驅蟲斑鳩菊中紫鉚素對人永生化角質形成細胞株HaCaT增殖及細胞分泌因子的影響Δ

王志杰，高莉，霍仕霞，譚雪，羅靜鶯，閆明#（1.石河子大學藥學院，新疆石河子83003；.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所/新疆維吾爾醫方劑學實驗室，烏魯木齊 830049）

驅蟲斑鳩菊中紫鉚素對人永生化角質形成細胞株HaCaT增殖及細胞分泌因子的影響Δ

王志杰1＊，高莉2，霍仕霞2，譚雪2，羅靜鶯2，閆明2#（1.石河子大學藥學院，新疆石河子832003；2.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所/新疆維吾爾醫方劑學實驗室，烏魯木齊 830049）

目的：研究驅蟲斑鳩菊（VW）中紫鉚素對人永生化角質形成細胞株HaCaT的增殖及細胞分泌因子的影響，初步探討VW中紫鉚素治療白癜風的機制。方法：采用MTT法測定0（空白對照）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL紫鉚素作用于HaCaT細胞48 h后的細胞存活率；采用酶聯免疫吸附法測定0.5、1.0、5.0 μg/mL紫鉚素作用于HaCaT細胞48 h后培養液中細胞分泌因子內皮素1（ET-1）、ET-3、黑素細胞刺激素（MSH）、干細胞因子（SCF）、堿性纖維細胞生長因子（bFGF）的含量。結果：與空白對照比較，0.1～5.0 μg/mL紫鉚素作用48 h后細胞存活率均有不同程度升高，而10.0 μg/mL紫鉚素作用后細胞存活率降低；0.5、1.0、5.0 μg/mL紫鉚素作用48 h后培養液中ET-1、SCF、bFGF含量均顯著增加（P＜0.01），1.0、5.0 μg/mL紫鉚素作用48 h后培養液中ET-3、MSH含量顯著增加（P＜0.01）。結論：紫鉚素可促進HaCaT細胞的增殖，其作用機制可能與促進細胞分泌因子ET-1、ET-3、MSH、SCF、bFGF的分泌有關。

驅蟲斑鳩菊；紫鉚素；人永生化角質形成細胞株HaCaT細胞；增殖；細胞因子

驅蟲斑鳩菊[Vernonia anthelmintica（L.）Willd]為菊科（Compositae）斑鳩菊屬一年生草本植物[1]，可用于治療痰飲浮腫、濕痹疼痛、腸內寄生蟲、白癜風等[2]。白癜風白斑的形成主要有兩種機制：一種是黑素合成能力下降或因傳輸障礙使其不能傳輸到周圍角質細胞；另一種是黑素細胞部分或全部缺失[3]。臨床研究結果表明，驅蟲斑鳩菊注射液、復方驅蟲斑鳩菊搽劑均對白癜風有較好的療效[4-5]，但具體的藥效成分及作用機制不明。有研究驗證實，驅蟲斑鳩菊中紫鉚素可以使黑素細胞增殖并促進黑素合成，具有抗白癜風的作用[6-7]。角質形成細胞和黑素細胞是人表皮中兩種重要的組成細胞，其在結構和功能上有密切的聯系[8]。角質形成細胞可通過分泌一些生長因子或者細胞基質成分，直接或間接地對黑素細胞的增殖、黑素合成和轉運等活動進行調節[9]。本研究擬考察驅蟲斑鳩菊中紫鉚素對人永生化角質形成細胞株HaCaT的增殖以及細胞分泌因子的影響，初步探討驅蟲斑鳩菊中紫鉚素治療白癜風的藥理作用機制。

1 材料

1.1 儀器

Bm-37xay倒置顯微鏡（上海光學儀器六廠）；1510全波長酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；SQP電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

紫鉚素（新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所自制[7]，批號：20151208，純度：≥98%）；DMEM干粉培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國HycLone公司）；黑素細胞刺激素（MSH）、干細胞因子（SCF）、堿性纖維細胞生長因子（bFGF）、內皮素1（ET-1）、ET-3酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號：GR201609-1）；MTT（美國Amresco公司）；二甲基亞砜（DMSO，天津市光復化工研究所）；其余試劑均為分析純。

1.3 細胞

人永生化角質形成細胞株HaCaT購自中國典型培養物保藏中心（武漢大學細胞庫）。

2 方法

2.1 細胞培養

復蘇HaCaT細胞后，加入含有10%胎牛血清的DMEM完全培養液在37℃、5%CO2孵箱內培養，待細胞貼壁后更換新鮮的完全培養液，繼續培養、傳代。選擇對數生長期的細胞進行試驗。

2.2 MTT法測定細胞增殖活性

取對數生長期的細胞，用1.0 mL 0.25%胰酶消化制成細胞懸液，調整細胞密度為5×104mL－1，接種于96孔細胞培養板中，每孔接種100 μL。將細胞置于37℃、5%CO2孵箱內培養過夜。然后棄培養基，依次加入終質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL的紫鉚素含藥培養液，200 μL/孔，每個質量濃度設8個復孔；同時設置空白對照，每孔加入等體積的DEME完全培養液。繼續培養48 h，于結束前4 h，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，棄上清液，加入DMSO 200 μL/孔，振蕩10 min，使結晶完全溶解。采用酶標儀于490 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，計算細胞存活率，細胞存活率（%）＝加藥孔OD值/空白對照孔OD值×100%。

2.3 ELISA法檢測細胞分泌因子水平

取對數生長期細胞，用適量的0.25%胰酶消化，調整細胞密度為5×104mL－1，接種于24孔細胞培養板中，500 μL/孔。將細胞置于37℃、5%CO2孵箱中培養過夜，然后依次加入終質量濃度分別為0.5、1.0、5.0 μg/mL的紫鉚素含藥培養液，500 μL/孔，每個質量濃度設8個復孔；同時設置空白對照，每孔加入等體積的DEME完全培養液。繼續培養48 h后，將培養板每孔中的培養液分別移至EP管中，采用ELISA法檢測培養液上清液中細胞分泌因子ET-1、ET-3、MSH、SCF、bFGF的含量，具體操作嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 紫鉚素對HaCaT細胞增殖活性的影響結果

與空白對照比較，0.1 μg/mL紫鉚素對細胞增殖的影響不明顯；10.0 μg/mL紫鉚素對細胞增殖有抑制作用；0.5、1.0、5.0 μg/mL紫鉚素對細胞增殖有明顯的促進作用，可明顯升高細胞存活率，OD值明顯增加（P＜0.05），結果見表1。

表1 不同質量濃度紫鉚素對細胞存活率的影響Tab 1 Effect of different mass concentration butin on survival rate of cells

3.2 紫鉚素對HaCaT細胞ET-1、ET-3分泌的影響結果

與空白對照比較，0.5、1.0、5.0 μg/mL 的紫鉚素與細胞共孵育48 h后，培養液中ET-1含量顯著增加（P＜0.01）；1.0、5.0 μg/mL紫鉚素與細胞共孵育48 h后，細胞培養液中ET-3含量顯著增加（P＜0.01），結果見表2。

表2 不同質量濃度紫鉚素對細胞培養液中ET-1、ET-3含量的影響（±s，n＝8，pg/mL）Tab 2 Effects of different mass concentration butin on the contents of ET-1，ET-3 in cell culture medium（±s，n＝8，pg/mL）

表2 不同質量濃度紫鉚素對細胞培養液中ET-1、ET-3含量的影響（±s，n＝8，pg/mL）Tab 2 Effects of different mass concentration butin on the contents of ET-1，ET-3 in cell culture medium（±s，n＝8，pg/mL）

注：與空白對照比較，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control，＊＊P＜0.01

紫鉚素質量濃度，μg/mL 0（空白對照）0.5 1.0 5.0 ET-3 8.93±1.34 11.16±1.93 18.46±2.36＊＊28.16±1.01＊＊ET-1 67.62±19.03 104.09±15.80＊＊131.63±32.03＊＊217.72±29.21＊＊

3.3 紫鉚素對HaCaT細胞分泌SCF、bFGF、MSH的影響結果

與空白對照比較，紫鉚素作用48 h后細胞培養液中細胞分泌因子SCF、bFGF、MSH的含量均有所增加；其中0.5、1.0、5.0 μg/mL紫鉚素孔細胞培養液中 SCF、bFGF含量差異有統計學意義（P＜0.01），1.0、5.0 μg/mL 紫鉚素孔細胞培養液中MSH的含量差異有統計學意義（P＜0.01），結果見表3。

表3 不同質量濃度紫鉚素對細胞培養液中SCF、bFGF、MSH含量的影響（±s，n＝8，pg/mL）Tab 3 Effects of different mass concentration butin on the contents of SCF，bFGF，MSH in culture medium（±s，n＝8，pg/mL）

表3 不同質量濃度紫鉚素對細胞培養液中SCF、bFGF、MSH含量的影響（±s，n＝8，pg/mL）Tab 3 Effects of different mass concentration butin on the contents of SCF，bFGF，MSH in culture medium（±s，n＝8，pg/mL）

注：與空白對照比較，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control，＊＊P＜0.01

紫鉚素質量濃度，μg/mL 0（空白對照）0.5 1.0 5.0 MSH 690.47±65.35 693.44±60.49 959.74±66.98＊＊788.48±66.28＊＊SCF 50.30±8.64 70.56±11.26＊＊76.12±7.16＊＊107.16±11.42＊＊bFGF 88.47±14.35 141.90±19.31＊＊186.05±18.21＊＊126.28±18.93＊＊

4 討論

由于本研究是初步探討紫鉚素對人角質形成永生化細胞增殖的影響，從角質細胞可通過自分泌和旁分泌多種細胞分泌因子而影響黑素細胞的增殖及黑素合成的角度展開研究，目的是考察紫鉚素是否能夠通過促進角質細胞增殖及細胞分泌因子而激活黑素細胞，并不是進行藥物藥效的研究。故在本研究中沒有進行量效關系的考察，給藥濃度是按照倍數來設計，即以0.5 μg/mL為基數，給藥濃度分別是0.5 μg/mL的2、5、10倍。白癜風是一種常見的由黑素細胞被選擇性破壞而引起的皮膚色素脫失性疾病，受到內外因素的影響。黑素細胞在生長、分化、增殖、遷移、凋亡等過程中某一個或者幾個環節出現異常，將導致黑素形成和沉著異常，發生色素障礙性疾病。雖然白癜風病因尚不明確，但有組織病理學表明，白癜風皮損處缺乏黑素細胞[10]。

ET-1、ET-3是角質形成細胞分泌的重要細胞因子之一，在白癜風發病中起重要作用，皮膚內的ET-1、ET-3升高會促使黑素細胞的游離及分裂增殖，從而促使白斑區的恢復。MSH可促進黑素細胞增殖、產生黑素小體以及通過小眼畸形相關轉錄因子調節黑素細胞分化，引起皮膚色素沉著。SCF對小眼畸形相關轉錄因子MITF具有重要的調控作用，而黑素合成酶和黑素合成受黑素細胞特異性MITF基因的調控[11]。皮膚內的SCF上調會使SCF信號傳導途徑達到正常發揮作用的水平，使黑素細胞的生物學功能趨于正常，從而使白斑區復色[12]。bFGF作為一種具有多種生物效應的細胞生長因子，其可以促進黑素細胞的生長以及調整黑素的量，恢復皮損區的黑素細胞，使皮膚恢復正常的外觀和功能，從而達到治療白癜風的目的[13]。本研究結果顯示，紫鉚素能夠促進HaCaT細胞的增殖及細胞分泌因子ET-1、ET-3、MSH、SCF、bFGF的分泌。

綜上所述，紫鉚素抗白癜風的作用機制可能與其促進HaCaT細胞增殖以及細胞分泌因子ET-1、ET-3、SCF、bFGF、MSH的分泌，從而促進黑素細胞色素合成有關，但其更多的作用機制有待進一步研究。

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Effects of Butin in Vernohia anthelmintica on Proliferation of Human Immortal Keratinocyte Cell Strain HaCaT and Cell Secretory Factors

WANG Zhijie1，GAO Li2，HUO Shixia2，TAN Xue2，LUO Jingying2，YAN Ming2（1.College of Pharmacy，Shihezi University，Xinjiang Shihezi 832003，China；2.Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine/Xinjiang Laboratory of Uighur Medical Prescription，Urmuqi 830049，China）

OBJECTIVE：To study the effects of butin in Vernohia anthelmintica（VW）on proliferation of human immortal keratinocyte cell strain HaCaT and cell secretory factors，and explore the mechanism of butin in VW in the treatment of vitiligo.METHODS：MTT method was used to determine the survival rate of HaCaT cells cultured by 0（blank control），0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg/mL of butin for 48 h.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the contents of cell secretory factors as endothelin 1（ET-1），ET-3，melanocyte stimulating hormone（MSH），stem cell factor（SCF），basic fibroblast growth factor（bFGF）in culture medium after HaCaT cells were cultured by 0.5，1.0，5.0 μg/mL of butin for 48 h.RESULTS：Compared with blank control，cell survival rate was increased to varying degrees after cultured by 0.1-5.0 μg/mL of butin for 48 h，while decreased after cultured by 10.0 μg/mL of butin.Contents of ET-1，SCF，bFGF in culture medium were significantly increased after cultured by 0.5，1.0，5.0 μg/mL of butin for 48 h（P＜0.01）；and contents of ET-3，MSH in culture medium were significantly increased after cultured by 1.0，5.0 μg/mL of butin for 48 h（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Butin can promote the proliferation of HaCaT cells，the mechanism may be associated with promoting the secretion of cell secretory factors of ET-1，ET-3，MSH，SCF，bFGF.

Vernohia anthelmintica；Butin；Human immortal keratinocyte cell strain HaCaT；Proliferation；Cell factors

R751.05

A

1001-0408（2017）28-3904-03

2017-03-17

2017-07-19）
（編輯：林 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.81260689）

＊碩士研究生。研究方向：藥物分析、新藥研發。E-mail：1542658051@qq.com

#通信作者：研究員，碩士。研究方向：藥物分析、新藥研發。E-mail：yanming21cn@sohu.cn.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.05