再生障礙性貧血模型建立及鑒定

蘇攀柯

(河南科技大學第一附屬醫院 河南 洛陽 471003)

再生障礙性貧血模型建立及鑒定

蘇攀柯

(河南科技大學第一附屬醫院 河南 洛陽 471003)

目的建立及鑒定再生障礙性貧血模型。方法再生障礙性貧血動物模型的建立：雌性SD大鼠，體質量200～250 g，清潔級，共20只。隨機分為對照組和模型組，每組10只。模型組腹腔注射5-氟尿嘧啶150 mg/kg后的第5天，采用白消安(馬利蘭片)蒸餾水懸液15 mg/kg灌胃，每周1次，連續3周。分別采用生化儀檢測對照組和模型組血液中紅細胞、白細胞、血紅蛋白含量及紅細胞壓積；取死亡動物和定期處死動物的股骨制作骨髓涂片，采用聯合用藥的方案，建立大鼠造血干細胞衰竭型再生障礙性貧血(再障)模型。結果再障動物模型建立成功，模型組骨髓涂片示脂肪化明顯，骨髓增生程度降低，血常規結果提示造血細胞減少，非造血細胞增多，各項血常規指標下降明顯，符合再障的實驗室診斷特點。結論本實驗成功建立了SD大鼠再障模型，為干細胞治療再障的實驗研究及藥物篩選、藥物作用機制的研究，提供了一個比較理想的動物病理模型基礎。

再生障礙性貧血；動物模型；5-氟尿嘧啶；白消安；骨髓象

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)指由接觸藥物、毒物、病毒或未明原因引起全血細胞減少的同時，伴以骨髓增生減退為特征的貧血。該病的發生與骨髓造血干細胞損傷、造血微環境缺陷、免疫性造血抑制及遺傳傾向等多種因素有關[1-2]。亞洲國家AA發病率為(3.9～5.0)/106，明顯高于歐美國家的(2.0～2.7)/106[3]。其主要臨床表現為貧血、感染和出血。根據臨床表現、血象和骨髓象，可將AA分為慢性AA(CAA)和急性AA(AAA)，后者亦稱為重型AA(SAA)Ⅰ型。如果CAA病情惡化, 則稱為SAA-Ⅱ型。雖然美國血液學年會明確提出AA 是自身免疫性疾病，免疫異常表現為T 淋巴細胞功能亢進，但其發病機制仍不清楚[4]。為探究AA 發病機制及篩選有效防治藥物，建立合適的AA 動物模型尤為重要。AA約半數是由接觸藥物或化學因素引起，如化療藥物、工業污染、重金屬中毒等[5]?，F采用5-氟尿嘧啶聯合白消安的方法建立AA小鼠模型，具體如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物與飼養清潔級雌性成年SD種系大鼠20只，體質量200～250 g，購于鄭州大學實驗動物中心，動物合格證號：醫動字第410116號，飼養條件為人工控溫22～26 ℃，14L:10D光照，自由飲水進食，適應飼養環境一周。

1.2主要實驗試劑和儀器5-氟尿嘧啶：50 mg/L，天津金耀氨基酸有限公司；白消安： 2 mg/片，GlaxoSmithKline；顯微鏡：XSJ-D型，日本OLYMPUS光學儀器公司；數碼照相機：DPl2型，日本OLYMPUS光學儀器有限公司；電子天平：BS210S型，北京賽多力精密儀器有限公司；微量加樣槍(200 、100、20 μl)，上海醫用激光儀器廠；全自動生化儀：2700型，日本OLYMPUS光學儀器有限公司。

1.3再生障礙性貧血模型的建立20只雌性SD大鼠隨機分為對照組(10只)和AA模型組(10只)。AA模型組腹腔注射5-氟尿嘧啶(150 mg/kg)，第5天采用白消安蒸餾水懸液灌胃(15 mg/kg)，每周1次；對照組同AA模型組，但采用生理鹽水替換白消安蒸餾水懸液灌胃。

1.4實驗室檢查包括血象檢查和骨髓象檢查，具體如下。

1.4.1血象檢查 停藥后第7天取材，腹腔注射2%戊巴比妥(30 mg/kg)將動物麻醉，固定動物使其呈仰臥位，打開腹腔。開腹時，盡可能減少出血，將腸管推向一側，然后用手指輕輕分開脊柱前的脂肪，暴露出腹主動脈，用注射器(5 ml)在腹主動脈分叉處，與血管平行刺入，回抽采血。將采集的2 ml血液立即打入抗凝管中，反復輕搖，使血液與抗凝劑充分結合，送至河南科技大學第一附屬醫院檢驗科檢測。

1.4.2骨髓象檢查 腹主動脈采血結束后，用手術剪刀剪掉大腿部的肌肉，充分暴露股骨，用大剪刀剪斷股骨，中號鑷子擠出骨髓，如果骨髓不易取出，可用直頭眼科鑷插入骨髓腔挑出骨髓，置骨髓于清潔的載玻片一端，以一邊緣整齊的玻片30 ℃推片，制備骨髓涂片。瑞氏染色后置于鏡下觀察，當細胞核變藍終止，緩沖液沖洗，去除多余染液。

2 結果

2.1一般臨床癥狀模型組大鼠于實驗3周左右逐漸出現毛發蓬松，食量及飲水量減少，反應遲鈍，活動遲緩，卷曲少動，體質量下降；實驗第4周開始出現死亡。瀕死前所有大鼠均有不同程度的皮膚瘀點，主要出現在耳廓、趾尖、尾巴，對照組大鼠無明顯變化。

2.2血象檢查與對照組大鼠血常規檢查結果相比較，模型組大鼠全血細胞減少，白細胞中以中性粒細胞減少最明顯，紅細胞數量、白細胞數量和血紅蛋白含量均下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組動物血常規指標比較

注：與對照組比較，aP<0.05。

2.3骨髓象檢查與對照組骨髓涂片結果相比，AA模型組骨髓涂片中骨髓脂肪化明顯，細胞數量下降，非造血細胞增多，骨髓有核細胞增生極度低下，細胞數量稀少，造血細胞罕見，骨髓涂片油滴明顯增多，即鏡下空泡數量明顯增多，并出現許多大或特大空泡。

3 討論

目前，AA 發病機制尚不明確，可能與骨髓造血干細胞異常、端粒酶的改變以及造血微環境異常有關，而淋巴因子或效應T細胞殺傷造血干細胞或祖細胞被認為是AA主要發病機制[6-8]。AA的病理模型有著不可替代的優點：發病原因明確；發病機制相對一致；發病時間較集中；研究對象的數量可以根據實驗需要控制；標本易于收集；可詳細觀察整個患病的過程；進行前瞻性研究；進行一系列臨床中不能進行的實驗，如新藥的臨床試驗前研究，同型及不同型的各種干細胞移植等[9]。

本實驗采用中國協和醫科大學血液學研究所趙鈞銘等[10]《5-氟尿嘧啶與白消安合用誘導建立大鼠急性再生障礙性貧血模型》的造模方法，5-尿嘧啶主要殺傷處于增殖周期內的細胞，非增殖周期內的造血干細胞則活存下來，5-氟尿嘧啶在骨髓中的濃度約2倍于血漿，因此，5-氟尿嘧啶已廣泛地用來富集造血干細胞。根據趙鈞銘等的觀察，大鼠注射5-氟尿嘧啶后第7天增殖速率明顯減低，5-氟尿嘧啶與白消安聯合誘導方案，可更徹底地殺傷造血干細胞，起到“聚而殺之”的作用。本實驗于停藥后第2周處死模型組動物，血液檢查示各項指標明顯降低，與文獻相符。骨髓檢查示骨髓脂肪化明顯，細胞數量顯著下降，非造血細胞增多。本研究采用5-氟尿嘧啶和白消安聯合用藥方案，成功地建立了大鼠造血干細胞衰竭型AA模型。為干細胞治療再障的實驗研究及藥物篩選、藥物作用機制的研究，提供了一個比較理想的動物病理模型基礎。

[1] Bacigalupo A,Valle M,Podesta M,et al.T-cell suppression mediated by mesenchymal stem cells is deficient in patients with severe aplastic anemia[J].Exp Hematol,2005,33(7):819-827.

[2] Risitano A M,Kook H,Zeng W,et al.Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria measured by V beta CDR3 spectratyping and flow cytometry[J].Blood,2002,100(1):178-183.

[3] Fan R,Wang W,Wang X Q,et al.Incidence of adult acquired severe aplastic anemia was not increased in Shanghai, China[J].Ann Hematol,2011,90(10):1239-1240.

[4] Bacigalupo A,Piaggio G,Van Lint M T,et al.Aplastic anemia: pathogenesis and treatment[J].Onkologie,1987,10(3):172-173.

[5] Nara N.Aplastic anemia associated with drug[J].Nihon Rinsho,2012,70 Suppl 6:438-442.

[6] Young N S,Calado R T,Scheinberg P.Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia[J].Blood,2006,108(8):2509-2519.

[7] 邵宗鴻.原發性骨髓衰竭性貧血[J].中國實用內科雜志,2009,29(7):585-588.

[8] 高麗娜,劉寶山.B7-CD28/CTLA4共刺激途徑在再生障礙性貧血免疫機制中的作用[J].天津醫藥,2010,38(6):536-538.

[9] 王軍,張廣民,俞發舟,等.聯合應用苯與白消安建立大鼠急性再生障礙性貧血模型[J].安徽醫科大學學報,2006,41(4):436-438.

[10]趙均銘,褚建新,丁順利,等.5-氟尿嘧啶與白消安合用誘導建立大鼠再生障礙性貧血模型[J].中華血液學雜志,2011,22(4):202-204.

Establishmentandidentificationofaplasticanemiamodel

Su Panke
(TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China)

ObjectiveTo establish and identify aplastic anemia model.MethodsTwenty female SD rats were randomly divided into control group and model group to establish the animal model of aplastic anemia. At the fifth day after intraperitoneal injection of 5-fluorouracil in the model group, rats in the model group were given gastric reperfusion with suspension of busulfan once a week for three weeks．The contents of erythrocyte, leukocyte, hemoglobin and hematokrit were determined in two groups. Bone marrow smears were produced by thigh-bone from dead rats or rats executed at regular intervals.ResultsAplastic anemia animal model is established successfully. The model group had more fat and less bone marrow hyperplasia in bone marrow smear, and fewer hematopoietic cells, more non hematopoietic cells in blood routine results, consistent with the laboratory diagnosis of aplastic anemia.ConclusionThis study had successfully established aplastic anemia model in the SD rats, providing an ideal animal model for stem-cell treatment, aplastic anemia experiments, drug screening and function mechanism studies．

aplastic anemia; animal model; 5-fluorouracil; busulfan; bone marrow

R 446.1doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2017.15.003

2016-12-28)