展開。根據斑點的清晰度和分離度，表明本研究最佳點樣量為供試品溶液10 μl、對照品溶液5 μl。

2.2.3 不同檢視條件的考察：取上述對照品溶液5 μl、供試品溶液10 μl，按照“2.1.4”項下方法展開，取出，晾干，分別在不同波長的紫外燈下(254 nm、302 nm、365 nm)檢視，或噴茚三酮試液加熱至斑點顯色后于日光下檢視。結果顯示，最佳檢視條件為噴以茚三酮試液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

2.2.4 專屬性考察：吸取對照品溶液5 μl、供試品溶液10 μl、陰性對照溶液10 μl，按照“2.1.4”項下方法檢視，見圖1。結果顯示，陰性對照溶液在與對照品溶液相同位置上無斑點，輔料對主藥成分無干擾，本方法的專屬性好。

1—6.供試品溶液；7.對照品溶液；8.陰性對照溶液1—6.test solution; 7.control solution; 8.negative control solution圖1 薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatogram

2.2.5 溫度、濕度的考察：配置不同濃度的硫酸水溶液置于展開缸的一側，密閉15 min后，控制其相對濕度；并將裝有薄層板的層析缸分別放置在4～10 ℃冰箱中、20 ℃室溫空調房中、35 ℃恒溫干燥箱中進行不同溫度的考察。 取上述2種溶液，按照“2.1.1”項下進行點樣，分別在下列條件展開：(1)溫度10 ℃、濕度45%；(2)溫度10 ℃、濕度65%；(3)溫度20 ℃、濕度45%；(4)溫度20 ℃、濕度65%；(5)溫度20 ℃、濕度85%；(6)溫度35 ℃、濕度65%；(7)溫度35 ℃、濕度85%，用茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰后檢視。結果表明，在上述不同溫度、濕度條件下，供試品色譜在與對照品色譜的相應位置上均有相同顏色的斑點，且分離度良好，Rf值有稍許變化，說明溫度在10～35 ℃范圍內，濕度在45%～85%范圍內，對本品的薄層鑒別影響小，重復性和穩定性好。

2.2.6 薄層板的考察：吸取上述對照品溶液5 μl、供試品溶液10 μl，在不同的薄層板下，按照“2.1.4”項下方法展開。薄層板(1)為青島海浪硅膠干燥劑有限公司生產的硅膠G薄層板；薄層板(2)為采用0.2 mol/l磷酸二氫鉀溶液自制的硅膠G薄層板。結果表明，采用薄層板(1)時，斑點分離度差，拖尾嚴重；薄層板(2)的特征主斑點分離度達到要求，斑點清晰。

2.3 崩解時限考察

分別取上述6個批號的樣品各6片，參照《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)通則0921崩解時限[13]中的方法，在鹽酸溶液(9→1 000)中進行崩解時限考察。結果表明，6批樣品均在1 h內全部崩解，符合相關規定。

2.4 含量測定

2.4.1 衍生緩沖溶液的制備：稱取碳酸氫鈉4.2 g，置于100 ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.4.2 平衡緩沖溶液的制備：稱取磷酸二氫鉀0.68 g，置于100 ml容量瓶中，加20 ml水溶解，再加入0.1 mol/l氫氧化鈉溶液29.1 ml，用水定容至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 衍生化溶液的制備：精密量取2，4-二硝基氟苯0.1 ml，置于10 ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.4.4 對照品溶液的制備：精密稱取門冬氨酸對照品10.22 mg，置于10 ml容量瓶中，加水溶解并搖勻，制成濃度為1.022 mg/ml的對照品儲備液；精密量取對照品儲備液3 ml，置于10 ml容量瓶，加水稀釋成濃度為0.307 mg/ml的未衍生化對照品溶液。精密量取未衍生化對照品溶液1 ml，置于10 ml棕色容量瓶中，按照先后順序加入衍生緩沖溶液1 ml、衍生化溶液1 ml，搖勻后密閉，在60 ℃水浴中避光反應60 min，取出，冷至室溫(25 ℃)，用平衡緩沖液定容至刻度，放置15 min，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.4.5 供試品溶液的制備：取樣品適量，去薄膜衣研成細粉混勻，精密稱定約3 g，置于100 ml錐形瓶中。加50 ml水超聲處理30 min，重復操作2次，離心，取上清液，合并后蒸干，殘渣置于10 ml容量瓶中，加水定容至刻線，搖勻，即得未衍生化供試品溶液。精密量取未衍生化供試品溶液1 ml，置于10 ml棕色容量瓶中，按照先后順序加入衍生緩沖溶液1 ml、衍生化溶液1 ml，搖勻后密閉，在60 ℃水浴中避光反應60 min，取出，冷至室溫，用平衡緩沖液定容至刻度，放置15 min，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.4.6 色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測波長為360 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 ml/min；流動相A：取乙酸鈉4.1 g，加水約900 ml，用醋酸調節pH至6.4，加N,N-二甲基甲酰胺溶液10 ml，置于1 000 ml容量瓶中，用水定容至刻線，即得；流動相B：乙腈-水(V∶V=1 ∶1)，進行梯度洗脫，過程見表1。結果顯示，門冬氨酸主峰與其他雜質峰無干擾，各組分均能達到基線分離，理論板數≥3 000；分離度≥1.5，符合規定，見圖2。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

A.對照品溶液；B.供試品溶液A. control solution；B. test solution圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.4.7 線性關系考察：精密吸取“2.4.4”項下對照品溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，以絕對進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得回歸方程：Y=5×106X-73 269，r=0.999 9(n=6)。結果顯示，門冬氨酸進樣量在0.154～2.044 μg之間呈良好的線性關系。

2.4.8 精密度考察：精密吸取“2.4.4”項下對照品溶液，重復進樣6次(進樣量10 μl)，記錄峰面積。結果顯示，門冬氨酸峰面積的RSD=0.3%，儀器精密度良好。

2.4.9 穩定性考察：精密吸取“2.4.4”項下對照品溶液、“2.4.5”項下供試品溶液各10 μl，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，對照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.56%和0.43%，表明對照品溶液、供試品溶液均在10 h內穩定。

2.4.10 重復性試驗：取樣品6份(批號：160301)，按“2.4.5”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液及“2.4.4”項下對照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。結果顯示，門冬氨酸的RSD=1.81%，表明本方法重復性良好。

2.4.11 加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的樣品(批號：160301)6份，各1.0 g，置于6個100 ml錐形瓶中，分為三組。每組分別精密加入濃度為1.31、1.58、1.89 mg/ml的對照品溶液1.0 ml，按照“2.4.6”項下色譜條件進樣測定計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)Tab 2 Recovery test of Lusun tablets(n=6)

2.4.12 樣品含量測定：取6批自制樣品，按“2.4.5”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.6”項下色譜條件進樣測定并計算樣品中門冬氨酸的含量，結果見表3。

3 討論

氨基酸類成分大部分不含芳香環等紫外吸收基團，故無法檢測到紫外和熒光吸收。在一定條件下，加入衍生試劑，氨基酸反應生成有紫外吸收的氨基酸衍生物，使其在360 nm的波長處有紫外吸收。常用的衍生化試劑有異硫氰酸苯酯(PITC)、鄰苯二甲醛(OPA)、DNFB和芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)等。其中OPA與氨基酸在室溫條件下迅速反應，能生成強熒光衍生產物，由于OPA本身無熒光性，不會產生干擾而影響色譜的分離。但OPA只與一級氨基酸反應，且其衍生化產物極不穩定，須在數分鐘內完成進樣，不便于常規檢測。PITC和Fmoc-Cl的適用性較為廣泛，能與一級、二級氨基酸發生作用，不會產生多級和不穩定的衍生產物，但PITC衍生過程操作復雜，同時會導致色譜柱耐用性降低；而FMOC-Cl的衍生產物常用于熒光檢測分析[14]。而DNFB與氨基酸的衍生化反應簡便、適用性廣，能與一級、二級氨基酸反應，且反應靈敏度高，在紫外區與可見光區都能進行操作，并能生成穩定單一的衍生產物，現在廣泛應用于多種氨基酸的測定。本研究采用DNFB試劑，可避免試劑對測定方法的干擾，衍生法步驟簡單，衍生產物穩定、分析更精確。但衍生物對光敏感，故衍生化的操作過程需要避光，應采用棕色容量瓶進行衍生反應及保存溶液。

表3 含量測定結果Tab 3 Content determination of aspartic acid

本研究考察了不同的提取條件對蘆筍片含量的影響?？疾鞐l件包括：提取溶劑為20%乙醇、40%甲醇和水；提取時間45 min、提取1次，60 min、提取1次和30 min、提取2次；提取方法為回流、超聲和浸泡。結果表明，提取溶劑為水，超聲30 min、提取2次時，門冬氨酸的含量最高。另外,考察了柱溫為25、30、35 ℃時對研究的影響。結果表明，柱溫30 ℃時的分離度較好，出峰時間適中。

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Research on Quality Standard of Lusun Tablets

MA Jing,FEI Xiaofan,LI Wenyao,SONG Yi

(Dept.of Clinical Pharmacy,West China Hospital of Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041,China)

OBJECTIVE：To establish a method for quality control of Lusun tablets. METHODS:TLC was used to make a thin-layer qualitative identification for aspartic acid in Lusun tablets. RP-HPLC was adopted to determine the content of aspartic acid in Lusun tablets. The sample was derived with 2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB). Aspartic acid was separated on Chromsil ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm) column at the flow rate of 1.0 ml/min. The mobile phase used was a mixture of A containing 50 mmol/L sodium acetate buffer(pH=6.4) and phase B containing 50% acetonitrile-water through the gradient elution. The detection wavelength was set at 360 nm and the column temperature was 35 ℃. RESULTS: Aspartic acid had good linearity in the ranges of 0.154 μg-2.044 μg,r=0.999 9. The average recovery was 98.98%,RSDwas 1.23%. CONCLUSIONS: The method is accurate,sensitive,reproducible and credible to determine the content of aspartic acid in Lusun tablets,and provides the oretical basis for the quality control of Lusun tablets.

DNFB; Pre-column derivatization; Aspartic acid; TLC；RP-HPLC; Lusun tablets

R927.11

A

1672-2124(2017)08-1085-04

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.030

2017-01-25)

*中藥師，執業中藥師。研究方向：中藥材、中藥成方制劑的質量控制和研發工作。E-mail：mandy23@163.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：中、西藥新制劑的研發工作。E-mail： yisong.scu@foxmail.com