豬源纖維蛋白貼對大鼠肝臟及肝素化兔臀大肌創面的止血作用Δ

李偉達，鄧樂君，朱晉輝，陳灶妹，李健，張俊輝，萬華印，李茹冰#（1.廣州軍區廣州總醫院藥劑科/廣州市老年慢病患者合理用藥重點實驗室，廣州 10010；2.廣東藥科大學中藥學院，廣州 10006；3.南方醫科大學藥學院，廣州 101；.南方醫科大學檢驗與生物技術學院，廣州 101；.廣州市拜特凇醫藥科技有限公司，廣州 10663）

豬源纖維蛋白貼對大鼠肝臟及肝素化兔臀大肌創面的止血作用Δ

李偉達1，2＊，鄧樂君1，3，朱晉輝4，陳灶妹1，2，李健1，2，張俊輝5，萬華印5，李茹冰1，2#（1.廣州軍區廣州總醫院藥劑科/廣州市老年慢病患者合理用藥重點實驗室，廣州 510010；2.廣東藥科大學中藥學院，廣州 510006；3.南方醫科大學藥學院，廣州 510515；4.南方醫科大學檢驗與生物技術學院，廣州 510515；5.廣州市拜特凇醫藥科技有限公司，廣州 510663）

目的：研究豬源纖維蛋白貼（DBT）對大鼠肝臟和肝素化兔臀大肌出血創面的止血效果。方法：48只大鼠和24只兔均隨機分為假手術組、手術對照組（紗布止血）、醫用膠原蛋白海綿組和DBT組，除假手術組外，其他各組動物分別建立大鼠肝臟出血模型或肝素化兔臀大肌靜脈出血模型。記錄各組動物止血時間、計算出血量；觀察大鼠術后3、13周DBT降解、肝臟創面愈合及粘連情況；考察醫用膠原蛋白海綿組和DBT組肝素化兔的再滲血率。結果：與假手術組比較，手術對照組動物的止血時間和出血量均顯著升高（P＜0.01）；與手術對照組比較，DBT組和醫用膠原蛋白海綿組動物的止血時間和出血量均顯著減少（P＜0.01）。術后3周和13周，各組大鼠創面均有不同程度粘連，但粘連評分比較差異無統計學意義（P＞0.05）；術后13周兩給藥組大鼠肝臟肝緣稍鈍，但基本已恢復至術前狀態，愈合狀況良好；DBT能降解、吸收完全。DBT組兔的再滲血率為33.3%，醫用膠原蛋白海綿組為66.7%。結論：DBT對脆性臟器和凝血功能障礙機體具有較好的止血效果，且能降解吸收；其作用效果與醫用膠原蛋白海綿相當，且黏合強度略強于后者。

纖維蛋白貼；肝臟出血；臀大肌出血；止血；凝血功能障礙；大鼠；兔

止血不僅是搶救傷員和外科手術的重要措施，而且是戰地救援時的主要手段之一。傳統的包扎、結扎、壓迫止血和藥物促凝等方法對實質性器官的大面積滲血以及肝素化后手術過程的出血難以起到有效止血作用[1]。近年來，可吸收性止血材料的開發成為了止血領域研究的熱點。醫用膠原蛋白海綿具有低抗原性和良好的生物相容性，使用后有利于細胞附著和遷移[2]，但黏附性較差、易脫落。纖維蛋白膠為主動性止血物，模擬人體內凝血機制的最后一步——形成不溶性纖維蛋白，達到快速止血的目的。但其使用方法復雜，在出血量大時易被沖掉，難以凝集成膠狀。豬源纖維蛋白貼（DBT）是從豬體內提取的有效成分，其將正常情況下會發生反應的纖維蛋白原和凝血酶凍干在一起，并增加凍干膠原蛋白層，形成雙層凍干海綿片。DBT在理論上能達到生化止血與機械止血相結合的目的，體現更優越的止血性能。本實驗旨在研究DBT對大鼠體內脆性臟器以及凝血功能障礙兔臀大肌靜脈出血創面的止血效果，并觀察動物術后的創面黏連和藥物降解情況，為研發DBT作為可吸收止血制品提供藥效學參考。

1 材料

1.1 儀器

ER353A兒童理發器（日本松下公司）；SB32000電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

DBT（廣州市眾為生物技術有限公司，批號：20140501，規格：5 cm×10 cm×0.5 cm，含纖維蛋白原5 mg/cm2、凝血酶6 U/cm2、膠原蛋白3 mg/cm2，于25 ℃以下保存）；醫用膠原蛋白海綿（無錫貝迪生物工程有限公司，批號：20140407，規格：5 cm×5 cm×0.2 cm）；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號：140418，純度：＞90%）；10%水合氯醛（廣州軍區廣州總醫院自制，批號：140526，規格：9 g）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號：51502109，規格：2 mL∶12 500 u）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠48只，♀♂各半，體質量220～250 g，6～8周齡，實驗動物許可證號：44007200017081（♂）、44007200017082（♀）；普通級新西蘭兔24只，♀♂各半，體質量2.0～2.4 kg，10～14周齡，實驗動物許可證號：44007600002235（♂）、44007600002305（♀）。動物均由廣東省醫學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 大鼠肝臟創面止血實驗

將48只SD大鼠隨機分成4組，即假手術組、手術對照組、醫用膠原蛋白海綿組和DBT組，每組12只。各組大鼠ip 10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉后，固定、上腹部去毛，常規消毒，于腹部劍突下正中開一2～3 cm切口，暴露肝臟，用棉簽小心將大鼠肝左外葉游離于墊有紗布塊的腹腔外。接著用病理切片刀在肝臟表面切除一層2 cm×2 cm的組織，擦去滲出血液，DBT組和醫用膠原蛋白海綿組大鼠立即貼上2.5 cm×2.5 cm DBT（或醫用膠原蛋白海綿），并用已稱質量的無菌紗布塊輕輕按壓創口。待創口不再出血，記錄止血時間，計算出血量，出血量（g）＝止血后紗布塊質量－止血前紗布塊質量。手術對照組大鼠擦去滲出血液后則直接用無菌紗布塊壓迫止血。大鼠止血后肝臟復位，分別縫合肌層和表皮。假手術組大鼠開腹游離肝葉后，即復位、關閉腹腔。術后3、13周后各組大鼠分別取6只開腹觀察DBT降解、腹腔內粘連和肝臟愈合情況，并對粘連程度進行評分。評定標準參考Nair SK等[3]報道方法并加以改進：完全無粘連，計0分；肝葉間或肝葉與腹壁間有1條粘連帶，計1分；肝葉間或肝葉與腹壁間有2條粘連帶，計2分；肝葉間或肝葉與胃腸道間或與腹壁間有較大面積粘連，但能鈍性分離，計3分；肝葉直接粘連到腹壁，必須銳性分離，計4分。

2.2 肝素化兔臀大肌創面止血實驗

24只新西蘭兔按“2.1”項下方法分組，每組6只。各組兔耳緣靜脈iv 3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg），并iv肝素鈉（500 u/kg）。之后，各組兔左側臀大肌術區剃毛，碘酊、75%乙醇消毒表皮，切開皮膚，找到臀大肌上縱向的粗大靜脈，用病理切片刀切除1 cm×2 cm、厚約1 mm的臀大肌肌肉（切除部位包含臀大肌上的靜脈）。擦去噴出的血液，DBT組和醫用膠原蛋白海綿組兔立即將2.5 cm×5 cm的DBT（或醫用膠原蛋白海綿）貼于創面，同時用已稱質量的紗布塊蓋在止血材料上，按壓1 min，之后每30 s觀察一次止血情況。待創面不再出血時記錄止血時間（超過15 min則以15 min計），稱量紗布塊的質量并計算止血量。手術對照組兔擦去開始流出的血液后用已稱質量紗布塊吸取流出的血液（不加按壓）。假手術組兔在暴露臀大肌靜脈后不制造創面，其余處理與手術對照組相同。此外，醫用膠原蛋白海綿組和DBT組在止血初步成功后10 min，最大限度屈伸兔左側髖關節、膝關節10次，記錄止血材料是否脫離并計算再滲血率（再出血動物只數/動物總數×100%）。

2.3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析。止血時間和出血量以±s表示，方差齊性和正態分布時采用單因素方差分析，各組間多重比較采用Dunnett-t檢驗；方差不齊或非正態分布時采用Kruskal-Wallis檢驗。粘連程度評分采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠肝臟創面止血實驗結果

3.1.1 止血時間和出血量 與假手術組比較，手術對照組大鼠的止血時間和出血量均顯著增加（P＜0.01）；與手術對照組比較，DBT組和醫用膠原蛋白海綿組大鼠的止血時間均顯著縮短（P＜0.01），出血量均顯著減少（P＜0.01），結果詳見表1。

表1 各組大鼠肝臟創面的止血時間和出血量比較（±s，n＝12）Tab 1 Comparison of hemostatic time and bleeding amount in liver wound of rats in each group（±s，n＝12）

表1 各組大鼠肝臟創面的止血時間和出血量比較（±s，n＝12）Tab 1 Comparison of hemostatic time and bleeding amount in liver wound of rats in each group（±s，n＝12）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01；與手術對照組比較，#P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊P＜0.01；vs.operation control group，#P＜0.01

出血量，g 0.00±0.00 1.29±0.59＊0.08±0.07#0.15±0.08#組別假手術組手術對照組醫用膠原蛋白海綿組DBT組止血時間，s 1.0±0.9 607.0±225.2＊27.8±6.1#24.1±2.9#

3.1.2 愈合情況和粘連程度 術后3周解剖，DBT組和醫用膠原蛋白海綿組絕大部分大鼠肝臟創面仍有肉眼可見藥物殘留；而在術后13周，藥物降解吸收完全，無明顯殘留物，兩組大鼠肝臟肝緣稍鈍，但已基本恢復至術前狀態，愈合狀況良好。術后3、13周，各組大鼠均無感染和死亡；與假手術組比較，各組大鼠手術創面均有不同程度的粘連（P＜0.01）；DBT組和醫用膠原蛋白海綿組較手術對照組的粘連減輕，但差異均無統計學意義（P＞0.05），結果詳見表2。

表2 各組大鼠肝臟創面止血后粘連程度評分比較（±s，n＝6）Tab 2 Comparison of adhesion degree score after wound hemostasis in liver of rats in each group（±s，n＝6）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊P＜0.01

組別假手術組手術對照組醫用膠原蛋白海綿組DBT組術后13周粘連平均分0 1.17±0.75＊1.33±0.52＊1.00±0.89＊術后3周得分只數0分1分2分3分4分術后13周得分只數0分1分2分3分4分6 0 0 0 0 0 1 1 0 2 2 4 0 3 3 1 0 1 0 0術后3周粘連平均分0 2.83±0.75＊2.33±0.82＊2.00±0.63＊6 1 0 2 0 3 4 2 0 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0

3.2 肝素化兔臀大肌創面止血實驗結果

與假手術組比較，手術對照組兔的止血時間和出血量均顯著增加（P＜0.01）；與手術對照組比較，DBT組和醫用膠原蛋白海綿組兔的止血時間明顯縮短（P＜0.01），出血量顯著減少（P＜0.01）；在屈伸兔左側髖關節、膝關節10次后，醫用膠原蛋白海綿組兔的再滲血率為66.7%，DBT組為33.3%，結果詳見表3。

4 討論

早在20世紀90年代，纖維蛋白膠作為止血藥（止血材料）已被美國FDA批準上市[4]，凝血酶也已被1995年版《中國藥典》（二部）收載。根據原國家食品藥品監督管理局規定，自2006年9月30日起，纖維蛋白膠類產品已從醫療器械改為按照藥品注冊管理。該類止血制品模擬正常生物血液凝固的最后反應階段，不依賴機體本身的止血機制。在鈣離子促進下，凝血酶直接作用于纖維蛋白原，形成纖維蛋白單體，且凝血酶能激活凝血因子Ⅶ、ⅩⅢ，使纖維蛋白單體經過氫鍵共價結合成為不溶性纖維蛋白絲多聚體[5]。同時，凝血酶還能增強凝血因子Ⅴ、ⅩⅢ活性，具有促進血小板和上皮細胞生成等作用，促使凝血酶原轉變為凝血酶[6-7]，加速凝血。

表3 各組兔臀大肌創面的止血時間、出血量和再滲血率比較（±s，n＝6）Tab 3 Comparison of hemostatic time，bleeding amount and re-bleeding rate in gluteus maximus wound of rabbits in each group（±s，n＝6）

表3 各組兔臀大肌創面的止血時間、出血量和再滲血率比較（±s，n＝6）Tab 3 Comparison of hemostatic time，bleeding amount and re-bleeding rate in gluteus maximus wound of rabbits in each group（±s，n＝6）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01；與手術對照組比較，#P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊P＜0.01；vs.operation control group，#P＜0.01

組別假手術組手術對照組醫用膠原蛋白海綿組DBT組66.7 33.3止血時間，s 42.3±32.7 742.2±189.7＊72.3±27.8#122.3±54.5#出血量，g 0.1±0.1 18.1±6.0＊3.0±2.0#3.6±3.0#再滲血率，%

纖維蛋白膠噴涂后能迅速形成一層半透明的網狀纖維蛋白凝膠，該凝膠具有一定的機械強度和黏合力，黏附創面而達到防止滲血的作用，并能促進傷口愈合；但該制劑在使用前需較長的溶解過程，且用于止血時易與其他組織粘連，這些缺點限制了其應用[8]。孟志云等[9]研制的纖維蛋白膠粉解決了溶解時間過長的問題，但粉劑易造成使用時混合配比不均勻。近年來，關于復合凍干纖維蛋白敷料的研究相對較多[10-13]，能起到生化止血和機械止血相結合共同增加止血效果的作用。黃遠鏗等[14]研究的纖維蛋白貼中，纖維蛋白成分與膠原蛋白相結合，并添加核黃素，起到誘導創面細胞再生的作用。Richard W等[15]研究了國外的Fibrin patch（FP）在豬部分腎切除手術中的止血效果，結果顯示FP在不閉塞腎動脈的情況仍能有效止血?？梢?，固體纖維蛋白凍干海綿片是未來纖維蛋白類止血產品的發展趨勢。

本實驗研究的DBT的有效成分均為豬源性，其來源廣泛易得，可大大降低成本。而且該豬血漿是利用靜脈導管無菌采血法獲得（專利申請號：201520170962.1），相對屠殺式采血法，可避免血液污染，并能減少動物的浪費。膠原蛋白則是從健康生豬的肌腱中獲得，膠原具有良好的生物降解性、細胞適應性和低抗原性，并能促進細胞增殖[16]?；煊欣w維蛋白原與凝血酶的膠原蛋白，能在纖維蛋白膠黏附、封鎖創面后繼續吸收滲出的血液，阻止血液沖破貼敷料。

本研究結果表明，DBT和醫用膠原蛋白海綿均能明顯降低大鼠的出血量、縮短止血時間，且DBT組相比于醫用膠原蛋白海綿組的平均止血時間較短，但平均出血量較大，推測DBT能迅速貼附、封閉創面而縮短止血時間，但其吸收液體能力則較弱。實驗發現，已上市的醫用膠原蛋白海綿結構空隙小且多，較DBT致密、韌性好；在肝素化兔臀大肌切割靜脈出血的止血實驗中也發現，上市對照物的止血時間也略短于DBT。然而，單純膠原蛋白與創面的黏附性卻不如DBT，在最大限度屈伸兔左側髖關節、膝關節后，DBT組兔的再滲血率明顯低于醫用膠原蛋白海綿組?？梢?，加入纖維蛋白原和凝血酶凍干層的DBT在止血持久性方面具有一定優勢，用于體內創面不易移位或脫落。另一方面，相比于上市產品，DBT的結構致密性、蛋白的純度或含量在工藝上還有提升的空間。

從大鼠的粘連程度評分結果看出，術后3周DBT組、醫用膠原蛋白海綿組和手術對照組大鼠均有不同程度的粘連；而術后13周，DBT和膠原蛋白海綿材料在大鼠體內基本降解，粘連情況也均有好轉。DBT在組織粘連方面較醫用膠原蛋白海綿略為輕微，可能也與膠原蛋白的黏合不緊密導致二次滲血或移位有關。雖然DBT為異源性蛋白止血制品，但用于大鼠術后觀察至13周，并無動物死亡，藥物在體內可降解吸收完全，13周后無肉眼可見殘留物?？梢?，DBT并未引起機體劇烈的免疫反應，但具體的過敏性、免疫性及其他相關毒理學仍需進一步研究。

綜上所述，DBT對動物體內脆性臟器和凝血功能障礙性機體的出血創面均能有效止血，其與傷口的貼附力和止血持久性相比于單純的膠原蛋白海綿更具優勢。而且DBT的原料來源易得，成品攜帶方便，使用操作簡單，可根據需求不同，裁剪成各種規格，符合臨床手術應用和軍事戰備的實際要求。若在后續的相關藥理毒理學研究中，未發現明顯的毒性反應，則DBT有望成為新型的纖維蛋白類止血產品。

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Study on the Hemostatic Effect of Porcine Fibrin Sealant Patch on Bleeding Wound of Liver in Rats and Gluteus Maximus in Heparinized Rabbits

LI Weida1，2，DENG Lejun1，3，ZHU Jinhui4，CHEN Zaomei1，2，LI Jian1，2，ZHANG Junhui5，WAN Huayin5，LI Rubing1，2（1.Dept.of Pharmacy，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA/Guangzhou Key Laboratory of Rational Drug Use for the Elderly with Chronic Disease，Guangzhou 510010，China；2.School of TCM，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；3.School of Pharmacy，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；4.School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；5.Guangzhou Beit Song Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China）

OBJECTIVE：To study the hemostatic effect of porcine fibrin sealant patch（DBT）on bleeding wound of liver in rats and gluteus maximus in heparinized rabbits.METHODS：48 rats and 24 rabbits were randomly divided into sham operation group，operation control group（gauze hemostasis），medical collagen sponge group and DBT group.Except for sham operation group，animals in other groups were reduced for rat model with liver bleeding or heparinized rabbit model with gluteus maximus bleeding.The hemostatic time was recorded，bleeding amount was calculated；DBT degradation and wound adhesion in liver after 3，13 weeks were observed；re-bleeding rate of heparinized rabbits in medical collagen sponge group and DBT group were investigated.RESULTS：Compared with sham operation group，the hemostatic time and bleeding amount of animals in operation control group were significantly increased（P＜0.01）.Compared with operation control group，the hemostatic time and bleeding amount of animals in DBT group and medical collagen sponge group were significantly reduced（P＜0.01）.After 3，13 weeks，different degree of adhesion appeared in the wound of rats in each group，while the adhesion scores had no statistical significances（P＞0.05）.After 13 weeks，liver margin of rats in administration groups was slightly blunt，but it basically had been restored to preoperative state，with good healing.DBT can be degraded and absorbed completely.The re-bleeding rate of rabbits in DBT group were 33.3%，66.7%in medical collagen sponge group.CONCLUSIONS：DBT has good hemostatic effect on fragile organs and the body with blood coagulation dysfunction，and can be degraded and absorbed.Its effect is equivalent to medical collagen，while the adhesive strength is slightly better than the latter.

Fibrin sealant patch；Hepatorrhagia；Gluteus maximus bleeding；Hemostasis；Blood coagulation dysfunction；Rats；Rabbits

R332；R605.972

A

1001-0408（2017）28-3911-04

2016-12-16

2017-08-22）

（編輯：劉明偉）

國家科技重大新藥創制項目（No.2013ZX09J13110）；中央軍委2016年度軍隊后勤科研計劃項目（No.CGZ16C009）；廣州市科技計劃項目（No.201509010012、201704020173）

＊碩士研究生。研究方向：藥理學。電話：020-36221191。E-mail：liweida123@126.com

#通信作者：教授，碩士生導師，博士。研究方向：生化藥理、新藥研究。電話：020-36221191。E-mail：lrb90927@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.07