乳酸菌混合發酵對抑菌作用的影響研究

蔣欣容，瞿恒賢，陳大衛，陳霞，黃玉軍，印伯星，楊振泉，顧瑞霞

（揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127）

乳酸菌混合發酵對抑菌作用的影響研究

蔣欣容，瞿恒賢，陳大衛，陳霞，黃玉軍，印伯星，楊振泉，顧瑞霞

（揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127）

通過測定6株乳酸菌及其混合發酵對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌抑制作用，探究單一發酵及混合發酵對抑菌作用的影響。結果顯示，6株不同乳酸菌及其混合發酵對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌的抑制效果均不同。建立主成分分析模型，根據模型中累計貢獻率達75.284%兩個主成分，進行綜合評分，可得乳酸菌混合發酵抑菌效果高于任一單菌株發酵，乳酸菌混合發酵表現出廣譜抑菌性。通過排除乳酸及過氧化氫干擾，以及經pH 6.0處理、121℃，20 min熱處理、蛋白酶K處理，進一步對乳酸菌及其混合發酵抑菌物質分析，可知除乳酸外，不同乳酸菌及其混合發酵的發酵產物中存在其他抑菌物質，且抑菌產物中過氧化氫濃度不足以產生抑菌效果。乳酸菌發酵抑菌物質在酸性條件下活性高，對熱和蛋白質酶K敏感。

乳酸菌；混合發酵；廣譜抑菌；抑菌成分；主成分分析

Abstract:The antibacterial effect of single fermentation and mixed fermentation were studied by measuring the inhibitory ability of 6 strains of Lactic acid bacteria and their mixed fermentation on three Gram-positive bacteria and three Gram-negative bacteria.Test results revealed,6 strains of Lactic acid bacteria and their mixed fermentation had different effects on three Gram-positive bacteria and three Gram-negative bac?teria.Based on the cumulative contribution rate of 75.284%in the principal component analysis model,we can see that the antibacterial effect of mixed fermentation of Lactic acid bacteria was higher than any single strain.Mixed fermentation by 6 strains had a broad antibacterial spec?trum.Exclusion the organic acids and hydrogen peroxide,we has further analyzed antibacterial active ingredients of single fermentation and mixed fermentation by 6 strains at pH 6.0,in 121°C for 15 min or treated by Proteinase K.We found that there were some antimicrobial substances in the fermentation product without lactic acid.The concentration of hydrogen peroxide in antimicrobial substances was not enough to produce antibacterial effect.The antibacterial substances had favorable stability in acid condition.And the antibacterial substances made by mixed fermentation have been sensitive to heat and protein enzyme K.

Key words:Lactic acid bacteria;mixed fermentation;wide antimicrobial properties;antibacterial ingredients;principal component analysis

0 引言

乳酸菌具有維持腸道正常菌群平衡[1-2]，抑制病原菌繁殖，防止有害物質產生[3-5]，延緩衰老、降膽固醇、增強免疫力等多種功能特性[6]，被廣泛運用到食品、醫藥相關領域[7-8]。而單菌株抑菌活性及范圍，因各自代謝產物不同造成明顯差異，使其應用受到限制[9-10]。近年來，隨著醫學、現代營養學及腸道保健理論的發展，篩選具有特定功能特性的益生菌，及其發酵制品開發，在全世界引起了廣泛研究[11-12]。但對于如何利用多菌株進行發酵，提高發酵產品的廣譜抑菌特性，并綜合提高對宿主健康的有益作用，尚需進行深入研究。本文利用實驗室篩選獲得的具有良好抑菌特性的6株乳酸菌，探索混合發酵對體外抑菌特性的影響，以期為混合乳酸菌功能發酵產品的開發提供幫助。

1 實 驗

1.1 培養基制備

酶解脫脂乳培養基[14]：12%(w/v)的脫脂乳溶液，115℃，20 min滅菌，冷卻后添加質量濃度為0.5 g/L的中性蛋白酶，42℃恒溫水解2 h，92℃，30 min滅酶，冷卻備用。

LB液體培養基、PDA液體培養基、RCM液體培養基（購于廣東環凱微生物科技有限公司），取30.0 g培養基粉溶于1 000 mL蒸餾水，121℃，15 min滅菌備用。

固體培養基在相應的液體培養基中加入質量分數為1.0%瓊脂粉。

1.2 指試菌制備

大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，假單胞菌，艱難梭菌，枯草桿菌，漢遜德巴利酵母菌，黃曲霉菌均為揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室保藏提供。

大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌、假單胞菌、枯草桿菌原菌種分別接種于LB液體培養基，漢遜德巴利酵母菌、黃曲霉原菌種分別接種于PDA液體培養基，艱難梭菌原菌種接種于RCM液體培養基，37℃培養24 h，并用無菌生理鹽水調節菌懸液至107mL-1。

1.3 乳酸菌上清液制備

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus cidophilus）ss，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）s7，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）grx19，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）g9，雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）BLC和嗜熱鏈球菌（Strep?tococcus.thermophiles）90-57，均由江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室分離保藏。

將6株乳酸菌及其混合乳酸菌，按照4%接種量，分別接種于脫脂乳酶解培養基中，37℃發酵12 h，取發酵菌液，于Legend mach高速冷凍離心機4 500 r/min離心20 min，經0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液為乳酸菌代謝上清液。

1.4 乳酸菌上清液抑菌性能分析

1.4.1 抑菌活性測定

采用雙層瓊脂擴散打孔法[15]，進行抑菌測定。以滅菌MRS液體培養基為空白對照，37℃培養12 h后觀察有無抑菌圈形成，并測量其抑菌直徑。

1.4.2 乳酸、過氧化氫排除

用乳酸調節與乳酸菌上清液相同pH的MRS液體培養基作為排除乳酸干擾的對照。加入接有指示菌的培養基孔內，用瓊脂擴散打孔法測定其抑菌效果，取3次平行測定的平均值。

在過氧化氫酶最適pH值條件下以質量濃度為1 g/L過氧化氫酶處理乳酸菌上清液，37℃水浴1 h，處理后將上清液調至原pH值，作為排除過氧化氫干擾的對照。加入接有指示菌的培養基孔內，用瓊脂擴散打孔法測定其抑菌效果，取3次平行測定的平均值。

1.4.3 pH值處理

用氫氧化鈉溶液調節乳酸菌上清液pH為pH 6.0，加入接有指示菌的培養基孔內，以未調節pH值的乳酸菌上清液為對照，用瓊脂擴散打孔法測定抑菌活性，取3次平行測定的平均值。

1.4.4 熱處理

乳酸菌上清液經121℃水浴處理20 min，加入接有指示菌的培養基孔內，以未調節pH值的乳酸菌上清液為對照，用瓊脂擴散打孔法測定抑菌活性，取3次平行測定的平均值。

1.4.5 酶處理

在最適pH值條件下以質量濃度為1 g/L蛋白酶K處理供試樣品，37℃水浴1 h，處理后將樣品調至原pH值，加入接有指示菌的培養基孔內，以未調節pH值的乳酸菌上清液為對照，用瓊脂擴散打孔法測定抑菌活性，取3次平行測定的平均值。

1.5 數據統計與分析

采用SPSS20.0軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌及其混合發酵對革蘭氏陽性菌抑制作用

6株乳酸菌及其1∶1∶1∶1∶1∶1混合后，按4%接種于酶解脫脂乳培養基，在37℃下發酵12 h的樣品，經離心過濾處理，取上清液，對革蘭氏陽性菌抑制作用如圖1所示。

圖1 乳酸菌及其混合發酵對革蘭氏陽性菌抑制作用

由圖1可以看出，不同乳酸菌及其混合發酵上清液對金黃葡萄球菌、枯草桿菌、艱難梭菌三種革蘭氏陽性菌抑制作用存在差異，任一單菌株均對其中1種或2種革蘭氏陽性菌有抑制作用，而混合菌株發酵都表現出對3種革蘭氏陽性菌的廣譜抑菌性作用。

2.2 乳酸菌及其混合發酵對革蘭氏陰性菌抑制作用

6株乳酸菌及其1∶1∶1∶1∶1∶1混合后，按4%接種于酶解脫脂乳培養基，在37℃下發酵12 h的樣品，經離心過濾處理，取上清液，對3種革蘭氏陰性菌抑制作用如圖2所示。

圖2 乳酸菌及其混合發酵對革蘭氏陰性菌抑制作用

由圖2可以看出，混合菌株發酵上清液對3種革蘭氏陰性菌均有較好抑制作用，抑菌圈直徑均大于21 mm。除90-57菌株對3種革蘭氏陰性菌抑菌效果較弱外，其余5株乳酸菌對3種革蘭氏陰性菌也具有一定的抑制作用，但不同單菌株對3種革蘭氏陰性菌的抑菌效果存在較大區別。

2.3 乳酸菌及其混合發酵抑菌性主成分分析

混合菌株發酵表現對金黃葡萄球菌、艱難梭菌最強的抑制效果，對枯草桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、假單胞菌抑制效果均介于單菌株發酵最大值與最小值之間。就對6項研究指標來看，利用主成分分析法對乳酸菌及其混合發酵的抑菌效果的綜合評分進行評價。按主成分分析法中特征值大于或等于1的原則提取2個主成分，結果如表1所示。由表1可以看出，第1主成分特征值為3.332，占特征值總和的55.54%，第2主成分特征值為1.185，占特征值總和的19.743%，二者特征值均大于1，且累計貢獻率為75.284%，故提取這兩個主成分就能夠比較好的解釋乳酸菌及其混合發酵不同抑菌效果。

表1 主成分提取結果及成分得分系數

表2 主成分貢獻率

由公式：綜合因子得分(F)=各成分得分×對應權重之和(成分得分=成分得分系數與原始變量標準化值乘積之和)。采用主成分分析法獲得成分得分系數，由表2成分得分系數矩陣，得出綜合得分排名，如表3所示。

表3 綜合因子得分

由表3可以看出，乳酸菌及其混合發酵綜合評分（F）進行比較：混合菌株＞g9＞BLC＞s7＞grx19＞ss＞90-57?；旌暇臧l酵F值，高于任一單菌株發酵。主成分分析表明，對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌的抑菌效果而言，混合菌株發酵均高于任一單菌株發酵?？赡芫昊旌习l酵條件下，通過各自的代謝活動而有利于各方或偏利于一方，提高代謝產物的產量或增加種類，從而擴大抑菌范圍，提升抑菌效果。

2.4 乳酸菌及其混合發酵抑菌性成分

2.4.1 乳酸排除

用乳酸調節與不同乳酸菌及其混合發酵上清液相同pH的MRS液體培養基作為乳酸排除組，并以原發酵上清液作為對照，排除乳酸對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌抑菌性的干擾，結果如圖3所示。

圖3 乳酸對乳酸菌抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的影響

不同乳酸菌及其混合發酵上清液的乳酸排除組，對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌抑菌水平均明顯低于原發酵上清液的抑菌水平。此結果說明，不同乳酸菌及其混合發酵上清液中，除乳酸外還存在其他的代謝產物，對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌具有抑制作用。

2.4.2 過氧化氫排除

以過氧化氫酶處理不同乳酸菌及其混合發酵上清液作為過氧化氫排除組，并以原發酵上清液作為對照，排除過氧化氫對3株革蘭氏陽性菌和3株革蘭氏陰性菌抑菌性的干擾，結果如圖4所示。

不同乳酸菌及其混合發酵上清液，經過氧化氫酶處理后，對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌抑菌效果略低于原發酵上清液，可見過氧化氫并不是主要抑菌物質。在排除過氧化氫干擾后，乳酸菌混合發酵組對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌抑菌效果均略微降低，并無顯著性影響?？赡芟啾扔趩尉臧l酵，混合菌株發酵過程中不產過氧化氫或產過氧化氫含量較少不能產生抑菌效果。

2.4.3 pH調節對抑菌活性影響

以原發酵上清液作為對照，調節不同乳酸菌及其混合發酵上清液pH為6.0，研究pH對發酵上清液抑制3株革蘭氏陽性菌和3株革蘭氏陰性菌效果的影響，結果如圖5所示。

當調節不同乳酸菌及其混合發酵上清液pH值至6時，其對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌抑菌水平均明顯低于原發酵上清液的抑菌水平，可見在較高pH值水平下，不利于乳酸菌代謝產物發揮抑菌作用。

2.4.4 熱處理對抑制活性影響

不同乳酸菌及其混合發酵上清液經121℃水浴處理20 min，并以原發酵上清液作為對照，研究熱處理對發酵上清液抑制3株革蘭氏陽性菌和3株革蘭氏陰性菌效果的影響，結果如圖6所示。

不同乳酸菌及其混合發酵上清液經121℃,20 min熱處理后，其對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌抑菌水平低于原上清液抑菌水平。且不同于上述部分乳酸菌單獨發酵，混合發酵上清液經熱處理后，抑菌水平下降顯著，可能在混合發酵過程中，產生對熱敏感的抑菌物質多于乳酸菌單獨發酵。

2.4.5 酶處理對抑制活性影響

用蛋白酶K處理不同乳酸菌及其混合發酵上清液，并以原發酵上清液作為對照，研究酶處理對發酵上清液抑制3株革蘭氏陽性菌和3株革蘭氏陰性菌效果的影響，結果如圖7所示。

乳酸菌混合發酵上清液經蛋白酶K處理后，其對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌的抑菌水平低于原發酵上清液抑菌水平，相比于大部分單菌株發酵組，變化顯著，可能在混合發酵過程中，菌株協同代謝產生對蛋白質酶敏感的抑菌物質。

3 結 論

本文研究了6株乳酸菌及其混合發酵對3種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌抑制作用。乳酸菌混合發酵上清液對3種革蘭氏陽性菌，3種革蘭氏陰性菌均有抑制作用，乳酸菌混合發酵抑菌譜較寬，比6株不同乳酸菌發酵抑菌范圍明顯增大。主成分分析表明，乳酸菌混合發酵抑菌效果綜合評分均高于單菌株發酵。

圖4 過氧化氫對乳酸菌抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的影響

圖5 pH值對乳酸菌抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的影響

圖6 熱處理對乳酸菌抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的影響

進一步對乳酸菌抑菌有效成分分析，除乳酸外，不同乳酸菌及其混合發酵的發酵產物中存在其他抑菌物質。經過氧化氫酶處理后，不同于部分單一乳酸菌發酵組，乳酸菌混合發酵上清液的抑菌活性無顯著性變化，推測混合乳酸菌發酵產生的抑菌物質中無過氧化氫，或者其所含的過氧化氫濃度不足以產生抑菌效果。經調節不同乳酸菌及其混合乳酸菌發酵上清液pH至6時，抑菌效果作用顯著降低，說明主要的抑菌物質需要在較低pH值協同作用下，才能發揮良好的抑菌效果。經121℃，20 min熱處理和蛋白酶K處理后，乳酸菌混合發酵上清液抑菌效果均低于原發酵上清液，變化顯著，這不同于部分乳酸菌，可能在混合發酵過程中，菌株協同代謝產生對熱和蛋白質酶敏感的抑菌物質，增強了混合發酵菌株抑菌的廣譜性及抑菌效果。

圖7 酶處理對乳酸菌抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的影響

本研究結果表明，6株乳酸菌進行混合發酵，對綜合抑菌效果的發揮具有十分重要的貢獻，為混合多菌株乳酸菌功能發酵產品的開發提供幫助。

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Study on bacteriostatic activity of mixed cultivation of Lactic acid bacteria

JIANG Xinrong,QU Hengxian,CHEN Dawei,CHEN Xia,HUANG Yujun,YIN Boxing,YANG Zhenquan,GU Ruixia
(The Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)

Q939.11+7

A

1001-2230（2017）09-0011-06

2017-01-13

國家自然科學基金（31571855）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B12）；江蘇省高校自然科學研究重大項目（12KJA550003）；江蘇省科技支撐計劃課題項目（BY2014 117-04）。

蔣欣容（1991-），女，碩士研究生，研究方向為乳品科學研究。

顧瑞霞