貝類包納米蟲病焦磷酸測序檢測方法的建立與應用*

王彩霞， 吳紹強**， 林祥梅， 王素華， 馮春燕， 徐 賡

(1.中國檢驗檢疫科學研究院 動物檢疫研究所，北京 100029； 2.浙江省溫州出入境檢驗檢疫局，浙江 溫州 325027；3.山東省沂南縣畜牧獸醫局， 山東 沂南276300)

貝類包納米蟲病焦磷酸測序檢測方法的建立與應用*

王彩霞1， 吳紹強1**， 林祥梅1， 王素華2， 馮春燕1， 徐 賡3

(1.中國檢驗檢疫科學研究院 動物檢疫研究所，北京 100029； 2.浙江省溫州出入境檢驗檢疫局，浙江 溫州 325027；3.山東省沂南縣畜牧獸醫局， 山東 沂南276300)

以焦磷酸測序技術為檢測平臺，在研究包納米蟲基因特性的基礎上，選擇包納米蟲(Bonamiaspp.)DNA序列的保守區域，利用焦磷酸測序軟件設計專用引物。以OIE推薦的PCR方法構建的陽性質粒作為模板，建立了包納米蟲的PCR-焦磷酸測序檢測方法，確定測得序列為包納米蟲序列，經酶切位點分析可鑒別感染種類。以建立的包納米蟲PCR-焦磷酸測序方法對進口牡蠣(Ostrea gigas thunberg)樣品進行檢測，同時以OIE推薦的PCR-RFLP方法進行對照檢測，檢測結果表明，本研究建立的PCR-焦磷酸測序檢測方法可以在基因序列水平上準確鑒定樣品是否為包納米蟲感染以及感染種類，檢測結果與OIE推薦方法的檢測結果一致。研究結果表明，本研究建立的檢測方法可應用于口岸包納米蟲感染情況的檢測鑒定。

牡蠣；包納米蟲；聚合酶鏈式反應；焦磷酸測序；檢測；鑒定

牡蠣包納米蟲病是由牡蠣包納米蟲(Bonamiaostreae)、殺蠣包納米蟲(B.exitiosa)等在牡蠣(Oyster)血細胞內寄生或者游離在結締組織、鰓、內臟或套膜上皮中而引起貝類的一種嚴重的寄生蟲病?，F發現的包納米蟲包括5個種，除主要寄生在歐洲牡蠣體內的牡蠣包納米蟲(B.ostreae)、殺蠣包納米蟲(B.exitiosa)[1]外，還有寄生在悉尼牡蠣體內的魯道夫包納米蟲(B.roughleyi)[2]、美國牡蠣體內的成孢包納米蟲(B.perspora)[3]和澳大利亞牡蠣體內的包納米蟲未定種(Bonamiasp.)[4]。目前，除牡蠣包納米蟲、殺蠣包納米蟲為世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties，OIE)規定的檢疫性疫病外，其它3種均為非檢疫性寄生蟲[5]。1980年，Pichot等[6]指出，牡蠣包納米蟲是造成歐洲牡蠣大量死亡的重要原因之一，此后，人們對牡蠣包納米蟲進一步研究，發現牡蠣包納米蟲是一種軟體動物血液原蟲。1987年愛爾蘭科克港(Cork)發生牡蠣包納米蟲病，死亡率達90%；1989年，愛爾蘭戈爾韋海峽(Galway)的牡蠣感染牡蠣包納米蟲，死亡率達70%～80%[7]。1995年，牡蠣包納米蟲與折光馬爾太蟲(Marteiliarefringens)同時爆發，使法國貝類產品從1970年的20 000 t下降至1 800 t[8]。阿根廷圣安東尼奧(San Andonio)海灣自1995年初次報道以來，1996年導致33%的牡蠣死亡，1997年的牡蠣累計死亡率高達95%，使得牡蠣養殖業遭到重創[9]，近十幾年來，牡蠣包納米蟲病的流行趨于緩和，雖未出現重大的流行，但在美國、英國、愛爾蘭、加拿大等地時有發生，流行率從百分之零點幾到百分之三、四十不等。2004年英國大不列顛牡蠣養殖場牡蠣大量死亡[10]，經證實，導致此次牡蠣大量死亡的原因正是牡蠣包納米蟲，牡蠣包納米蟲病已成為對歐洲和美國牡蠣養殖業影響重大的主要疾病之一。2008年3月13日，英國向OIE報告，本國自2007年11月以來，在北肯特(North Kent)海灣發生包納米蟲感染，受感染貝類數量達500萬，其中發病10萬[11]。2009年，挪威的東阿格德爾郡(AUST-AGDER)在野生牡蠣中發生包納米蟲病，這是挪威首次發生包納米蟲病，感染來源尚不清楚。2016年澳大利亞首次發生殺蠣包納米蟲病，這是OIE關于該病最近一次的疫情報道。

包納米蟲能直接在牡蠣間通過呼吸、食物而傳播，但其生活史尚不清晰，是否存在中間宿主或攜帶者尚未研究清楚。包納米蟲的檢測方法主要包括一些形態學、免疫學及分子生物學檢測方法。形態學檢測方法能直接觀察到蟲體，操作相對比較簡單，檢測費用低，但檢出率較低，主要有蟲體濃縮法、病理切片技術、組織印記法、組織細胞學等；而分子生物學方法敏感性、特異性較高，能檢測到牡蠣包納米蟲感染的潛伏期，目前主要有原位雜交法、PCR技術、實時熒光定量PCR技術[12]以及鑒別物種類別的PCR-限制性片段長度多態性分析方法(PCR-RFLP)技術。但是PCR技術以及實時熒光PCR無法獲得基因的序列信息，不能從基因序列水平進行鑒定，且容易造成假陽性、假陰性結果的出現，DNA測序技術雖然能解決基因序列水平上的檢測問題，但是存在取樣、送樣、結果反饋等手續繁瑣以及檢測速度慢、成本高的缺點，不利于大規模樣本的快速檢測。相關報道指出，在實際工作中，如果引物對選擇得好，很短的一段保守/特異序列的測定就可滿足對病原分子診斷的需要[13]。焦磷酸測序技術是1987年發展起來的一種能夠進行定量序列測定的新型DNA測序技術[14]，具有高通量、快速、敏感等特點，該技術利于大批量樣本的檢測[15]。因此，本研究擬利用焦磷酸測序技術建立包納米蟲基因序列水平上的檢測方法，并應用于進口牡蠣樣品的包納米蟲檢測鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品 2016年3月，溫州出入境檢驗檢疫局從荷蘭和法國進口的牡蠣樣品。

陽性對照 牡蠣包納米蟲(BonamiaOstreae)DNA由法國軟體動物疾病參考實驗室的Isabelle Arzul教授惠贈。

陰性對照 實驗室保存的采自中國東部沿海的牡蠣，已經OIE方法[16]檢測確認無包納米蟲感染。

1.2 方法

1.2.1 包納米蟲焦磷酸測序方法的建立

1.2.1.1 陽性克隆質粒的構建 以法國軟體動物疾病參考實驗室Isabelle Arzul教授惠贈的牡蠣包納米蟲DNA為模板，采用OIE發表的根據牡蠣包納米蟲核糖體DNA(rDNA)設計的特異性引物Bo：5’-CATTTAATTGGTCGGGCCGC-3’， Boas：5’-CTGATCGTC TTCGATCCCCC-3’，按照OIE推薦的反應條件進行聚合酶鏈反應，預期擴增片段長度為300bp[16]。PCR產物電泳后，采用Agarose Gel DNA Purification Kit(OMEGA)切膠回收目的條帶，并克隆到pGEM-T載體，轉化至大腸桿菌E.coliJM109感受態細胞。經藍白斑篩選、PCR鑒定獲得含有目的基因片段的重組質粒并純化，測濃度后-20 ℃保存備用。

1.2.1.2 引物設計 根據GenBank中包納米蟲基因組DNA序列AF262995.1的保守區域片段，利用焦磷酸測序檢測系統的自帶軟件設計引物。上游引物BoF：5’-CGCTGGTCCTGATCCTTTACT-3’；下游引物BoR：5’-Biotin-TACTAGCACCCCCAATTGTTTC-3’，產物長度為168 bp，測序引物BoS：5’-GAATGCATTAGCATGG-3’。引物由上海英維捷基生物技術有限公司合成。滅菌水稀釋引物為10μmol/L，分裝，-20 ℃保存備用。

1.2.1.3 焦磷酸測序——PCR擴增 以構建的包納米蟲陽性質粒為模板，以焦磷酸測序引物(BoF/BoR)進行PCR擴增。25 μL的PCR反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，10 μmol/L BoF 1 μL，10 μmol/L BoR 1 μL，5 U/μL rTaq 0.5 μL，質粒DNA1 μL，ddH2O補充至25 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增50個循環；最后72 ℃補充延伸5 min。擴增完畢取5 μL PCR產物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.1.4 單鏈模板制備及焦磷酸測序 取PCR產物10 μL加ddH2O補至50 μL，在產物中分別加入磁珠3 μL和結合緩沖液47 μL，常溫震蕩混勻10 min；打開真空泵，將真空預裝工具在超純水中清洗30 s后抓取磁珠，分別在70%乙醇、變性緩沖液、洗滌緩沖液中清洗5～10 s，將磁珠移至預先加入0.3 μmol/L測序引物BoS和退火緩沖液的PSQ96孔板中；將此PSQ 96板放在ThermoPlate上在80 ℃放置3 min，取出自然冷卻至室溫；設定測序程序及堿基投放順序和循環數，根據程序給定的劑量，在試劑艙中相應的孔中加入酶混合物、底物混合物以及4種堿基，將試劑艙和96孔測序板放入機箱進行測序反應。反應完畢，儀器自動給出測序結果，對測序結果進行在線Blast分析。

1.2.1.5 包納米蟲種類的確定 根據OIE手冊[16]，B.ostreae和B.exitiosa能被限制性內切酶HaeII酶切為115和189bp，B.roughleyi不能被酶切；B.ostreae被限制性內切酶BglI酶切為120和180bp，B.exitiosa和B.roughleyi不被酶切。對測得序列進行酶切位點分析，如果測得序列中同時含有HaeII和BglI兩個酶切位點，則可以判斷感染的包納米蟲種類為B.ostreae；如果測得序列中只含有HaeII酶切位點，不含有BglI酶切位點，則可以判斷感染的包納米蟲種類為B.exitiosa；如果測得序列中不含有HaeII和BglI兩個酶切位點，則可以判斷感染種類為B.roughleyi或其他非檢疫性包納米蟲。

1.2.2 DNA的提取 按照試劑盒DNeasy Blood and Tissue kit(QIAGEN)操作步驟提取荷蘭、法國以及陰性牡蠣鰓組織樣品的DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.3 焦磷酸測序方法檢測進口牡蠣樣品 以所建立的包納米蟲焦磷酸測序方法對荷蘭和法國進口牡蠣樣品進行檢測，同時設立陰陽性對照。

1.2.4 PCR-RFLP方法檢測進口牡蠣樣品 以OIE推薦的PCR-RFLP方法[16]對荷蘭和法國進口牡蠣樣品進行檢測，并比較焦磷酸測序方法和PCR-RFLP方法的檢測結果。

2 結果

2.1克隆及測序結果

將克隆的陽性質粒送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，結果經在線BLAST分析，與B.ostreae相關基因的序列一致性達100%、Bonamiasp.相關基因的序列一致性達99%。提取質粒，用核酸蛋白測定儀(NanoDrop ND-100)進行測定，拷貝數為1.13×1011拷貝/μL，-20 ℃保存備用。

2.2 包納米蟲焦磷酸測序方法的建立

(M：DL-2000 DNA Marker；1、2：B.ostreae陽性重組質粒的PCR擴增產物。M：DL-2000 DNA Marker；1、2：The PCR products ofB.ostreaerecombinant plasmid.)

圖1 重組質粒焦磷酸測序PCR擴增產物的電泳結果
Fig.1 The PCR products electrophoresis result of recombinant plasmid

圖2 重組質粒PCR產物的焦磷酸測序結果

以構建的包納米蟲陽性質粒為模板，以焦磷酸測序引物進行PCR擴增，擴增完畢以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果見圖1。取適量PCR產物按照焦磷酸測序的具體操作說明進行試驗，可很好的測得重組質粒PCR產物的序列，測序結果見圖2，測得的序列為：AATAATAAGACACGACTTCGGCGCCGCCT-CGGCGGTTGTTTT。將此序列在網上進行Balst比對分析結果見圖3，從圖中可以看出序列一致性在66%以上的均為包納米蟲的序列，而且與參照序列的一致性可達100%，因此可以通過此方法來確定樣品是否為包納米蟲感染。對測得序列進行酶切位點分析，該段測得序列中既含有BglI酶切位點，又含有HaeII酶切位點，由此可以判定感染種類為B.ostreae。

圖3 測得序列在線Blast分析結果

2.3 包納米蟲PCR-焦磷酸測序方法的樣品檢測結果

采用包納米蟲焦磷酸測序PCR方法對荷蘭和法國牡蠣樣品DNA進行擴增，并進行電泳檢測(見圖4，法國牡蠣未見擴增條帶電泳圖省略)。抽取有目的條帶的樣品和幾個沒有目的條帶的樣品進行焦磷酸測序試驗。有目的條帶的樣品測得序列均為：AATAATAAGACACGACTTCGGCGCCGCCTCGGCGGTTGT-TTT；而沒有目的條帶的樣品則沒有測到序列。經焦磷酸測序檢測，所檢樣品中有6個樣品有目的條帶，測序后進行酶切位點分析，可見測得序列中均含有BglI和HaeII兩個酶切位點，由此可判定6個樣品均為B.ostreae感染。

2.4 樣品的包納米蟲PCR-RFLP檢測結果

(1～12為12個荷蘭牡蠣樣品；M：DL-2000 DNA Marker；陽性：B.ostreaeDNA；陰性：無B.ostreae感染的牡蠣DNA。1～12:12 oysters from Netherlands；M：DL-2000 DNA Marker；Positive control:B.ostreaeDNA; Negative control: oyster DNA withoutB.ostreaeinfection.)

圖4 荷蘭牡蠣的焦磷酸測序PCR擴增產物電泳結果

Fig.4 The electrophoresis result of pyrosequencing PCR products of oysters from Netherlands

(1～12為12個荷蘭牡蠣樣品；M：DL-2000 DNA Marker；陽性：B.ostreaeDNA；陰性：無B.ostreae感染的牡蠣DNA；空白：雙蒸水。1～12:12 oysters from Netherlands; M：DL-2000 DNA Marker; Positive control:B.ostreaeDNA; Negative control: oyster DNA withoutB.ostreaeinfection; Blank control: ddH2O.)

圖5 荷蘭牡蠣的PCR產物電泳檢測結果

Fig.5 The electrophoresis result of PCR products of oysters from Netherland

經檢測，荷蘭牡蠣有6份樣品出現了300bp的陽性條帶(見圖5)，而法國牡蠣的17個樣品均未見預期大小的目的條帶(圖略)。6份出現目的條帶的荷蘭樣品PCR擴增產物分別用限制性內切酶BglI和HaeII進行酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳結果表明：目的基因的擴增產物可同時被限制性內切酶BglI和HaeII酶切，產生特異的酶切片段(見圖6)。根據OIE手冊中的描述[16]可將目的基因鑒定為B.ostreae，該檢測結果與焦磷酸測序結果一致，2種方法的樣品檢測結果均顯示4、5、6、7、8、9號樣品為牡蠣包納米蟲感染陽性。

(M：DL-2000 DNA Marker； 4B：4號樣品PCR產物的BglI酶切結果；4H：4號樣品PCR產物的HaeII酶切結果；5B：5號樣品PCR產物的BglI酶切結果；5H：5號樣品PCR產物的HaeII酶切結果；6B：6號樣品PCR產物的BglI酶切結果；6H：6號樣品PCR產物的HaeII酶切結果；7B：7號樣品PCR產物的BglI酶切結果；7H：7號樣品PCR產物的HaeII酶切結果；8B：8號樣品PCR產物的BglI酶切結果；8H：8號樣品PCR產物的HaeII酶切結果；9B：9號樣品PCR產物的BglI酶切結果；9H：9號樣品PCR產物的HaeII酶切結果。M: DL-2000 DNA Marker; 4B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.4; 4H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.4; 5B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.5; 5H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.5; 6B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.6; 6H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.6; 7B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.7; 7H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.7; 8B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.8; 8H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.8; 9B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.9; 9H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.9.)

圖6 4-9號荷蘭牡蠣樣品PCR擴增產物的酶切分析結果
Fig.6 The enzyme digestion result of PCR products of positive oysters from Netherlands

3 討論

Cochennec等[17]報道被牡蠣包納米蟲感染的牡蠣大部分表現正常，一般不出現臨床癥狀，但影響貝類的生長速度。我國是世界最大的水產貝類養殖國和出口國，雖然目前尚未報道有牡蠣包納米蟲病的發生，但其一旦發生，無法用藥物根除，在感染的前6年，會造成很高的流行率和死亡率，將會對我國的貝類養殖造成很大的經濟損失，而且我國對牡蠣包納米蟲的研究尚處于初級階段，存在著包納米蟲潛在入侵的極大風險。焦磷酸測序技術是近幾年來發展起來的一種能夠進行定量序列測定的新技術，其基本原理是通過PCR制備待測序DNA模板，其中PCR的一條引物用生物素標記。PCR產物和偶聯抗生物素蛋白的磁珠孵育，DNA雙鏈經堿性分開，純化得到含生物素標記引物的待測序單鏈，并和測序引物結合成雜交體，然后進行焦磷酸測序[18]。為做到防患于未然，本研究根據焦磷酸測序的原理，根據GenBank中包納米蟲的保守序列利用焦磷酸測序儀攜帶的引物設計軟件設計測序專用的PCR擴增引物(生物素標記)和測序引物，對樣品進行PCR擴增，然后對PCR產物進行單鏈分離、上機進行焦磷酸測序，結果顯示，測得序列為AATAATAAGA CACGACTTCG GCGCCGCCTC GGCGGTTGTT TT的42個堿基，網上Blast分析比對，序列一致性在66%以上的均為包納米蟲序列，可以確定這42個堿基為包納米蟲序列，因此可以此判斷是否為包納米蟲感染，進一步分析測得序列中是否含有BglI和HaeⅡ兩個酶切位點，根據OIE標準[16]可以區分包納米蟲的感染種類。因此，本研究首次建立了包納米蟲的PCR-焦磷酸測序檢測方法。

本研究采用新建立的包納米蟲PCR-焦磷酸測序檢測方法對溫州出入境檢驗檢疫局提供的荷蘭和法國進口牡蠣樣品進行包納米蟲檢測，同時輔以OIE推薦的PCR-RFLP方法檢測，檢測結束后對比2種方法的檢測結果。結果發現，2種方法均在荷蘭牡蠣中檢測到了包納米蟲感染，而法國牡蠣中未檢測到包納米蟲感染。焦磷酸測序方法通過對測得序列的酶切位點分析可以確定感染種類為牡蠣包納米蟲，同時PCR-RFLP方法也證實感染種類為牡蠣包納米蟲，2種方法的檢測結果一致。

綜上，本研究將焦磷酸測序原理應用到水產寄生蟲病的檢測研究中，建立了包納米蟲的PCR-焦磷酸測序檢測方法，并應用于口岸疫病的監測中，不但為水產寄生蟲的研究提供了一個新思路，而且為口岸疫病的高通量檢測提供了新技術,相信隨著不斷的研究與完善,焦磷酸測序技術的應用將會越來越廣泛,該方法的高通量和簡便快速將會為日益紛繁復雜的檢測業務提供很大幫助。

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DevelopmentandApplicationofPyrosequencingMethodDetectingBonamiaspp.CausedDiseaseofBivalves

WANG Cai-Xia1, WU Shao-Qiang1, LIN Xiang-Mei1, WANG Su-Hua2, FENG Chun-Yan1，XU Geng3

(1.The Institute of Animal Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China; 2.Wenzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Wenzhou 325027, China; 3. Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Yinan County of Shandong Province，Yinan 276300, China)

One pair of specific primers were designed and used to pyrosequencing the conserved region ofBonamiaDNA with PyroMark software basing on pyrosequencing platform andBonamiagene characteristics. PCR-pyrosequencing method was established with the recombinant plasmid ofBonamiaspp. constructed with OIE PCR method as the template. The obtained sequence can be identified as the sequence ofBonamiaspp. through Blast analysis, and enzyme digestion site analysis identified the specie asBonamiaspp..The imported oysters were detected with the newly developed method and PCR-RFLP as well as was recommended by OIE. The result showed that the developed PCR-pyrosequencing method can be used to correctly identifyingBonamiaspp. infection and species. The detection results were consistent with that yielded with OIE method. Therefore, this method can be applied to the detection and identification ofBonamiaspp. infection in port.

Oyster;Bonamiaspp.; PCR; pyrosequencing; detection; identification

S944

A

1672-5174(2017)12-053-06

責任編輯 朱寶象

10.16441/j.cnki.hdxb. 20160408

王彩霞， 吳紹強， 林祥梅, 等. 貝類包納米蟲病焦磷酸測序檢測方法的建立與應用[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2017, 47(12)： 53-58.

WANG Cai-Xia, WU Shao-Qiang, LIN Xiang-Mei, et al. Development and application of pyrosequencing method detectingBonamiaspp. caused disease of bivalves [J].Periodical of Ocean University of China, 2017,47(12)： 53-58.

國家科技支撐計劃項目(2013BAD12B02)資助

Supported by National Key Technologies R&D Program(2013BAD12B02)

2016-12-11；

2017-03-08

王彩霞(1982-)，女，助理研究員。E-mail：friday128@sina.com

** 通訊作者：E-mail：sqwu@sina.com