基于DNA條形碼技術對蒼南海域仔稚魚的物種鑒定*

李 淵， 張麗艷， 張 然， 宋普慶， 王良明， 張 立， 林龍山**

(1. 國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005； 2. 福建海洋研究所，福建 廈門 361013；3. 海洋赤潮災害立體監測技術與應用國家海洋局重點實驗室，上海 200137)

基于DNA條形碼技術對蒼南海域仔稚魚的物種鑒定*

李 淵1, 3， 張麗艷2， 張 然1， 宋普慶1， 王良明1， 張 立1， 林龍山1**

(1. 國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005； 2. 福建海洋研究所，福建 廈門 361013；3. 海洋赤潮災害立體監測技術與應用國家海洋局重點實驗室，上海 200137)

采用DNA條形碼技術對蒼南海域冬季采集的仔稚魚進行物種鑒定，以提高物種鑒定的準確性。所有仔稚魚通過形態特征鑒定出10個形態種，但經條形碼技術可鑒定出11個有效種。序列相似性結果顯示11個形態種中10種可鑒定到種的水平，1種無法匹配到相應的物種。條形碼間隙分析結果顯示各物種的最小種間遺傳距離均高于該物種的最大種內遺傳距離，存在明顯的條形碼間隙。由系統發育樹可以看出同一形態種的不同個體聚為一支系，各物種間能明顯區分開。同時結合本次漁業資源現場調查結果，發現11種仔稚魚中僅有5種的成魚出現在本次調查中，剩余6種為新出現種類?？梢?，DNA條形碼技術除了能提高仔稚魚物種鑒別的準確性外，還能對物種多樣性調查起到一定的補充作用。

DNA條形碼；生物多樣性；仔稚魚；序列相似性；條形碼間隙

作為魚類種群補充重要來源的魚類浮游生物主要是指魚類生活史早期發育階段，包括魚卵和仔稚魚[1]。魚類浮游生物的正確鑒定、分布和數量變化能更好地幫助我們了解魚類產卵場及早期的洄游路線，更有利于漁業資源的監測、管理和補充量及海洋保護區的建設[2-3]。魚類浮游生物的傳統鑒定方法比較粗放，主要依靠其外部形態特征，并不能全部鑒定到種的水平，特別是隱存種和新記錄種[4-5]；同時魚類浮游生物的形態特征復雜多變，而有的物種在發育期間變化較大，甚至存在變態發育，再加上鑒定者自身具備的知識參差不齊、主觀性較強及參考資料不全等因素，導致種類鑒定結果存在一定出入[6-8]。一種準確、快速、高效、穩定的鑒定方法就顯得十分必要。隨著DNA條形碼技術的提出，其在物種鑒定方面的優勢越來越明顯[9-11]，因為該技術突破了對經驗過度依賴和樣品完整性的局限，實現了樣品鑒定的標準化。一些學者嘗試用該技術來解決魚類浮游生物的物種鑒定和物種多樣性的調查[2-3, 7-8, 12-13]。

蒼南海域位于浙江省南端，是東海中部和南部的交界海域，屬中亞熱帶海洋性氣候區，初級生產力水平較高，物種豐富，是許多游泳動物的重要產卵場[14]。有關該海域的研究僅見于游泳動物生態位及種間的聯結性[14]，而有關魚類仔稚魚鑒定的研究尚屬空白。本研究利用DNA條形碼技術對采集于蒼南海域的仔稚魚進行種類鑒定，以明確仔稚魚種類與現場資源調查捕獲魚類種類的關系，為條形碼技術應用于魚類浮游生物種類鑒定提供參考，并探討該技術對物種多樣性調查的補充作用。

1 材料與方法

1.1樣品采集與鑒定

于2016年2月20日在浙江省蒼南海域進行底拖網調查，所有樣品低溫保存，帶回實驗室進行種類鑒定，在樣品分析時發現漁獲物中夾雜大量的仔稚魚，依據外部形態特征(體型、鰭條發育、體色等)對其進行初步分類，測量其體長，并進行標號，留待后續分子遺傳學研究。

為了進一步確定仔稚魚鑒定的準確性，本研究采用DNA條形碼技術對其做進一步的分析。對數量較多的形態種隨機選取10或15尾，數量較少的則全部用于后續的分子遺傳學研究，同時取在資源調查中出現過仔稚魚種類的成魚1尾和GenBank數據庫中的參考序列用于后續的物種鑒定(見表1)。

表1 蒼南調查海域仔稚魚種類鑒定信息及遺傳多樣性信息Table 1 Information and molecular indices of fish larvae identified in the investigated waters of Cangnan

1.2實驗方法

取仔稚魚和成魚適量肌肉組織，采用海洋動物組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，4℃保存備用。用于擴增COI片段的引物為[9]：F1：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′；R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。PCR反應體系為25 μL[11]：0.15 μLTaqDNA聚合酶，2.5 μL dNTP(2 mmol/L)，2 μL 10×Taq buffer(含Mg2+)，正反引物各1 μL(2 mmol/L)，DNA模板1 μL，其余dd H2O補足。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。以上反應均設陰性對照以排除DNA污染的情況。取3 μL PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(U=5 V/cm)，對符合測序濃度的PCR產物送生物公司進行純化和序列雙向測定。

1.3數據處理

對獲得的全部序列進行人工比對并輔以校正，截取有效、準確的目的片段用于后續分析。將所有序列在NCBI數據庫中進行BLAST序列相似性比對，采用兩兩序列間遺傳相似度>98%的為同一物種，92%～98%為同一屬，85%～92%為同一科的標準對蒼南海域的幼魚進行種類鑒定[2-3]，選取最佳匹配值(The best match)和種間最佳匹配值(Interspecific best match)(序列匹配百分數為數值)，選取2%為種間的遺傳分化界限，對所有比對結果劃分為三種模式[3, 15]：(Ⅰ)準確比對(Match to species)：最佳比對值(The best match)低于遺傳分化界限，最佳鄰接比對值(The nearest neighbor best match)高于遺傳分化界限，該模式下能鑒定到種；(Ⅱ)不確定比對(Uncertain match)：最佳比對值和最佳鄰接比對值均低于遺傳分化界限，該模式下鑒定到的種是不確定的或者錯誤的；(Ⅲ)無法比對(Unmatched)：最佳比對值和最佳鄰接比對值均高于遺傳分化界限，該模式下由于條形碼參考數據庫(Reference library)的限制導致物種無法鑒定?；贙2P模型利用Mega 4.0軟件計算各物種間的條形碼間隙(Barcoding gap)和構建鄰接關系樹[15-16]；利用Arlequin軟件計算各物種的單倍型數量和單倍型多樣度。

2 結果

2.1魚類種類組成

本次調查漁獲成魚種類36種，隸屬于9目16科29屬(附錄1)，其中鱸形目占絕對優勢，為17種，占總種類數的47.22%，其次是鯡形目和鰈形目分別為7種和6種，占19.44%和16.67%，其余各目種類數均為1種。在科級水平上，鰈形目的舌鰨科種類數最多，為6種，占總種類數的16.67%，其次為鳀科和蝦虎魚科種類，分別為5種，占13.89%。在屬級水平上，舌鰨屬的種類數最多，為6種，其余各屬分布較為平均。

附錄1：蒼南調查海域漁獲魚類名錄Appendix 1:List of fish in the investigated waters of Cangnan in Winter

圖1 蒼南調查海域漁獲魚類物種組成

除上述魚類外，尚有一定數量的仔稚魚存在，體長范圍在26.4～133.6 mm，依據其外部形態特征對其進行初步鑒定，分為10個形態種，其中數量最多的為鱸形目魚類(見表1)。

2.2 COI序列相似性比對

對所有88條仔稚魚的目的序列進行相似性比對發現，序列相似度在98%～100%之間的有85條，占總數的96.59%；相似性在92%～98%的有3條，占總數的3.41%；無相似性在85%～92%的序列。

每一個體的最佳匹配值和種間最佳匹配值之間的比較能更直接地反映比對的結果(見圖2)。以相似度98%作為同一物種的界限對所有個體進行分析，結果顯示有85個體屬于模式Ⅰ(96.59%)，能準確鑒定到種；有2個體屬于模式Ⅱ(2.27%)，屬于模糊種；有1個體屬于模式Ⅲ(1.14%)，無法匹配到種的水平。

由序列相似性比對結果可以看出(見表1)，只有鐮鯧、龍頭魚和六絲鈍尾蝦虎魚(小個體)的鑒定結果與形態鑒定結果一致；形態種棘頭梅童魚實際為大黃魚，綠鰭魚實際上為小眼綠鰭魚；鯛科魚類為二長棘犁齒鯛，鲉科魚類為褐菖鲉，髭鯛屬魚類為橫帶髭鯛，鮨科魚類為花鱸。模糊種(形態種食蟹豆齒鰻)與裸鰭蟲鰻(Muraenichthysgymnopterus，KX215178)的相似性為99%～100%，而與西里伯蛇鰻(Ophichthuscelebicus，KX215180)的相似性為99%。在形態特征上，裸鰭蟲鰻與西里伯蛇鰻二者最明顯的區別在于有無尾鰭，從本研究的樣品可以明顯觀察到尾鰭的存在，因此可以推斷該種為裸鰭蟲鰻。無法匹配種(形態種六絲鈍尾蝦虎魚大個體)相似性最高為85%，相似性最高的物種為鱷鲬(Cociellacrocodila，KP267636)，隸屬于鲉形目鲬科，依據遺傳相似性鑒定標準可以推斷該物種應屬于鲬科(Platycephalidae)。

經序列比對和種類整理發現，所有仔稚魚存在11個種(見表1)，隸屬于4目11科11屬，其中10個種能確定到種，1個未確定。鱸形目所占種類最多為6種，分屬于6科6屬，鲉形目包含3種，分屬于3科3屬，仙女魚目和鰻鱺目分別包含1種，分屬于1科1屬。11種仔稚魚中僅有5種的成魚在本次資源調查中出現，分別為大黃魚(Larimichthyscrocea)、褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)、花鱸(Lateolabraxmaculatus)、龍頭魚(Harpadonnehereus)和六絲鈍尾蝦虎魚(Amblychaeturichthyshexanema)，剩余6種為新出現種，分別為鐮鯧(Pampusechinogaster)、二長棘犁齒鯛(Evynniscardinalis)、橫帶髭鯛(Hapalogenysanalis)、小眼綠鰭魚(Chelidonichthysspinosus)、裸鰭蟲鰻和鲬科魚類。

(Ⅰ-鑒定到種；Ⅱ-模糊種；Ⅲ-無法匹配種。Ⅰ- match to species, Ⅱ- ambiguous species, Ⅲ- unmatched species.黑色線代表物種間分化的界限。Dotted lines correspond to 2% divergence threshold for species boundaries.)

圖2 每一個體最佳匹配值和種間最佳匹配值之間的比較
Fig.2 Best match compared with nearest neighbor (similarity percentage) for each specimen

2.3條形碼間隙和遺傳多樣性

基于K2P模型計算各種間的遺傳距離范圍為0.21～0.35，平均遺傳距離為0.26，明顯達到種的水平；各種內的遺傳距離均低于0.017(六絲鈍尾蝦虎魚)，符合種內界限。種內遺傳距離和種間遺傳距離基本符合“10乘法則”[17]。各物種的最小種間遺傳距離均高于該物種的最大種內遺傳距離，由圖3可以明顯看出種內和種間遺傳距離間存在條形碼間隙，不存在重疊，證實各物種的有效性。

(種間遺傳距離的最大值和最小值分別用上下橫杠進行表示，中間橫杠為中位值，藍線代表最大種內遺傳距離；紅線代表平均種內遺傳距離。Median interspecific distances with maximum and minimum values are represented by the upper and lower bars, respectively. Blue line: Maximum intraspecific distance; Red line: Mean intraspecific distance.)

圖3 基于K2P模型計算各物種的條形碼間隙

Fig.3 DNA barcoding gaps for all of the species based on the K2P model

剔除僅一個單倍型的4種魚類，計算剩余7種魚類的單倍型數量和單倍型多樣度(見表1)。六絲鈍尾蝦虎魚的單倍型數量最高；其次為鐮鯧、大黃魚和花鱸均為6；褐菖鲉、小眼綠鰭魚和龍頭魚的單倍型數分別為4、3和2。單倍型多樣度范圍為(0.250±0.180)～(0.867±0.067)，最高的為六絲鈍尾蝦虎魚，其次為大黃魚、花鱸和小眼綠鰭魚，鐮鯧和褐菖鲉的單倍型多樣度較接近，龍頭魚的最低。

2.4系統發育樹

基于11種仔稚魚COI單倍型、部分成魚序列和GenBank數據庫中的參考序列構建鄰接關系樹(見圖4)，可以看出大部分同一形態種的不同個體聚類到同一支系內，鲬科魚類SP. 明顯不同于六絲鈍尾蝦虎魚，獨自成為一支系。各物種間能明顯分開，形成獨立的11個支系，這一結果與各物種間的條形碼間隙結果相對應，表明各物種的有效性。各種類的照片同樣在圖4中給出，但是由于前期鑒定和樣品保存的原因，未對鲬科魚類SP. 的標本進行拍照，僅保留其肌肉樣品。

3 討論

專業分類學家的減少、隱存種和新種的不斷發現及參考資料的局限性導致了基于外部形態特征對物種進行鑒定往往存在一定的出入，而對仔稚魚鑒定的準確性更低，DNA條形碼技術的出現能在一定程度上很好地解決這一問題。本研究從序列相似性比較結果(見圖2)可以看出，模式Ⅰ下能準確鑒定到種，本次調查出現的仔稚魚大部分(96.59%)處于該模式下，如大黃魚、龍頭魚等。模式Ⅱ下的物種比對結果比較混亂，同一序列可能與多物種的相似性在98%以上，如六絲鈍尾蝦虎魚與矛尾蝦虎魚(Chaeturichthysstigmatias)(KC495071)、裸鰭蟲鰻與西里伯蛇鰻(KX215180)的相似性均在99%及以上，出現這種情況可能與漸滲雜交和系統分類有關[3, 18]。在本研究中漸滲雜交顯然不是造成這種情況的主要原因，更多的可能是與序列提交者分類鑒別水平和條形碼參考數據庫的準確性有關。模式Ⅲ下的物種難以找到與之高匹配的數據，如鲬科魚類SP.。不管上述哪種模式，要實現物種的準確鑒定，必須建立準確且高覆蓋度的參考序列數據庫。

(圖中- adult為仔稚魚的成魚序列。-adult represented the adult sequences of fish of larvae.)

利用平均種間遺傳距離判斷種內和種間的關系往往會造成一定的錯誤，但條形碼間隙可以有效的彌補這一缺陷，即比較最低種間遺傳距離和最高種內遺傳距離[15-16]。本研究的11種魚類各種間平均遺傳距離均高于0.2，種內平均遺傳距離均低于0.2，且各種間均能發現清晰的條形碼間隙，在系統發育樹上同樣可以看出各物種均各自聚為一支系，能將各種區分開，因此能保證各種的有效性和準確性。

片面的取樣、錯誤的種類鑒定及薄弱的分類學研究均會阻礙物種的鑒定和新物種的發現，影響調查區域內生物多樣性的評估[19]。本研究11種仔稚魚中有6個種的成魚在本次資源調查中未曾出現，進一步說明了仔稚魚研究的重要性，同時也可以看出DNA條形碼技術對物種多樣性調查在一定程度上有補充作用，能更真實地反映調查區域內的物種多樣性水平。

同樣，在仔稚魚的鑒定過程中不能因為調查中出現同屬成魚而將其武斷定種，如橫帶髭鯛和斜帶髭鯛，六絲鈍尾蝦虎魚和鲬科魚類SP.。對外形十分相似物種的鑒定更能考驗分類者的知識水平，在不能準確定種的情況下應將其鑒定到有把握的屬或科級水平，如大黃魚和棘頭梅童魚。應加強對經濟價值較低且常見物種樣品的采集和保存，以增加條形碼數據庫的有效數據，如食蟹豆齒鰻(僅有16S和12S片段，無COI片段)。浙江省多年以來開展大黃魚幼魚的增殖放流[20]，本次調查發現該海域中大黃魚有一定的產量，同樣在仔稚魚中也發現大量的大黃魚，表明增殖放流產生了一定的效果，應進一步加強大黃魚的保護和管理，不能松懈。鲬科魚類SP. 未發現與之相匹配的序列，由于仍有很多物種的COI基因序列尚未被報道，因此無法確認該種是屬于已報道而未發表相關序列信息的種類，還是屬于隱存種。因此對某些近緣種或外形相似的種類，要同時結合形態學、分子遺傳學和地理學才能對其分類地位進行更準確地定位[21]。

本研究依據形態特征對蒼南調查海域仔稚魚進行種類鑒定的準確率不足三成，表明研究者在仔稚魚形態鑒定方面的羸弱，更表明DNA條形碼技術的有效性。條形碼技術與傳統分類學相結合，不僅可提高物種鑒別的準確性，而且可以對生物多樣性調查起到一定的補充作用，是對生物多樣性進行高效、快速、可靠評估的新工具，但分類學家也不能過分依靠條形碼技術，仍要加強自身分類知識水平的積累。正確的形態鑒定提供準確的條形碼，準確的條形碼指導后續的物種鑒定，只有如此才能形成良好的物種鑒定循環，有助于今后的種類鑒定、隱存種的發現、多樣性調查及系統發育等研究。

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IdentificationofSeveralFishLarvaeBasedonDNABarcodingintheInvestigatedWatersofCangnan

LI Yuan1, 3, ZHANG Li-Yan2, ZHANG Ran1, SONG Pu-Qing1, WANG Liang-Ming1, ZHANG Li1, LIN Long-Shan1

(1. Third Institute of Oceanographgy, SOA, Xiamen 361005, China; 2. Fujian Institute of Oceanography, Xiamen 361013, China; 3. The Key Laboratory of Integrated Marine Monitoring and Applied Technologies for Harmful Algal Blooms, SOA, Shanghai 200137, China)

The investigated waters of Cangnan located in the south of Zhejiang province, where is an important spawning ground for many marine species. Fishery resources survey in this water was conducted by bottom trawling in the winter of 2016 and a large number of fish larvae were collected. To improve the accuracy of species identification, DNA barcoding based on COI gene was employed to identify fish larvae collected from the investigated waters. Ten morphospecies were identified based on morphological characteristics, while 11 species were identified by DNA barcoding analyses. After running blast searches in NCBI, a match of 98%～100% was found in 96. 59% of all individuals, a match of 92%～98% was 2. 27%, and 85%～92% was 1. 14%. Results of sequence similarity showed that ten of 11 species were identified to the species level, while one species was unmatched. There would be a clear overlap (barcoding gap) between intraspecific and interspecific variabilities in each species, as the smallest interspecific divergences were well below 2%, but the largest intraspecific divergences reached above 2%. Different individuals were clustered together, and different species could be unambiguously identified from NJ tree. Results noted above indicated that there were 11 valid species identified from this survey at last. Compared with the survey results of fishery resources, only five fish larvae species were identified with adult fish species found in this survey, and the six remaining species were new types. The COI barcoding diversity was found to be high, with the exception ofHarpadonnehereus(0. 250±0. 180). It was vital that some protective measures be taken immediately toH.nehereusbecause of low COI barcoding diversity. It is thus clean that DNA barcoding is an effective tool for accurate species identification, and also could play a supplementary role in the species diversity survey. All entire dataset in this study could play an important role in survey of biodiversity and genetic diversity of Cangnan, and all results could provide reference for fisheries management and formulating policy.

DNA barcoding; biodiversity; fish larvae; sequence similarity; barcoding gap

Q174;S917.4

A

1672-5174(2017)12-072-08

責任編輯 高 蓓

10.16441/j.cnki.hdxb. 20160343

李淵， 張麗艷， 張然, 等. 基于DNA條形碼技術對蒼南海域仔稚魚的物種鑒定[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2017, 47(12): 72-79.

LI Yuan, ZHANG Li-Yan, ZHANG Ran, et al. Identification of several fish larvae based on DNA barcoding in the investigated waters of Cangnan[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(12): 72-79.

海洋赤潮災害立體監測技術與應用國家海洋局重點實驗室開放基金項目(MATHAB201603)；雙邊國際事務合作—開展海峽兩岸合作與交流項目(2200207)資助

Supported by Open Research Fund Program of MATHAB, S.O.A (MATHAB201603)；Bilateral Cooperation on International Affairs—Cross-Strait Cooperation and Communication Program (2200207)

2016-10-09 ；

2016-12-14

李 淵(1985-)，男，博士生，主要從事海洋生態學研究。E-mail：liyuan@tio.org.cn

** 通訊作者：E-mail：linlsh@tio.org.cn