縮膽囊素神經肽分子印跡膜的制備及熒光免疫分析應用

彭麗芳， 李 樺

(武漢大學化學與分子科學學院，湖北武漢 430072)

縮膽囊素(Cholecystokinin，CCK)是一類分布廣泛且具有多種生理功能的多型性神經肽，通常以四肽CCK4、五肽CCK5和八肽CCK8形式存在于腦脊液中[1]。CCK神經肽對記憶、學習和睡眠等生理功能具有調控作用，與抑郁等精神類疾病也緊密相關[2 - 3]。目前報道的腦脊液及血液中CCK神經肽的定量分析主要基于放射性免疫法[4 - 5]，該方法靈敏度高，但需使用昂貴的抗體，且有交叉反應的缺點。因此，研究建立高效、經濟、特異性強的CCK神經肽定量分析方法，對于闡明其含量與腦疾病之間的關系具有重要的理論價值和臨床意義。

常規生物傳感器以酶、抗體等生物分子為識別元件，由于蛋白質類抗體價格昂貴且熱穩定性差，限制了這類生物傳感器的廣泛應用[6 - 7]。分子印跡技術是以目標分子為模板合成具有特異性識別能力的分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，MIP)，MIP不僅具有抗體的特異性識別能力，而且具有耐高溫、抗酸堿及有機溶劑、制備成本低和可重復利用的優點。MIP技術已經逐步應用于傳感[8 - 9]、免疫分析[10 - 11]和色譜分離[12]等領域。與小分子MIP相比，蛋白質MIP的合成制備更具挑戰性，主要是因為蛋白質分子量大且聚合過程中構象多變?？乖瓫Q定簇法是以多肽或蛋白質中一個特異性的裸露短肽為模板分子，制備所得的MIP可用來特異性識別整個多肽或蛋白質，該技術已用于合成多種蛋白質MIP[13 - 14]。

本課題組曾用抗原決定簇法合成制備CCK-MIP整體柱，將其用于固相微萃取-液質聯用(LC-MS)測定人腦脊液中CCK神經肽[15]。本研究用抗原決定簇法，在硅烷化的玻片表面制備能特異性識別CCK神經肽的MIP膜。結合MIP的高選擇性與熒光法的高靈敏度，研究建立了基于此MIP膜的固相競爭-熒光免疫分析方法，并對人腦脊液中CCK神經肽進行定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

1100型液相色譜儀(美國，Agilent公司)；5700型紅外(IR)光譜分析儀(美國，Nicolet公司)；Zeiss掃描電子顯微鏡(SEM)(德國，Sigma公司)；DSY5000X型熒光倒置顯微鏡(重慶澳浦光電技術有限公司)，配置MC21型CCD探測器(廣州明美光電技術有限公司)。

CCK4、CCK5、CCK8、四肽YPLG、甲啡肽(Met-enk)、亮啡肽(Leu-enk)以及FITC標記的CCK5(FITC-CCK5)，均購于上海吉爾生化有限公司(純度>98%)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)，均購于Aladdin公司(純度>96%)；偶氮二異丁腈(AIBN)、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)，均購于國藥集團化學試劑有限公司(分析純)。

1.2 實驗步驟

1.2.1玻片的預處理玻片用雙官能團試劑γ-MAPS預處理使其表面硅烷化。依次在0.1 mol/L的NaOH溶液和HCl中煮沸1 h后置于γ-MAPS-甲醇(1∶9，V/V)溶液中浸泡12 h，甲醇沖洗，N2吹干即可。

1.2.2縮膽囊素-分子印跡膜(CCK-MIP)的制備在400 μL甲醇中依次加入3 mg模板分子CCK4，3 μL 功能單體MAA，40 μL交聯劑EDMA，0.025 g引發劑AIBN，超聲溶解，充入N25 min。將預聚合液轉移至硅烷化的玻片表面，蓋上普通載玻片，置于培養皿中并用保鮮膜密封，溫度60 ℃熱引發聚合8 h。聚合后的MIP膜置于乙腈-水(3∶7，V/V)溶液振蕩洗脫(洗脫液含0.1%TFA)，直至洗脫液用HPLC-UV法檢測不到模板分子的信號為止。非印跡聚合物(NIP)的制備除不加模板分子外，其他均相同。

1.2.3CCK-MIP膜吸附平衡實驗通過吸附平衡實驗評價MIP膜的吸附容量及選擇性。分別用5 mL濃度為5、10、15、35、50、100、175、350 μmol/L的CCK4 標準溶液與MIP膜溫育3 h，以HPLC法測定吸附平衡后溶液中CCK4的濃度，并按公式計算吸附容量(Qe)：Qe=V(c0-ce)/m。式中c0和ce(μmol/L)分別代表吸附前后CCK4的濃度，V為CCK4 溶液體積(L)，m為MIP膜質量(g)。

MIP膜的特異性以印跡因子(IF)來考察，IF定義為：IF=QMIP/QNIP。其中QMIP和QNIP分別代表印跡膜和非印跡膜的吸附容量。

MIP膜的選擇性考察：多肽混合溶液(CCK4、CCK5、CCK8、YPLG、Met-enk和Leu-enk，濃度均為5.5 μmol/L)與MIP膜溫育3 h，以HPLC法測定吸附平衡后溶液中各多肽濃度，計算IF。

1.2.4人腦脊液的樣品處理人腦脊液樣品取自于武漢同濟醫院的病人，并于-80 ℃儲存。使用前將氯仿與腦脊液(4∶1，V/V)混勻，4 ℃下于4 000g離心10 min以除去蛋白質，取上清液備用。

1.2.5MIP膜-競爭性熒光免疫分析方法測定CCK神經肽含量配置一系列標準CCK5與FITC-CCK5的混合溶液，其中FITC-CCK5濃度固定為210 pmol/L,CCK5濃度分別為0、20、60、120、200、400 pmol/L。將混合溶液與MIP膜溫育進行競爭性熒光免疫反應，3 h后取出MIP膜，用pH=8.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液沖洗2 min；用熒光倒置顯微鏡-CCD圖像分析系統隨機對MIP膜上10個區域進行拍照，得到10張熒光圖(FM)，每張熒光圖隨機選取15個相同面積的圓，以圖像分析軟件 image-pro-plus 分析這些圓(共150個)的熒光強度，獲取平均值(FI)。以歸一化熒光強度(B/B0%)為縱坐標，繪制B/B0% 隨CCK5濃度變化的曲線，得到擬合方程。其中B為競爭性免疫反應中不同濃度的標準CCK5溶液所對應的FM的FI值，B0為CCK5標準品濃度為0時所對應的熒光圖的FI值。將待分析樣品進行MIP膜熒光免疫反應，將得到熒光圖的FI值代入擬合的線性回歸方程式，計算人腦脊液樣品中CCK神經肽的含量。競爭免疫分析方法的檢出限(LOD)為標準品CCK5濃度為0時，對應的FI值減去其標準偏差(n=3)的三倍所得值代入線性回歸方程求得的CCK濃度[16]。

2 結果與討論

2.1 MIP膜的制備機理及固相競爭-熒光免疫分析方法的設計

CCK系列神經肽具有相同C端(Trp-Met-Asp-Phe-NH2)，用抗原決定簇法以CCK4為模板所制備的MIP對CCK神經肽均能特異性識別。圖1為CCK-MIP膜的制備及固相競爭-熒光免疫分析方法設計示意圖，以抗原決定簇法在硅烷化的玻片表面原位合成MIP膜，洗脫移除模板CCK4后，MIP膜形成能特異性吸附CCK神經肽的識別位點。以此MIP膜為固相吸附基質，游離的CCK與熒光標記的CCK5(FITC-CCK5)競爭性吸附到MIP膜的識別位點，建立固相競爭-熒光免疫分析方法，利用熒光倒置顯微鏡-CCD圖像分析系統對吸附到MIP膜上CCK神經肽進行定量分析。

圖1 CCK-MIP膜的制備及固相競爭-熒光免疫分析應用Fig.1 Schematic illustration of CCK-MIP membrane preparation and its application for competitive immunoassay

2.2 MIP膜聚合條件的選擇優化

為制備出對CCK神經肽具有特異性識別能力且形貌良好的MIP膜，本實驗對單體的種類及用量、交聯劑用量等聚合條件進行了系統的選擇及優化。研究表明，該體系最佳功能單體為MAA，模板與單體最佳比例為1∶4。聚合過程中，通過交聯劑與硅烷化試劑的作用，MIP膜鍵合到玻片表面，因此交聯劑的用量是本實驗考察的重點。研究表明當單體與交聯劑比例為1∶6時，所制備的MIP膜特異性吸附能力強、形貌規整且耐沖洗。

2.3 MIP膜的表征

圖2 為MIP的掃描電鏡(SEM)圖及MIP、NIP和MAA的紅外(IR)光譜圖。由圖2A可見所制備的MIP膜為結構致密、孔徑均勻的交聯狀聚合物，這為傳質提供了良好的場所。從圖2B可以看出，MIP和NIP 特征吸收峰的位置和強度相似，1 729.08 cm-1處為交聯劑EDMA中C=O伸縮振動吸收峰；與MAA相比，MIP和NIP在1 633 cm-1處的C=C鍵伸縮振動和3 100～3 000 cm-1處 C-H 伸縮振動明顯減弱，由此表明，MAA參與了聚合過程。綜上分析說明，本實驗已經成功制備了MIP膜。

圖2 (A)MIP膜掃描電鏡(SEM)圖；(B) NIP、MIP 和MAA的紅外(IR)光譜圖Fig.2 (A) SEM image of MIP membrane;(B)IR spectra of NIP,MIP and MAA

圖3 MIP/NIP膜對CCK4的吸附等溫線Fig.3 Adsorption isotherm of CCK4 on MIP/NIP membrane

2.4 MIP膜吸附容量及選擇性考察

按實驗步驟1.2.3進行吸附平衡實驗，圖3是MIP/NIP膜對CCK4的吸附等溫線，MIP膜對CCK4的吸附容量為31.7 μmol/g，而NIP膜僅2.61 μmol/g，印跡因子達到12，說明MIP膜對CCK4具有高的特異性識別能力。

表1是MIP/NIP膜對6種小肽的吸附容量和印跡因子。表1表明：MIP膜對CCK4、CCK5和CCK8的印跡因子分別為5.6、4.5 和4.3，而對另三種非CCK類的小肽的印跡因子均接近1，說明該MIP膜能選擇性識別CCK神經肽。

表1 MIP/NIP膜的吸附容量(Q)和印跡因子(IF)

2.5 基于MIP膜的競爭-熒光免疫分析法測定人腦脊液中CCK神經肽

按實驗步驟1.2.5進行MIP膜的競爭-熒光免疫實驗，圖4A為競爭吸附后MIP膜熒光圖及平均熒光強度圖，圖4B為由圖4A數據繪制的競爭結合校準曲線(1)及半對數曲線(2)。圖4B(1)中B/B0%與CCK5濃度在0～200 pmol/L范圍內存在明顯線性關系，繪制該范圍內半對數曲線如圖4B(2)所示，表2為該競爭性免疫分析方法的線性回歸方程式，線性范圍，相關系數和CCK5檢出限。我們所建立的固相競爭-熒光免疫分析方法對CCK神經肽檢出限達到8.91 pmol/L，與文獻所報道的RIA方法檢出限相近[5]。

圖4 (A)競爭吸附后MIP膜熒光圖及其平均熒光強度(FI：所分析的150個圓的熒光強度平均值)；(B) MIP膜競爭結合校準曲線及半對數曲線Fig.4 (A)Quantitative representation of the fluorescence intensities for the fluorescent micrograph(FI:The mean fluorescence intensity of 150 wafers);(B)Competitive binding calibration curve(1) and semi-logarithmic linegraph(2) for the MIP membrane

AnalyteLinear range(pmol/L)Regression equationR2LOD(pmol/L)CCK50-200lgY=1.9898-0.0023X0.99198.91

Y:B/B0(%);X:CCK5 concentration(pmol/L).

按實驗步驟1.2.5對預處理后的人腦脊液樣品進行MIP膜競爭熒光免疫實驗，表3為所測的CCK神經肽含量，結果表明：人腦脊液樣品中CCK神經肽的含量與文獻報道接近[17]。

2.6 MIP膜競爭性免疫分析方法評價

為考察該分析方法的重現性，對加標腦脊液進行3次平行分析。表4是MIP膜競爭性免疫分析方法日間加標回收率及精密度，從表中可以看出CCK5的平均加標回收率在96.4%～113%之間，加標回收率的RSD為2.2%～4.6%。將此MIP膜反復用于競爭吸附-解吸15次左右，吸附性能略微降低，說明該方法的重現性好且該印跡膜具有優異的穩定性，適用于腦脊液樣品中CCK神經肽的高靈敏和高選擇性分析。

表3 腦脊液樣品中CCK神經肽含量

表4 競爭性免疫分析方法日間加標回收率及精密度(n=3)

3 結論

本研究用抗原決定簇法，在硅烷化的玻片表面合成制備了對CCK神經肽具有特異性識別能力的MIP膜。結合MIP的高選擇性與熒光的高靈敏度，以此MIP膜為固相吸附基質，我們研究建立了基于此MIP膜固相競爭-熒光免疫分析方法，該方法可對人腦脊液中CCK神經肽進行定量分析。實驗結果表明所制備的分子印跡膜具有特異性強和可重復利用的優點，在縮膽囊素神經肽分析中具有良好的應用價值。