葡萄糖發酵生產ε-聚賴氨酸工藝優化

許永杰，張龍，潘龍，陳旭升，毛忠貴

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

葡萄糖發酵生產ε-聚賴氨酸工藝優化

許永杰，張龍，潘龍，陳旭升，毛忠貴*

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

為建立StreptomycesalbulusM-Z18以葡萄糖為碳源的ε-聚賴氨酸(ε-PL)高效發酵工藝，對葡萄糖和硫酸銨的流加方式和控制濃度、pH控制條件和溶氧控制水平進行了系統研究。研究結果表明，葡萄糖補料采用脈沖補料方式控制維持在10～30 g/L范圍，氨氮補料采用脈沖補料方式維持在0.1～0.5 g/L范圍，pH沖擊時間為9 h、恢復pH為3.85，發酵中后期最佳溶氧水平為20%左右為最優ε-PL發酵工藝控制條件。經過8天補料-分批發酵，實現ε-PL產量達到47.13 g/L，菌體量為57.08 g/L，相比于優化前，ε-PL產量和菌體量分別提高了27.34%和19.61%。上述研究結果為ε-PL工業化生產奠定了基礎。

ε-聚賴氨酸；鏈霉菌；補料方式；過程pH控制；溶氧水平

ε-聚賴氨酸(ε-poly-l-lysine，ε-PL)是由25～35個l-賴氨酸通過α-COOH和ε-NH2縮合形成的異形肽鍵連接而成。1997年，ε-PL首先由日本學者SHIMA和SAKAI從StreptomycesalbulusNBRC 14147的發酵液中發現[1-3]?；讦?PL具有抑菌譜廣、安全性高、效價高、熱穩定性好和不影響食品風味等特點，被廣泛應用于食品、醫藥、電子材料設計等領域[4-6]。目前，ε-PL最主要的用途是作為一種生物食品防腐劑。

ε-PL的生產主要采用鏈霉菌經液體好氧發酵的方式獲得。目前，提高ε-PL產量的研究主要關注產生菌改造、營養條件優化和發酵過程調控。最早SHIMA和SAKAI利用1株野生菌S.albulus在含有甘油、(NH4)2SO4以及酵母粉的培養基中發酵48 h得到產量為0.3 g/L的ε-PL。此后，大量的研究者不斷地對營養條件進行優化以期獲得更高的產量。自ε-PL發現后，幾乎所有的發酵生產都采用葡萄糖作為最適碳源。KAHAR等[7]根據S.albulusS410 在菌體生長和ε-PL合成過程中與pH的關系，建立了兩階段pH調控策略：第一階段控制在pH 5.0以上用于菌體生長，第二階段保持在pH 4.0左右用于ε-PL合成?；谠摬呗?，利用5 L攪拌式生物反應器補料-分批培養S.albulusS410發酵生產ε-PL產量從5.7 g/L提高到48.3 g/L。而CHEN等[8]以及BANKA和SINGHAL[9]發現，甘油是S.albulusM-Z18和S.nourseiNRRL 5126合成ε-PL的最適碳源；他們分別采用RSM(Response Surface Methodology)和EVOP(Evolutionary Operation)的方式對顯著影響ε-PL合成的營養組分進行優化，最終得到了最適的營養配比。CHEN[10]等在此基礎上，采用葡萄糖和甘油作為混合碳源發酵生產ε-PL，經過174 h補料-分批發酵，最終的ε-PL產量達到35.14 g/L。REN[11]等以甘油為碳源，提出一種新的發酵策略即pH沖擊發酵，經過8天補料-分批發酵使得ε-PL產量達到54.70 g/L。然而，根據鄭根成[12]的研究發現，葡萄糖為碳源生產的ε-PL聚合度分布范圍為20～34，主峰聚合度為30，較甘油獲得的樣品聚合度分布范圍較集中且最大聚合度更高。進一步的樣品抑菌實驗，表明葡萄糖為碳源生產的ε-PL樣品抑菌能力總體優于甘油生產的ε-PL樣品。因此，葡萄糖成為ε-PL發酵的最優碳源。然而，葡萄糖相比于甘油發酵，其ε-PL產量明顯低于甘油，所以有必要對葡萄糖發酵生產ε-PL工藝進行優化，以期達到工業化生產的要求。

本研究以葡萄糖作為碳源，pH控制方法采用pH沖擊策略，研究了碳源和氮源流加方式和控制濃度對ε-PL發酵的影響，并對ε-PL發酵工藝中的過程pH控制策略及發酵中后期溶氧維持水平進行了優化，確定了最佳的葡萄糖發酵生產ε-PL工藝，為實現工業化生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株

S.albulusM-Z18保藏于本實驗室中。

1.1.2 種子培養基(g/L)

葡萄糖 50，酵母膏 5，(NH4)2SO410，KH2PO41.36，K2HPO40.8，MgSO4·7H2O 0.5， FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8。

1.1.3 發酵培養基(g/L)

葡萄糖 60，酵母膏 10，(NH4)2SO410，KH2PO44，MgSO4·7H2O 0.8，FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.8。

1.2方法

1.2.1 種子培養方法

用無菌的接種環將1環孢子接種到裝有80 mL 種子培養基的500 mL三角瓶中，將其置于搖床中30 ℃，200 r/min，培養24 h作為種子液。

1.2.2 發酵罐發酵方法

采用5 L攪拌式發酵罐進行發酵實驗。裝液量3.5 L，通氣量0.5 vvm，攪拌轉速200～900 r/min，接種量8%(v/v)。pH控制方法(pH沖擊工藝)：通過外源流加氨水(12.5%，w/v)的方式，將初始pH調為pH 6.8，當pH自pH 6.8降至pH 5.0時開始自動控制pH穩定在5.0，維持8 h，隨后不控制pH并維持12 h，沖擊結束后迅速調至pH 3.95直至發酵結束。溶氧控制方法：在降為pH 4.0以前，溶氧(DO)控制在30%以上；當降為pH 4.0后，DO控制在20%以上。

1.2.3 葡萄糖流加方式

葡萄糖脈沖補料方法是當發酵液中葡萄糖質量濃度低于10 g/L時，開始流加900 g/L的葡萄糖溶液，使其質量濃度達到20 g/L(或者30 g/L、40 g/L)，以此循環直至144 h發酵結束。葡萄糖恒速補料方法是當發酵液中葡萄糖質量濃度低于10 g/L時，以恒定的補糖速率2.5 g/(L·h)[或者3 g/(L·h)、3.5 g/(L·h)]流加葡萄糖溶液，保持補糖速率不變至144 h發酵結束。葡萄糖變速補料方法是當發酵液中葡萄糖質量濃度低于10 g/L時，根據葡萄糖的消耗速率設定補料速率，維持葡萄糖質量濃度在10 g/L左右至144 h發酵結束。

1.2.4 硫酸銨流加方式

0.5 g/L氨氮質量濃度脈沖補料方法是當發酵液中氨氮質量濃度低于0.5 g/L時，開始流加375 g/L硫酸銨溶液使其達到0.5 g/L，以此循環直至192 h發酵結束。硫酸銨變速補料方法是當發酵液中氨氮質量濃度低于0.5 g/L時，根據氨氮的消耗速率設定補料速率，維持氨氮質量濃度在0.1～0.5 g/L至192 h發酵結束。

1.2.5 pH控制策略優化

將初始pH調為6.8，當pH自6.8降至5.0時開始自動控制pH， pH 5.0 維持8 h，隨后不控制pH，保持9 h或12 h，沖擊結束后將pH迅速調至3.85或3.75直至192 h發酵結束。

1.2.6 pH沖擊發酵過程溶氧控制方法

pH在降至4.0之前通過調節轉速將溶氧控制在30%左右，隨后保持轉速和通氣量不變。在沖擊結束后，當溶氧降至20%或10%，此時將溶氧和轉速聯動自動維持溶氧水平穩定在20%或10%，直至192 h發酵結束。

1.2.7 分析方法

菌體干重(DCW)測定方法：取10 mL發酵液，經過4 500×g離心10 min后，取出上清液；下層菌體沉淀用去離子水洗滌2次后，經預先稱重的濾紙過濾后，105 ℃烘干至恒重后用于測量。ε-PL產量測定方法：取離心上清液后參照ITZHAKI的方法進行測定[13]。銨態氮濃度：采用奈斯勒試劑，通過比色法測定[14]。葡萄糖濃度的測定采用HPLC系統(U-3000,Dionex,CA)，配備示差檢測器(Shodex RI-101,Tokyo,Japan)和離子交換柱(Aminex HPX-87H,300 mm×7.8 mm,Hercules,CA)。操作條件：柱溫60℃，流動相5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min。

2 結果與分析

2.1葡萄糖流加方式對ε-PL補料-分批發酵的影響

在補料-分批發酵過程中，碳源的流加方式對發酵有著重要影響。一方面碳源匱乏會導致細胞無法獲得營養而不能生長繁殖以及合成目標代謝產物；另一方面碳源濃度過高會限制菌體細胞的生長和過量代謝產生副產物[15]。因此有必要對葡萄糖流加方式進行優化。KAHAR等[7]在研究ε-PL發酵過程不同葡萄糖維持質量濃度(10、20、40 g/L)對發酵的影響時發現，當維持質量濃度在10 g/L左右時有利于發酵，所以脈沖補料的葡萄糖補料范圍最低為10 g/L。在考察葡萄糖脈沖補料方式對發酵的影響時，為了縮短發酵時間，本實驗采用144 h進行發酵并將脈沖糖濃度范圍分別控制在10～20 g/L、10～30 g/L和10～40 g/L。3個脈沖質量濃度的葡萄糖補料起始時間幾乎相同，但隨著發酵的進行，不同的脈沖濃度對于發酵的影響是不同的。從表1可以看出，當脈沖質量濃度維持在合適水平是有利于發酵的，而脈沖濃度過高則嚴重影響菌體合成產物。10～30 g/L的脈沖質量濃度最有利于發酵，其產量最高。

表1 不同葡萄糖流加方式對ε-PL發酵的影響

在脈沖補料的基礎上，選取2.5 g/(L·h)、3.0 g/(L·h)和3.5 g/(L·h)作為恒定補糖速率。在ε-PL發酵過程中，菌體在各階段的葡萄糖消耗速率是不同的，因此如果出現葡萄糖補料過慢或者過快，體系中會出現糖消耗殆盡或者糖逐漸增加的過程。而葡萄糖缺乏或者糖濃度過高都不利于發酵產物的合成。當恒定補糖速率為2.5 g/(L·h)時發酵會出現長時間的缺糖狀態，菌體活性受到極大影響，最終產量只有9.67 g/L。當恒定補糖速率進一步提高至3.0 g/(L·h)時，發酵缺糖時間相對縮短，對于發酵的不利影響也相對減弱，因此最終產量相比于2.5 g/(L·h)的補糖速率提高顯著，產量達到21.08 g/L。而恒定補糖速率為3.5 g/(L·h)時，發酵過程中基本上不出現糖耗完的狀態，能夠滿足發酵中對葡萄糖的需求，但是后期由于菌體活力的降低，葡萄糖消耗速率減慢，這就會出現葡萄糖的積累，也會對發酵造成不利影響，雖然產量進一步提高，但是也僅為24.89 g/L。

考慮到發酵過程中由于菌體活力的變化會造成葡萄糖的消耗速率改變，因此考察葡萄糖變速補料對發酵的影響，即根據葡萄糖的消耗速率不斷改變其補料速率，而且避免出現葡萄糖耗盡現象，最終實現ε-PL發酵產量為28.67 g/L，菌體量達到50.50 g/L。綜合以上所有結果發現，葡萄糖在10～30 g/L質量濃度范圍的脈沖補料最有利于發酵，因此在接下來的優化實驗中采取此種補料方式。

2.2氨氮維持濃度及硫酸銨流加方式對ε-PL補料-分批發酵的影響

在補料-分批發酵過程中，發酵至約72 h時氨氮質量濃度一般會降低至0.5 g/L以下。為了保證ε-PL持續快速的合成，通常采用流加高濃度硫酸銨溶液來保證氨氮維持在一定濃度范圍，以保障菌體生長和產物合成需求。然而，在發酵中后期補加硫酸銨時，往往會發現溶氧水平會持續上升，這說明補加硫酸銨會對細胞活力產生影響，進而可能會影響菌體生長和產物合成。馮寧[16]等在研究氮源及其補料策略對L-纈氨酸發酵影響時，也發現高濃度的氮源會對菌體生長產生抑制作用。由此可以看出，發酵過程中維持適宜的氮源濃度可以提高發酵強度。從圖1可以看出，當氨氮質量濃度范圍維持在0.5～1 g/L時，發酵后期其溶氧水平遠高于0.1～0.5 g/L的氨氮質量濃度范圍，這說明前者菌體活力是低于后者的。最終表現為氨氮質量濃度為0.1～0.5 g/L范圍時，發酵的菌體量和產量更高。造成這種發酵差異的原因是如果發酵過程中要保持較高的氨氮質量濃度范圍即0.5～1 g/L，需要補加硫酸銨的次數增加，對菌體的生長造成較大傷害，直接表現是菌體提前進入衰亡期。同時過高的氨氮濃度是遠遠超過的菌體生長和產物合成的需要。因此0.1～0.5g/L的氨氮質量濃度范圍更有利于發酵。

圖1 氨氮質量濃度為0.5～1 g/L(A)和0.1～0.5 g/L(B)時的ε-PL補料-分批發酵過程參數Fig.1 Comparison of the parameters of pH shock fed-batch fermentation with 0.5～1 g/L(A) and 0.1～0.5 g/L(B) of ammonia nitrogen

當確定較低氨氮質量濃度范圍0.1～0.5 g/L更有利于菌體的生長和產物的合成時，進一步優化了硫酸銨的補加方式。ε-PL發酵過程中氨氮的消耗速率存在如下規律：在產物快速合成期，氨氮消耗快，而在后期菌體活力衰退時，氨氮消耗變慢。如果硫酸銨的流加速率保持恒定，其設定值過高或過低，會造成氨氮過量積累或者匱乏，進而引起發酵的不穩定，因此不考慮采用恒速補料方式。由表2可知，兩種補料方式最終的發酵結果相差不大，脈沖補料略優于變速補料，前者產量略高于后者。因此ε-PL發酵過程中氨氮質量濃度開始低于0.5 g/L時流加硫酸銨后應盡量保持氨氮質量濃度范圍在0.1～0.5 g/L，既保證了氨氮不會匱乏，也避免了氨氮質量濃度過高帶來的不利影響，在硫酸銨的補料方式上可以選擇0.5 g/L氨氮質量濃度脈沖補料。

表2 硫酸銨流加方式對ε-PL發酵的影響

2.3pH控制策略對ε-PL補料-分批發酵的影響

利用pH沖擊策略發酵生產ε-PL時，沖擊時間和沖擊后恢復pH是兩個關鍵參數。因此，考察pH沖擊時間和恢復pH對于發酵產量影響至關重要。從表3可以看出，pH沖擊時間過短或過長對產物的合成均不利。當pH沖擊時間過短時，菌體恢復至正常狀態所需的時間更短，但后期菌體活力喪失的更快，所以pH沖擊6 h時產量和菌體量均最低。而比較pH沖擊9 h和沖擊12 h發現，前者更有利于發酵。因此9 h為最佳沖擊時間。

從發酵結果來看，改變沖擊后恢復pH對發酵結果影響顯著。當恢復pH3.95時，發酵后期菌體增長非?？?，以至于最終菌體干重達到65.83 g/L；而當恢復pH為3.85時，后期菌體增長相比于pH 3.95較為緩慢，最終菌體干重為47.72g/L，但是這并沒有影響產物的合成。顯然菌體的大量增長會消耗更多的葡萄糖，因此降低恢復pH是有效控制菌體量的方法。然而，當繼續降低恢復pH至3.75時，發現最終ε-PL產量大大降低，僅為30.2g/L。這表明此pH條件下不利于菌體的生長和合成，以至于影響了最終ε-PL產量。因此，pH3.85為最佳恢復pH值。

表3 pH控制策略對ε-PL補料-分批發酵的影響

2.4溶氧控制對ε-PL補料-分批發酵的影響

在pH沖擊發酵過程中溶氧變化可以分為3個階段：第一階段是沖擊前的菌體生長階段，此階段往往采取的策略是將溶氧控制在30%以上，以維持菌體的快速合成；第二階段是pH沖擊過程低pH帶來的高溶氧狀態，這一狀態直接表明此時菌體處于較低的活力狀態；第三階段是菌體恢復之后的菌體生長和產物合成階段。從發酵時間來看，前面兩個階段持續55 h，第三階段持續約137 h。從產物合成來看，前兩個階段主要是用于菌體生長，只合成少量產物；而第三個階段既會有菌體增長，也會伴隨著大量產物的合成。因此，pH沖擊結束后調節溶氧水平對于發酵結果有著重要影響。

由圖2可以發現，pH沖擊結束后溶氧水平對產物的合成以及菌體生長有顯著影響，溶氧過高或者過低均不利于發酵。在對照實驗中即不通過轉速控制溶氧時，pH沖擊結束后溶氧平均水平在30%，發酵8天后菌體量為47.72 g/L，產量達到37.26 g/L。當pH沖擊結束，將溶氧水平控制在10%左右時，其發酵產量最低僅為35 g/L。從轉速變化趨勢來看，后期菌體活力呈現不斷降低的趨勢。而當溶氧水平控制在20%左右時，其菌體量和產量都達到最高，分別為44.8 g/L和57.8 g/L。因此，在pH沖擊發酵后期，通過調節轉速控制溶氧在20%左右時，能促進產物合成和菌體生長，比不控制溶氧或者溶氧較低時更有利于發酵。

圖3 未優化前(A)與最優條件下(B)pH沖擊補料-分批發酵Fig.3 The fermentation of pH shock fed-batch pH shock fed-batch before optimization(A)and under optimal conditions(B)of S.albulus M-Z18

2.5最優條件下ε-PL補料-分批發酵

在使用葡萄糖為碳源發酵時，通過對碳源和氮源流加方式的優化以及發酵工藝參數的優化，得出最佳發酵條件，需進一步探究優化前后發酵參數的變化情況。在最優條件下，發酵8天后ε-PL產量為47.13 g/L，菌體量為57.08 g/L。相比于以葡萄糖為碳源未優化前發酵，產量提高了27.34%，菌體量增長了19.61%。這說明，通過對碳源和氮源流加方式及發酵工藝的優化能夠顯著的促進菌體增長和ε-PL合成。

3 結論

本研究以葡萄糖為發酵碳源，在此基礎上對葡萄糖的流加方式，氨氮質量濃度維持范圍和流加方式，及發酵工藝參數優化進行優化，能使得ε-PL發酵產量相比于未優化時有了極大的提高。最優條件是葡萄糖補料方式為10～30 g/L質量濃度范圍的脈沖補料，氨氮補料方式是0.5g/L氨氮質量濃度脈沖補料，并保持氨氮質量濃度范圍在0.1～0.5 g/L。而pH沖擊發酵最佳pH沖擊時間為9 h，最佳恢復pH為3.85，pH沖擊結束后最佳溶氧水平為20%。在最優條件下進行補料分批發酵實驗，8天后產量為47.13 g/L，菌體量為57.08 g/L，相比于未優化前發酵，產量提高了27.34%，菌體量增長了19.61%。這為進一步ε-PL工業化生產奠定了基礎。

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Optimizationofε-poly-L-lysineproductionwithglucoseascarbonsourcebyStreptomycesalbulusM-Z18

XU Yong-jie,ZHANG Long,PAN Long,CHEN Xu-sheng,MAO Zhong-gui*

(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

To develop an efficient ε-poly-L-lysine(ε-PL)fermentation process ofStreptomycesalbulusM-Z18 with glucose as carbon source, feeding approaches and concentrations of glucose and ammonium sulfate, pH control strategy and the level of dissolved oxygen were investigated systematically in this study. The optimal conditions of ε-PL fermentation were established as following: the concentrations of glucose and ammonia nitrogen were maintained in the range of 10-30 g/L and 0.1-0.5 g/L by pulse feeding mode, respectively; the pH shock time was lasted 9 h and the recovery pH was set to 3.85; and the optimal dissolved oxygen level in the middle and later stage of fermentation was about 20%. After 8 days of fed-batch fermentation, the ε-PL production and biomass reached 47.13 g/L and 57.08 g/L, respectively. Compared with those of the non-optimized fermentation, the ε-PL production was increased by 27.34% and the biomass was enhanced by 19.61%. Obviously, the results of this study laid the foundation for the industrial production of ε-PL.

ε-poly-L-lysine;Streptomyces;feeding approaches;process pH control;dissolved oxygen level

碩士研究生(毛忠貴教授為通訊作者，E-mail:maozg@jiangnan.edu.cn)。

江蘇省產學研合作前瞻性聯合研究項目 (BY2016022-25)

2017-02-16，改回日期：2017-03-15

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014073