抗炎化合物HB0314在大鼠體內的藥動學及絕對生物利用度研究Δ

唐俏欣，許俊鵬，潘超，湯明海，萬麗（1.成都中醫藥大學藥學院，成都611137；.四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室，成都 610041）

抗炎化合物HB0314在大鼠體內的藥動學及絕對生物利用度研究Δ

唐俏欣1，2＊，許俊鵬1，2，潘超1，2，湯明海2，萬麗1#（1.成都中醫藥大學藥學院，成都611137；2.四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室，成都 610041）

目的：建立大鼠血漿樣品中抗炎化合物HB0314的檢測方法，并研究其在大鼠體內的藥動學特征。方法：采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS），色譜柱為Waters Acquity UPLCTMBEH C18柱，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～2 min，70%～90%B），流速為0.25 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為5 μL；采用電噴霧離子源，毛細管電壓為3 kV，離子源溫度為150℃，脫溶劑氣溫度為450℃，脫溶劑氣流量為600 L/h，錐孔氣流量為45 L/h，內標為延胡索乙素。將12只大鼠隨機分成iv組和ig組，每組6只，分別iv、ig HB0314 溶液5、10 mg/kg，分別于給藥前及給藥后5、15、30、60、120、240、360、480、600、720、1 440 min取頸靜脈血0.4 mL測定HB0314血藥濃度，采用DAS 2.0軟件計算藥動學參數并計算絕對生物利用度。結果：HB0314質量濃度在1～1 000 ng/mL內線性關系良好（r＝0.995 5），定量下限為1 ng/mL；日內、日間精密度、穩定性的RSD≤8.45%（n＝5）；回收率為68.21%～90.29%（RSD≤11.20%，n＝5）；基質效應為82.63%～106.90%（RSD≤6.75%，n＝5）。iv與ig給藥后，HB0314在大鼠體內的AUC0-24h分別為（270.267±21.164）、（252.755±26.169）μg·h/L（n＝6），t1/2z分別為（8.722±2.266）、（11.877±4.517）h（n＝6），絕對生物利用度為56.97%。結論：本方法快速、簡便，可用于大鼠血漿中HB0314含量的測定。HB0314在大鼠體內具有較高的絕對生物利用度，提示后期劑型設計可考慮將其制成口服劑。

HB0314；超高效液相色譜-串聯質譜法；大鼠；藥動學；絕對生物利用度

類風濕性關節炎（RA）是以慢性侵蝕性關節炎為主要特征的一種系統性自身免疫病，在世界各地均有發病，具有明顯家族遺傳特點[1-2]。RA早期表現為關節滑膜的慢性炎癥，隨后滑膜增生破壞關節軟骨和關節囊，最終出現關節強直和畸形，導致功能性殘疾[3-4]。除此之外，RA還可能對眼、皮膚、肝、腎、肺、心血管系統等造成破壞[5]。

目前治療RA的藥物主要有非甾體類抗炎藥、用于改善病情的抗類風濕藥、糖皮質激素、生物制劑等[6]。HB0314是基于類風濕性關節炎藥物CP-690550開發的化合物，該化合物以細胞內信號轉導通路的蛋白激酶為作用靶點，能夠有效地選擇性抑制兩面神激酶3（JAK3）的活性，從而阻斷多種炎癥細胞因子的信號轉導，有效控制風濕性關節炎病程，因此認為該化合物具有進一步開發的可能性。HB0314的化學結構式見圖1[7-9]。

圖1 HB0314的化學結構式Fig 1 Chemical structure of HB0314

良好的藥物在具備較好功效的同時還應做到毒副作用小、具有良好的藥動學特征（如溶解度適中、蛋白結合率中度、代謝穩定性好、吸收與生物利用度好、生成代謝產物無毒或毒性較低等）[10-11]。目前血漿樣品處理方法主要有液-液萃取法、固相萃取法、蛋白沉淀法等[12-15]。本文采用甲醇沉淀蛋白后超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）測定大鼠血漿中HB0314的濃度，獲得藥物在大鼠體內的藥動學參數，為HB0314給藥途徑、新藥設計和結構改造提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

UPLC系統和Xevo TQD三重四級桿質譜儀（美國Waters公司）；AL204電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Heraeus Fresco 17離心機（美國Thermo Scientific公司）；S0200-230V渦旋混合儀（上海迪奧生物科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

HB0314（由四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室合成，批號：20150621，經紫外、氫譜、碳譜、高分辨質譜鑒定，純度：＞98%）；延胡索乙素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-201515，純度：＞99.5%）；甲醇和乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠12只，♂，體質量（200±20）g，由北京華阜康生物技術股份有限責任公司提供[實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2014-0004]。實驗前適應性喂養3 d，自由飲水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～2 min，70%～90%B）；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓：3 kV，離子源溫度：150℃，脫溶劑氣溫度：450℃，脫溶劑氣流量：600 L/h，錐孔氣流量：45 L/h。正離子多反應監測（MRM）模式監測HB0314和延胡索乙素（內標），監測離子對和碰撞能量分別為HB0314[質荷比（m/z）287.16→138.14]25 eV，內標（m/z 356.10→192.00）30 eV，駐留時間：0.20 s，錐孔電壓：40 V。

2.3 貯備液的制備

2.3.1 HB0314貯備液的制備 精密稱取HB0314 10.01 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解，定容，制成1.001 mg/mL的HB0314貯備液。

2.3.2 內標貯備液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品10.01 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解，定容，制成100.1 μg/mL的內標貯備液。

2.4 標準血漿樣品的制備

用甲醇將HB0314貯備液稀釋成10、50、100、200、500、1 000、5 000、10 000 ng/mL的系列標準溶液。另用甲醇將內標貯備液稀釋成50 ng/mL的內標溶液。取45 μL空白血漿，置于1.5 mL EP管中，分別加入5 μL系列標準溶液，制成HB0314質量濃度分別為1、5、10、20、50、100、500、1 000 ng/mL的標準血漿。

2.5 質控樣品的制備

按“2.4”項下方法制備低、中、高質量濃度的質控樣品（3、100、800 ng/mL）。

2.6 血漿樣品的處理

取血漿樣品50 μL，置于1.5 mL EP管中，加入50 ng/mL內標溶液5 μL，渦旋混勻，加250 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻2 min，13 000 r/min離心（離心半徑為8.6 cm）10 min，取上清液，進樣測定。

2.7 分組、給藥及取樣

將12只SD大鼠隨機分成iv組和ig組，每組6只。實驗前12 h行頸靜脈插管術，兩組大鼠分別iv、ig給藥，給藥劑量分別為5、10 mg/kg（給藥劑量為前期藥效學實驗有效劑量）。分別于給藥前及給藥后5、15、30、60、120、240、360、480、600、720、1 440 min取頸靜脈血0.4 mL，加入肝素化離心管中，3 500 r/min離心（離心半徑為8.6 cm）15 min，收集上清血漿，－20℃凍存，備用。

2.8 方法學考察

2.8.1 專屬性考察 取大鼠空白血漿、含HB0314標準血漿及iv給藥后15 min的血漿樣品各50 μL，按“2.6”項下方法處理后進樣測定。結果，HB0314和內標具有較好的分離度，保留時間分別為0.92、1.00 min，且血漿中內源性物質不干擾HB0314和內標測定。色譜圖見圖2。2.8.2 線性關系考察 取“2.4”項下標準血漿樣品，按“2.6”項下方法處理后進樣分析，以HB0314質量濃度為橫坐標（x）、HB0314與內標峰面積比值為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程y＝0.000 635 428x+0.000 650 97（r＝0.995 5）。結果表明，HB0314含藥標準血漿在質量濃度為1～1 000 ng/mL范圍內線性關系良好，定量下限為1 ng/mL（RSD＝7.78%，n＝5）。

圖2 MRM色譜圖Fig 2 MRM chromatograms

2.8.3 基質效應考察 取空白血漿45 μL于1.5 mL EP管中，加入250 μL甲醇，渦旋混勻沉淀蛋白，分別加入HB0314低、中、高質量濃度（終質量濃度分別為3、100、800 ng/mL）的HB0314溶液各5 μL，均平行5份。再加入50 ng/mL的內標溶液5 μL，渦旋混勻，13 000 r/min離心（離心半徑為8.6 cm）15 min，取上清液，進樣測定。計算得HB0314低、中、高質量濃度質控樣品的基質效應分別為（98.34±3.20）%、（100.14±6.76）%、（86.64±4.01）%，RSD分別為3.26%、6.75%、4.62%（n＝5）。

2.8.4 準確度考察 取“2.5”項下低、中、高質量濃度質控樣品各5份，按“2.6”項下方法處理后進樣分析，以測得值與理論值的比值計算方法回收率。結果，低、中、高質量濃度質控樣品的方法回收率分別為（82.37±6.92）%、（79.61±9.32）%、（76.71±8.50）%，RSD 分別為7.01%、9.86%、11.20%（n＝5）。這表明本方法回收率良好。

2.8.5 精密度考察 按“2.5”項下方法制備低、中、高質量濃度質控樣品各5份，按“2.6”項下方法處理后進樣分析，連續測定3 d。以當日標準工作曲線計算各樣品濃度，計算方法的日內、日間精密度。結果，低、中、高質量濃度質控樣品日內RSD分別為4.94%、6.98%、7.65%（n＝5），日間RSD分別為8.45%、5.45%、4.20%（n＝5）。該結果表明，各質量濃度質控樣品的精密度良好，符合生物樣本的測定要求。

2.8.6 穩定性考察 按“2.5”項下的方法制備低、中、高質量濃度質控樣品，均平行5份，分別考察室溫下放置6 h、4℃放置24 h、反復凍融3次的樣品穩定性。結果，低、中、高質量濃度質控樣品質量濃度測得值范圍在91.48%～114.72%之間，RSD分別為7.94%、3.66%、5.88%（n＝5）。這表明HB0314在樣品貯存及測定過程中均保持穩定。

2.9 藥動學考察

兩組大鼠體內HB0314藥-時曲線見圖3。采用DAS 2.0軟件求算藥動學參數，結果見表1。

圖3 兩組大鼠體內HB0314的藥-時曲線圖Fig 3 Concentration-time curves of HB0314 in rats in two groups

表1 兩組大鼠體內HB0314的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetics parameters of HB0314 in rats in two groups（±s，n＝6）

表1 兩組大鼠體內HB0314的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetics parameters of HB0314 in rats in two groups（±s，n＝6）

藥動學參數AUC0-24h，μg·h/L AUC0-∞，μg·h/L MRT0-24h，h t1/2z，h tmax，h CL/F，L/（h·kg）V/F，L/kg cmax，μg/L iv組270.267±21.164 273.902±23.699 2.404±0.502 8.722±2.266 18.346±1.575 208.032±46.930 ig組252.755±26.169 260.827±19.857 2.134±0.436 11.877±4.517 0.250±0.000 38.486±2.891 561.830±151.729 303.200±37.100

根據以下公式計算HB0314在大鼠體內的絕對生物利用度（F）＝（AUC0-24hig×Div）/（AUC0-24hiv×Dig）×100%（D為給藥劑量）。經計算得到HB0314在大鼠體內的F為56.97%。

3 討論

液質聯用技術能幫助實現對復雜生物樣品中化合物的快速識別，尤其是MRM模式根據待測物的離子對進行選擇性檢測，具有很強的特異性。因此本文采用UPLC-MS/MS建立了血漿中抗炎化合物HB0314的檢測方法，并考察該化合物在大鼠體內的藥動學特征。在該色譜條件下，能實現待測物與大鼠血漿中內源性物質的分離，同時能在較短時間內出峰，HB0314和內標的保留時間分別為0.92、1.00 min。在色譜分離過程中，流動相中加入適量甲酸，有助于改善峰形，提高檢測靈敏度，因此本研究流動相A相采用0.1%甲酸水溶液。采用蛋白沉淀法進行樣品前處理，操作簡便，能節約大量時間成本，適合大批量樣品的前處理。本研究采用甲醇沉淀蛋白，其回收率良好，能最大程度除去血漿中的大分子物質，從而保護色譜柱，延長柱使用壽命。

本研究結果顯示，大鼠ig給藥后，血藥濃度在0.25 h達到最大值，表明HB0314能在大鼠體內得到迅速分布。大鼠iv、ig給藥后，t1/2z分別為（8.722±2.266）、（11.877±4.517）h，CL/F 分別為（18.346±1.575）、（38.486±2.891）L/（h·kg），表明HB0314能夠在大鼠全身得到廣泛的分布，且代謝和排泄速度較慢，能在體內維持較長的作用時間；AUC0-24h分別為（270.267±21.164）、（252.755±26.169）μg·h/L，F為56.97%，說明ig給藥后大鼠對HB0314的吸收效果較理想。這提示在后期經過制劑設計研究，可以考慮將該藥物制成口服劑。

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Study on the Pharmacokinetics and Absolute Bioavailability of Anti-inflammatory Compound HB0314 in Rats in vivo

TANG Qiaoxin1，2，XU Junpeng1，2，PAN Chao1，2，TANG Minghai2，WAN Li1（1.School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China；2.State Key Laboratory of Biotherapy，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To establish the detection method for anti-inflammatory compound HB0314 in plasma of rats，and study on its pharmacokinetic characteristics in rats in vivo.METHODS：UPLC-MS/MS was performed on the column of Waters Acquity UPLCTMBEH C18with mobile phase of 0.1%formic acid aqueous solution（A）-methanol（B）by gradient elution（0-2 min，70%-90%B）at flow rate of 0.25 mL/min，column temperature was 30 ℃，and injection volume was 5 μL.Electrospray ion source was used，capillary voltage was 3 kV，ion source temperature was 150℃，desolvation gas temperature was 450℃，desolvent air flow volume was 600 L/h，cone air flow volume was 45 L/h，and the inner standard was tetrahydropalmatine.12 rats were randomly divided into iv group and ig group，6 in each group.Rats were intravenously injected and intragastrically administrated HB0314 solution 5，10 mg/kg.Sample blood 0.4 mL were taken from the jugular vein blood before administration and after 5，15，30，60，120，240，360，480，600，720，1 440 min of administration to determine the HB0314 plasma concentration.DAS 2.0 software was used to calculate the pharmacokinetic parameters and absolute bioavailability.RESULTS：The linear range of HB0314 was 1-1 000 ng/mL（r＝0.995 5），and the lower limit of quantification was 1 ng/mL.RSDs of extra-day and daytime precision，stability were not higher than 8.45%（n＝5）；recovery were 68.21%-90.29%（RSD≤11.20%，n＝5），and matrix effects were 82.63%-106.90%（RSD≤6.75%，n＝5）.After intravenous injection and intragastric administration，AUC0-24hwere（270.267±21.164），（252.755±26.169）μg·h/L（n＝6）；t1/2zwere（8.722±2.266），（11.877±4.517）h（n＝6）；and absolute bioavailability was 56.79%.CONCLUSIONS：The method is rapid，simple，and can be used for the determination of HB0314 content in plasma of rats.HB0314 shows high oral absolute bioavailability in rats in vivo，indicating that post-dosage form design may be considered as oral anti-inflammatory drugs.

HB0314；UPLC-MS/MS；Rats；Pharmacokinetics；Absolute bioavailability

R969.1

A

1001-0408（2017）28-3915-04

2017-01-20

2017-07-30）

（編輯：劉明偉）

國家自然科學基金資助項目（No.81374017）

＊碩士研究生。研究方向：藥物代謝。E-mail：tangqiaoxin07@163.com

#通信作者：教授。研究方向：藥物分析。E-mail：wanli8801@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.08