榧籽油的金松酸結構鑒定及成分分析

毛家輝，趙晨偉，王建峰，周宇馳，田 華，金青哲，王興國

(1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122； 2.浙江柏靈農業發展股份有限公司，浙江 金華321000)

檢測分析

榧籽油的金松酸結構鑒定及成分分析

毛家輝1，趙晨偉1，王建峰2，周宇馳2，田 華2，金青哲1，王興國1

(1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122； 2.浙江柏靈農業發展股份有限公司，浙江 金華321000)

通過紅外光譜法和氣相色譜-質譜聯用法分析了榧籽油所含的特殊脂肪酸——金松酸的結構，并對不同產地香榧籽油和木榧籽油的脂肪酸和主要微量成分組成進行了分析。結果表明：榧籽油主要含有亞油酸(39.85%～46.15%)、油酸(22.68%～35.10%)、金松酸(9.13%～12.96%)、棕櫚酸(7.34%～8.22%)、硬脂酸(2.64%～3.03%)等9種脂肪酸；其中，金松酸是一種特殊脂肪酸，其結構為順5,11,14-二十碳三烯酸；榧籽油主要含有β-生育酚(1 325.75～1 769.06 mg/kg)、β-谷甾醇(921.87～1 167.91 mg/kg)、α-生育酚(208.69～272.20 mg/kg)等7種微量成分。

榧籽油；金松酸；脂肪酸；微量成分

榧樹屬裸子植物紅豆杉科(Taxaceae)榧屬(Torreya)常綠喬木。榧樹(T.grandis)產于浙江、安徽南部、福建北部、江西東北部，星散分布于貴州、江蘇、湖南，以浙江最多[1]。榧樹的種子“香榧”是中國特有的珍稀干果之一，其營養價值高，有獨特的風味和藥用功能，藥食兩用[2]。但榧樹直接用種子繁殖，往往不能保持母本樹原有的性狀，容易發生變異。榧樹所結果實“木榧”形狀圓大，殼厚，種仁很硬且口味差，常用于中藥材[3]。

研究表明，榧籽由于其營養豐富、含生物活性成分，具有多種生物功能，包括抗氧化、抗炎、抗病毒、抗動脈粥樣硬化、抗蠕蟲、鎮咳、驅風、抗真菌、抗細菌和抗腫瘤等特性[4-6]。因此，榧籽不僅是功能性食品的重要原料，還可作為中藥的藥材來源。

榧籽種仁含油率高達54.62%～61.47%，以油酸、亞油酸為主，還含有棕櫚酸、硬脂酸等，不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的76.1%～82.0%[7]。有研究報道，香榧和日本榧脂肪酸種類幾乎相同，均含有一種特殊脂肪酸——順5,11,14-二十碳三烯酸，即金松酸，含量為6.68%～11.20%[8-9]。研究表明，金松酸能通過減少促炎因子的產生達到抗炎效果，且對大鼠的血脂調節具有顯著作用，并可抑制肝臟和血漿中涉及脂肪酸合成的酶的活性、提高肉毒堿棕櫚?；D移酶和?；o酶A氧化酶的活性[9-11]。我國對榧籽油的研究中尚未對其特殊脂肪酸進行明確的結構鑒定。榧籽油中除脂肪酸外，微量成分如生育酚、角鯊烯、甾醇等也是油脂營養與功能評價的重要部分，但目前對榧籽油的微量成分組成尚無詳細研究。

為實現對榧籽油組成成分及其保健功能的深入分析，本研究對來自不同地區不同品種的榧籽冷榨制油，對榧籽油的特殊脂肪酸進行結構鑒定，并對其脂肪酸和主要微量成分組成進行分析，為榧籽油作為功能性油脂的開發及香榧的精深加工提供基礎資料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

榧籽：香榧分別產自浙江省諸暨市、新昌市、嵊州市、蘭溪市；木榧產自安徽省黃山市，自然風干，備用。

三氟化硼、焦性沒食子酸、福林酚試劑等均為分析純，上海國藥試劑公司；2-氨基-2-甲基丙醇，阿拉丁試劑有限公司；混合生育酚標準品，Roche公司(瑞士)；β-生育酚標準品，上海西寶生物科技有限公司；37種脂肪酸甲酯混合標準品、5α-膽甾烷醇標品、BSTFA+TMCS(99∶1)硅烷化試劑，Sigma公司(美國)。

1.1.2 儀器與設備

CA-59-G螺旋榨油機，德國IBG MONFORTS公司；UV-2100分光光度計，上海Unico儀器公司；Waters 1525高效液相色譜儀、2996二極管陣列檢測器，美國Waters公司；二乙醇基固相萃取小柱(Diol-SPE，500 mg，6 mL)，美國賽芬公司；7820A氣相色譜儀，美國Agilent公司；Trace GC Ultra氣相色譜儀、ISQ質譜檢測儀，美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 榧籽油的制取

榧籽樣品放置于45℃烘箱中干燥一段時間，控制其水分含量在5%以下。然后將榧籽去殼，螺旋壓榨，靜置分層后，過濾、離心，得到冷榨榧籽油。

1.2.2 氣相色譜-質譜聯用法分析金松酸結構

樣品前處理參考文獻[12-13]：稱取200 mg油樣，80℃水浴皂化1 h。冷卻酸化至pH 2，水洗調節至pH 7。除水后加入1 g 2-氨基-2-甲基丙醇，170℃反應1～1.5 h，冷卻至室溫。加3 mL三氯甲烷，振搖1 min，水洗，離心分層。取下層溶液加無水硫酸鈉，離心，過0.22 μm有機膜，備用。

色譜條件：Trace GC Ultra氣相色譜儀； DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度260℃；載氣He，載氣流速0.80 mL/min；分流比20∶1；進樣量1 μL；升溫程序為初始柱溫170℃保持0.5 min，再以6℃/min的速度升溫至230℃保持15 min。

質譜條件：ISQ質譜檢測儀，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃，電離方式EI，掃描范圍(m/z)33～350。

1.2.3 榧籽油紅外光譜分析

取一定量的榧籽油，按照參考文獻[14]進行紅外光譜掃描。

1.2.4 脂肪酸組成測定

采用氣相色譜法測定榧籽油脂肪酸組成。

樣品前處理：稱取50 mg油樣，65℃水浴皂化30 min，冷卻后加入2 mL三氟化硼甲醇溶液，70℃水浴5 min，冷卻后，加入2 mL正己烷，振蕩，取上層有機相，加入無水硫酸鈉，離心取上清液，備用。

色譜條件：7820A氣相色譜儀； TRACE TR-FAME色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；氫火焰離子化檢測器(FID)；載氣N2，燃燒氣H2和空氣；進樣口溫度250℃；檢測器溫度250℃；進樣量1 μL，分流比100∶1；N2流速25 mL/min，H2流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min；升溫程序為初始柱溫60℃保持3 min，以5℃/min 的速度升溫至175℃保持15 min，再以2℃/min 的速度升溫至220℃并保持10 min。

采用脂肪酸甲酯混合標準品定性，采用面積歸一化法定量。

1.2.5 植物甾醇和角鯊烯測定

參考李志曉等[15]方法，采用氣相色譜-質譜聯用法測定。

1.2.6 生育酚測定

采用正相高效液相色譜法測定。

樣品前處理：稱取1.0～1.5 g油樣，置于10 mL棕色容量瓶中，加入正己烷溶解，定容后，過0.22 μm有機膜，備用。

色譜條件：Sehperisorb Silica柱(25 cm×4.6 mm×5 μm)；柱溫30℃；檢測波長295 nm；流動相為正己烷-異丙醇(體積比98.5∶1.5)；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL。

采用外標法定量，精確稱取生育酚標準品，以正己烷為溶劑配制貯備液，低溫下保存。將儲備液分別稀釋，取各質量濃度標準溶液分析，以進樣質量濃度為自變量x，峰面積為因變量y，繪制標準曲線，計算線性回歸方程和相關系數，結果見表1。

表1 α-生育酚和β-生育酚標準曲線線性回歸方程和回歸系數

1.2.7 多酚測定

采用紫外分光光度計法測定。

采用二乙醇基固相萃取小柱(Diol-SPE，500 mg，6 mL)提取榧籽油中的多酚類物質[16-17]。

活化SPE柱，稱取榧籽油3.0 g，溶于12 mL正己烷后過柱，再分別用6 mL正己烷清洗柱子兩次；加入8 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比9∶1)過柱；最后加入甲醇洗脫并收集于10 mL容量瓶中，定容后移取5 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL福林酚，反應3 min，加入1 mL 10%的碳酸鈉溶液，用水定容后避光靜置2 h，過0.45 μm膜，測定765 nm波長處的吸光度。

選用焦性沒食子酸作標準品，按一定質量濃度梯度稀釋后，各點的吸光度維持在0.1～0.8的可信區間內。以焦性沒食子酸質量濃度為自變量x，吸光度為因變量y，繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=11.029x+0.046 8，R2=0.999 0。根據標準曲線，計算榧籽油樣品中的多酚含量。

2 結果與討論

2.1 金松酸結構鑒定

2.1.1 金松酸的氣相色譜-質譜分析

采用雜環化法對榧籽油進行衍生化，2-氨基-2-甲基丙醇與脂肪酸發生縮合反應，生成相應的噁唑啉，反應如下：

在對含有多個雙鍵的脂肪酸進行氣相色譜-質譜分析時，甲酯化預處理和電子轟擊粒子化過程中均易發生雙鍵轉移，以致無法對雙鍵進行準確定位。電子轟擊質譜中，分子離子化時電荷位置優先發生在電離電位低的電子上。因此，將羧基修飾成比碳碳雙鍵中π電子電離電位低的含氮雜環提高了電荷的穩定性，使在EI源中給出電荷定域在含氮環的氮原子上而不是雙鍵位置上的離子，通過連續的自由基引發C—C均裂反應產生系列碎片離子，抑制了脂肪鏈中碳碳雙鍵的遷移，得到易辨認的顯示雙鍵位置信息的質譜[18-19]。金松酸雜環化物的質譜圖見圖1。

圖1 金松酸雜環化物的質譜圖

雙鍵位置的判斷規則如下：如果含n和n-1個碳原子的碎片離子(羧基部分)的質荷比之差為12而不是14時，表示在n和n+1個碳原子之間存在不飽和雙鍵。研究表明，在C4、C5、C6出現雙鍵時，n和n-1個碳原子的碎片離子(羧基部分)的質荷比之差為13而不是12[13]。由圖1可以看出，質荷比140與153之間相差13，且質荷比為140的碎片離子含4個碳原子，質荷比為153的碎片離子含5個碳原子，根據判斷規則，在C5和C6之間含有不飽和雙鍵。質荷比為222和234之間相差12，且質荷比為222的碎片離子含10個碳原子，質荷比為234的碎片離子含11個碳原子，根據判斷規則，在C11和C12之間含有不飽和雙鍵。同樣，質荷比262和274之間相差12，C14和 C15之間含有不飽和雙鍵。因此，金松酸是5,11,14-二十碳三烯酸。

2.1.2 榧籽油的紅外光譜分析(見圖2)

由圖2可以看出，721 cm-1處的吸收峰符合順式雙鍵C—H彎曲振動的特征吸收(730～655 cm-1) ，而在反式雙鍵C—H彎曲振動的特征吸收980～960 cm-1之間沒有出現中強的吸收峰，所以榧籽油中幾乎不含反式脂肪酸，即金松酸3個雙鍵均為順式雙鍵(若金松酸含反式雙鍵，以其10%左右的含量將會在980～960 cm-1之間出現1個中強的吸收峰)。

綜上所述，榧籽油中的二十碳三烯酸是順5,11,14-二十碳三烯酸，即金松酸。

2.2 榧籽油脂肪酸組成分析(見表2)

表2 榧籽油脂肪酸組成 %

注：表中數值為“平均值±SD”。下同。

由表2可以看出，榧籽油的主要脂肪酸中，棕櫚酸為7.34%～8.22%，硬脂酸為2.64%～3.03%，油酸為22.68%～35.10%，亞油酸為39.85%～46.15%，順11,14-花生二烯酸為2.17%～3.51%，金松酸為9.13%～12.96%。木榧和香榧在脂肪酸種類上沒有差別，但在含量上差異顯著。木榧的油酸和亞油酸比例接近1∶2，香榧的油酸和亞油酸比例接近1∶1.2，而且木榧的金松酸含量明顯高于香榧的。由此可知，香榧和木榧在各脂肪酸含量上有明顯差異，且木榧的多不飽和脂肪酸含量更高。

2.3 榧籽油主要微量成分組成分析(見表3)

表3 榧籽油主要微量成分組成 mg/kg

生育酚是一種重要的天然抗氧化劑，能有效阻斷自由基鏈式反應，預防和減輕體內細胞膜脂質過氧化損傷，保護細胞膜，清除自由基和預防癌癥[20-21]。常見植物油中生育酚常以α-生育酚和γ-生育酚為主，但榧籽油中卻以β-生育酚為主。β-谷甾醇是植物中常見的活性物質，具有抗氧化、防止動脈粥樣硬化、消炎等多種生理作用[22]。

由表3可以看出，榧籽油微量成分中β-生育酚含量最高，為1 325.75～1 769.06 mg/kg，其次為β-谷甾醇(921.87～1 167.91 mg/kg)，其后為α-生育酚(208.69～272.20 mg/kg)。而角鯊烯、菜油甾醇、豆甾醇、多酚含量較少，其中多酚為天然游離多酚。在后續的實驗中發現，若采取熱榨法制油，如將榧籽置于160℃高溫下烘烤0.5 h后趁熱壓榨制油，所得榧籽油中多酚含量達61.83 mg/kg，具體原理有待進一步研究。木榧和香榧籽油在微量成分種類上沒有差別，但在含量上差異明顯。在微量成分的含量上木榧均高于香榧。

相比橄欖油、茶籽油、芝麻油(見表4)，榧籽油的多酚含量最低，角鯊烯含量低于橄欖油和茶籽油，植物甾醇的含量略低于芝麻油但遠高于橄欖油和茶籽油。而在生育酚的組成上，榧籽油未檢出γ-生育酚、δ-生育酚，但其α-生育酚、β-生育酚及總生育酚均遠高于其他3種油。此外，常見植物油往往不含或只含有極少量的β-生育酚，而榧籽油的β-生育酚含量很高，這也是它的一個特征指標。

表4 橄欖油、茶籽油、芝麻油微量成分組成[23] mg/kg

注：n.d.代表未檢出。

3 結 論

利用紅外光譜法和氣相色譜-質譜聯用法鑒定了榧籽油所含的特殊脂肪酸——金松酸的結構，并分析了榧籽油的脂肪酸及微量成分組成。金松酸的結構為順5，11，14-二十碳三烯酸。榧籽油脂肪酸以亞油酸、油酸、金松酸為主，其微量成分以生育酚和β-谷甾醇為主，并發現不同產地不同品種的榧籽油其成分組成有一定差異。

綜合考慮脂肪酸及微量成分組成，木榧籽油的營養價值優于香榧籽油。同時，木榧青果的價格在5元/斤左右，香榧青果的價格在25元/斤左右。此外，木榧籽殼厚，種仁硬且口味差，不適合作為堅果食用；而香榧籽殼薄，種仁酥脆，風味俱佳，作為堅果廣受歡迎。因此，在未來的榧籽油產業化中，提倡以木榧為油料進行制油，一方面營養價值更高，另一方面成本低且充分利用木榧資源。

[1] 陳振德, 鄭漢臣. 榧屬植物的研究進展[J]. 國外醫藥(植物藥分冊), 1996, 11(4): 150-153.

[2] 王向陽, 修麗麗. 香榧的營養和功能成分綜述[J]. 食品研究與開發, 2005, 26(2): 20-22.

[3] 鄭仁木. 香榧栽培法[M]. 上海：上?？茖W技術出版社, 1959:18.

[4] 陳振德, 鄭漢臣, 陳志良, 等.香榧子油對實驗性動脈粥樣硬化形成的影響[J]. 中藥材, 2000, 23(9): 551-553.

[5] DONG D D, WANG H F, XU F, et al. Supercritical carbon dioxide extraction, fatty acid composition, oxidative stability, and antioxidant effect ofTorreyagrandisseed oil[J]. J Am Oil Chem Soc, 2014, 91(5): 817-825.

[6] NI Q X, GAO Q X, YU W W, et al. Supercritical carbon dioxide extraction of oils from twoTorreyagrandisvarieties seeds and their physicochemical and antioxidant properties[J]. LWT-Food Sci Technol, 2015, 60(2): 1226-1234.

[7] 黎章矩, 駱成方, 程曉建, 等. 香榧種子成分分析及營養評價[J]. 浙江林學院學報, 2005, 22(5): 540-544.

[8] WOLFF R L, PDRONO F, MARPEAU A M, et al. The seed fatty acid composition and the distribution ofΔ5-olefinic acids in the triacylglycerols of some taxaceae (TaxusandTorreya)[J]. J Am Oil Chem Soc, 1998, 75(11): 1637-1641.

[9] ENDO Y, OSADA Y, KIMURA F, et al. Effects of Japanese torreya (Torreyanucifera) seed oil on lipid metabolism in rats[J]. Nutrition, 2006, 22(5): 553-558.

[10] BERGER A, MONNARD I, BAUR M, et al. Epidermal anti-inflammatory properties of 5,11,14 20∶3: effects on mouse ear edema, PGE2levels in cultured keratinocytes, and PPAR activation[J]. Lipid Health Dis, 2002, 1: 5.

[11] ENDO Y, TSUNOKAKE K, IKEDA I. Effects of non-methylene-interrupted polyunsaturated fatty acid, sciadonic (all-cis-5,11,14-eicosatrienoic acid) on lipid metabolism in rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73(3): 577-581.

[12] 周亮, 劉元法, 金青哲, 等. 瓜蔞籽油理化性質及瓜蔞酸結構分析[J]. 食品科學, 2007, 28(11): 116-118.

[13] ZHANG J Y, YU Q T, LIU B N, et al. Chemical modification in mass spectrometry IV—2-alkenyl-4, 4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids[J]. Biol Mass Spectrom, 1988, 15(1): 33-44.

[14] 中國油脂植物編寫委員會. 中國油脂植物[M]. 北京: 科學出版社,1987: 525, 574.

[15] 李志曉, 金青哲, 葉小飛,等. 精煉過程中油茶籽油活性成分和抗氧化性的變化[J]. 中國油脂, 2015,40(8):1-5.

[16] 丁明, 鐘冬蓮. 茶油中總酚的測定方法[J]. 浙江農業科學, 2010, 1(6): 1369-1371.

[17] 羅凡, 費學謙, 方學智, 等. 固相萃取/高效液相色譜法測定茶油中的多種天然酚類物質[J]. 分析測試學報, 2011, 30(6): 696-700.

[18] 王興國, 金青哲. 油脂化學[M]. 北京: 科學出版社, 2012: 46-47.

[19] 鄒耀洪. 鄰氨基苯酚化學修飾試劑用于氣相色譜/質譜分析花粉脂肪酸[J]. 分析化學, 2004, 32(6): 747-751.

[20] 宋曉燕, 楊天奎. 天然維生素 E 的功能及應用[J]. 中國油脂, 2000, 25(6): 45-47.

[21] 孫登文, 雷炳福. 維生素 E 抗油脂氧化的功能探討[J]. 中國油脂, 1996, 21(3): 23-27.

[22] 李萬林. 植物甾醇的研究進展概述[J]. 飲料工業, 2013, 16(11): 48-51.

[23] 劉慧敏. 不同植物油微量成分與抗氧化能力的相關性研究[D]. 江蘇 無錫: 江南大學,2015.

StructuralidentificationofsciadonicacidandcomponentanalysisofTorreyagrandisseedoil

MAO Jiahui1, ZHAO Chenwei1, WANG Jianfeng2, ZHOU Yuchi2, TIAN Hua2, JIN Qingzhe1, WANG Xingguo1

(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2.Zhejiang Bailing Agriculture Development Co., Ltd., Jinhua 321000, Zhejiang, China)

The structure of the special fatty acid contained inTorreyagrandisseed oil, sciadonic acid, was analyzed by FT-IR and GC-MS, and the fatty acid composition and main trace components ofTorreyagrandisseed oil from different origins were analyzed. The results showed thatTorreyagrandisseed oil mainly contained nine kinds of fatty acids, such as linoleic acid (39.85%-46.15%), oleic acid (22.68%-35.10%), sciadonic acid (9.13%-12.96%), palmitic acid (7.34%-8.22%), and stearic acid(2.64%-3.03%). Sciadonic acid was a special fatty acid, and its structure wascis-5,11,14-eicosatrienoic acid. In addition,Torreyagrandisseed oil mainly contained seven kinds of trace components, such asβ-tocopherol (1 325.75-1 769.06 mg/kg),β-sitosterol(921.87-1 167.91 mg/kg), andα-tocopherol(208.69-272.20 mg/kg), etc.

Torreyagrandisseed oil; sciadonic acid; fatty acid; trace component

2016-11-05；

：2017-03-22

毛家輝(1992) ，男，碩士，主要從事特種油脂方面的研究工作(E-mail) 310961916@qq.com。

趙晨偉，工程師，碩士(E-mail) chenwei_zhao@163.com。

TS225.6；TS227

：A

：1003-7969(2017)07-0135-05