胃癌組織氨基酸代謝的研究

趙春臨 董志遠 余洋 張紅雨 李鵬輝 王水生 丁朝輝 徐化楠

(鄭州大學第一附屬醫院 胃腸外科 河南 鄭州 450052)

胃癌組織氨基酸代謝的研究

趙春臨 董志遠 余洋 張紅雨 李鵬輝 王水生 丁朝輝 徐化楠

(鄭州大學第一附屬醫院 胃腸外科 河南 鄭州 450052)

目的觀察胃癌組織、癌旁正常組織氨基酸譜的變化規律。方法使用超高效液相色譜串聯質譜的方法檢測40例胃癌患者癌組織、癌旁正常組織19種氨基酸的含量。結果Ⅰ、Ⅱ期胃癌組織中氨基酸含量與癌旁正常組織相比，差異無統計學意義，Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中氨基酸與癌旁正常組織相比，蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺的含量增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中多種氨基酸含量升高，表明胃癌組織存在明顯的氨基酸代謝異常，這種代謝異?？蔀榘被崾Ш獐煼ㄌ峁┡R床依據。

胃癌；氨基酸；超高效液相色譜串聯質譜；氨基酸失衡療法

盡管胃腫瘤相關性的死亡率已經有所下降，但是胃癌仍是第四最常見的癌癥類型和全球癌癥死亡的第二大原因[1]。由于大部分胃癌患者確診時已經是中晚期，所以其常表現出不同程度的營養不良，并伴隨嚴重的蛋白質-氨基酸代謝紊亂，導致患者體力下降，免疫力低下，在放化療時由于副反應又常常進食不足，進一步加重營養不良，患者在此狀態下接受治療，治療效果可能有所折扣，并帶來各種并發癥，加速患者死亡[2]。因此，營養支持對于胃癌患者異常重要。如何制定合理的營養治療方案，制成某種氨基酸過量或減少乃至缺失的不平衡氨基酸(amino acid imbalance，AAI)，既能抑制腫瘤生長，又能改善患者營養狀況，即采用氨基酸失衡療法，以補充支持現有的胃癌治療手段，是胃癌綜合治療需要探索的一個重要方面[3]。本研究通過超高效液相色譜串聯質譜的方法檢測胃癌患者癌灶、癌旁組織游離氨基酸含量，了解胃癌氨基酸代謝輪廓的改變，為胃癌患者氨基酸失衡療法提供臨床依據。

1 材料和方法

1.1研究對象檢測標本取自2015年12月至2016年4月鄭大一附院住院手術的40例胃癌患者。其中男29例，女11例，年齡25～77歲，平均59.7歲，體質量指數(body mass index，BMI)17.3～26.2 kg/m2，BMI平均值為22.6 kg/m2。術后經病理證實胃管狀腺癌36例，印戒細胞癌4例。術后病理分期Ⅰ期、Ⅱ期各6例， Ⅲ期9例 ，Ⅳ期19例。納入標準：術前均行胃鏡及活檢病理、全腹部CT掃描、上消化道鋇餐造影、心電圖、血生化檢查及術后常規病理檢查；術前均未接受放化療；肝腎功、心電圖及其他生化指標正常，無內分泌及代謝性疾病。

1.2實驗方法共測量19種游離氨基酸的含量，其中必需氨基酸(essential amino acid，EAA)7種，分別為：纈氨酸(Val)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)及蘇氨酸(Thr)；非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)12種，分別為：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、門冬氨酸(Asp)、胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、鳥氨酸(Orn)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)。具體實驗方法如下。

1.2.1標本取材方法 術中取胃癌標本時，取癌灶組織+癌旁組織(距離癌灶邊緣5 cm以上，在同一水平面上，組織重量需>1 g)，放于5 ml離心管中，迅速使用冰鹽水洗滌3次，除去血污(放于燒杯中清洗)，隨后使用濾紙吸干并轉移至凍存管中，后將凍存管存放于液氮中。

1.2.2標本上機前處理 將組織(50 mg)加入1.5 ml冰冷的50%甲醇中，勻漿(A) ，隨后在16 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min(B)，取上清，加入120 μl的50%甲醇，重懸獲得極性成分后上機進行檢測；或者將組織(50 mg)加入1.5 ml冰冷的50%甲醇，勻漿(A)，然后在16 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min(B)，在獲得的沉淀中加入1.6 ml CHCl2∶乙腈(3∶1)，重復A、B操作，隨后揮干上清，加入120 μl的50%甲醇重懸，獲得非極性成分，最后上機進行檢測。

1.3實驗儀器參數設定①超高效液相色譜(UPLC)條件：本實驗使用的液相色譜儀為Dionex的UltiMate 3000包括液相泵(HPG-3400 SD)、柱溫箱(TCC-3000 SD)和自動進樣器(WPS-3000SL)，組織樣品采用ACQUITY ULC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)及UPLC C18 保護柱(2.1 mm×5 mm)(Water 中國有限公司)進行檢測，柱溫為40 ℃，自動進樣器溫度為4 ℃，流動相A為水+0.1%甲酸，B為乙腈+0.1%甲酸(見表1)。②質譜條件：質譜檢測所用的儀器為Thermo公司生產的四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(Q Exactive)，離子源為加熱型電噴霧(HESI)，掃描模式分別為ESI+，離子源溫度為300 ℃，噴霧電壓為3.6 kV，傳輸毛細管溫度為320 ℃，鞘氣流速為40 arb，輔助氣流速為10 arb；掃描模式為Full MS，Full MS/dd-MS2，掃描質量范圍為60～900 m/z，一級掃描和二級掃描分辨率分別為70 000和17 500。

表1 組織樣品流動相梯度洗脫條件

2 結果

2.1胃癌與癌旁正常組織中氨基酸含量的對比胃癌組織中Val、Met、Thr、Gln、Gly、Pro含量高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，EAA、NEAA、TAA含量也高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織與癌旁正常組織氨基酸含量對比Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gln、Gly、Ser含量高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，且EAA、NEAA、TAA含量均增加(P<0.05)。見表3。

表2 胃癌組織與癌旁正常組織游離氨基酸含量的變化

注：EAA，必需氨基酸；NEAA，非必需氨基酸；TAA，總氨基酸。

3 討論

平衡氨基酸的營養支持對腫瘤的促增值作用，以及不平衡氨基酸對腫瘤的抑制作用，使得更多關于不平衡氨基酸與腫瘤生長的實驗研究被進一步深入開展[4]。本研究結果表明，在Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中多種游離氨基酸含量明顯增高，且EAA、NEAA、TAA含量均高于癌旁正常組織，腫瘤組織的高氨基酸含量可能反應腫瘤組織對氨基酸需求較高以進行能量代謝、核酸及新的蛋白質合成，并且癌組織游離氨基酸的變化與腫瘤的進展程度相關。同時Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gly、Ser及Gln的顯著增加可能提示腫瘤組織對這幾種氨基酸的特殊需求，正常組織中的一些非必需氨基酸可能就是腫瘤組織的必需氨基酸，這也是氨基酸失衡療法的理論基礎[5]。國內關于癌癥患者癌組織內游離氨基酸譜的變化已有多篇文獻報道，各類惡性腫瘤細胞的代謝規律也不盡相同，有其不同而又特殊的游離氨基酸代謝改變[6]。王倩等[7]研究發現Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織游離氨基酸含量出現特征性病理改變：Ⅲ期TAA含量增加，Thr、Met、Ile、Leu、Val、Ala、Tyr、Pro、Ser、Gly含量增加；Ⅳ期TAA含量增加，Met、Leu、Thr、Ile、Asp、Gly、Pro、Ser及Glu含量增加。王亮等[8]研究發現胃癌組織游離Gln、Arg、Met含量較正常胃黏膜明顯增高，而Ala、Try含量較正常胃黏膜降低。

表3 Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織與癌旁正常組織氨基酸含量比較

腫瘤組織對糖的需求增加，宿主細胞只能通過分解蛋白質提供大量的氨基酸，糖異生可達到此目的。Pro、Thr、Ser、Val、Met及Gln均是生糖氨基酸，故在腫瘤組織中增加。Met是含硫必需氨基酸，是體內物質代謝的主要甲基供體，參與眾多活性物質的甲基化反應，而腫瘤組織在分化過程中需要大量的Met進行甲基化[9]。Val是一種支鏈氨基酸，為腫瘤生長代謝所必需。He等[10]研究發現去Val和去Met均能抑制荷瘤大鼠腫瘤的生長。去除Val抑癌效果雖明顯，但最大的不良反應是脂肪肝的發生率高，宿主也會出現體質量減輕、腹瀉、低蛋白血癥等癥狀[11]。

腫瘤生長時明顯改變了宿主的蛋白質和氨基酸的代謝，并導致機體不同程度的營養不良。本研究認為，在胃癌的氨基酸失衡液中應減少Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gly、Ser及Gln等氨基酸的含量，使得它們在支持宿主的同時又不會促進腫瘤的生長，甚至抑制腫瘤的生長，但同時必須重視氨基酸最低需要量的問題。目前，氨基酸失衡療法抗腫瘤的研究已經取得了很大的進展，氨基酸相關研究的目的正朝著增強抗癌藥物的敏感性、改善患者代謝和增強免疫功能的方向發展。因此，在深入了解胃癌組織與癌旁正常組織代謝差異的基礎上結合臨床，尋找更加合理的氨基酸失衡液的組成及含量，才能更有效地抑制腫瘤生長并改善患者的代謝。

[1] Li D,Xu C Y,Cui R J,et al.DNA methylation inhibitor, decitabine, promotes MGC803 gastric cancer cell migration and invasion via the upregulation of NEDD41[J].Mol Med Rep,2015,12(6):8201-8208.

[2] Roth E,Druml W.Plasma amino acid imbalance: dangerous in chronic diseases [J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2011,14(1):67-74.

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[8] 王亮,李保義,李慶瑞,等.胃癌組織氨基酸與腫瘤體積相關性研究[J].腸外與腸內營養,2000,7(1):41-44.

[9] Zhang P C,Pang C P.Plasma amino acid patterns in cancer[J].Clin Chem,1992,38(6):1198-1199.

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[11]金玉坤,陸偉,羅雁.不平衡氨基酸的研究進展[J].醫學綜述,2010,16(11):1647-1649.

RecentStudiesonAminoAcidMetabolisminGastricCarcinoma

Zhao Chunlin, Dong Zhiyuan, Yu Yang, Zhang Hongyu, Li Penghui, Wang Shuisheng, Ding Chaohui, Xu Huanan
(TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo investigate the metabolism of amino acids in gastric carcinoma tissues and adjacent normal tissues.MethodsNineteen kinds of amino acids in gastric carcinoma tissues and adjacent tissues were detected by ultrahigh performance liquid chromatography(UPLC)tandem masss pectrometry method.ResultsThe contents of amino acids were not significantly changed in gastric carcinoma withⅠandⅡstage, Compared with adjacent normal tissues, contents of Thr, Tyr, Ser, Gly, Val, Pro, Met and Gln increased significantly in gastric carcinoma tissues with Ⅲand Ⅳstage.ConclusionsThe amino acid in gastric carcinoma tissues with Ⅲand Ⅳstage were significantly changed, which showed that there were obvious metabolism abnormalities of amino acid in gastric carcinoma, providing clinical evidence for amino acid imbalance therapy.

gastric carcinoma；amino acid；ultrahigh performance liquid chromatography tandem masss pectrometry；amino acid imbalance therapy

趙春臨，E-mail：zhao_chunlin@163.com。

R 735.2doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2017.15.004

2016-11-28)